Målet med denne artikel er at vise en metode til at optimere immunofluorescent påvisning af østrogen-receptor-α (ERα) i rotte pial arterielle skiver ved hjælp af en digital immunofluorescent mikroskop.
Mange af østrogen har indvirkning på vaskulære reaktivitet er medieret gennem interaktion med østrogen receptorer 1, 2, 3. Selvom to sub-typer, der findes (østrogen receptor-α og β), er østrogen-receptor-α blevet identificeret i både den glatte muskulatur og i endotelceller af pial arterielle segmenter ved hjælp fluorescensfarvede kombineret med konfokal laser scanning mikroskopi 4. Desuden er ER-α placeret i kerner og i cytoplasma af rotte basilaris arterier 5. Receptorerne er rigelige og fluorescerer dejligt, men klar visualisering af diskrete grupper af receptorer er vanskelig sandsynligt på grund af numrene ligger i mange cellelag i pial skibssegmenter. Derudover er der mange rapporter ved hjælp af immunhistokemiske teknikker parret med konfokal mikroskopi dårligt detaljer kravene kritisk for reproduktion af eksperimenter 6. Vores formål med denne artikel er at beskrive en simpel teknik til at optimere than farvning og visualisering af ER-α ved hjælp af tværgående skiver af pial arterioler indhente fra kvindelige rotte hjerner. Vi først perfuse rotter med Evans blå farvestof til nemt at identificere overfladen pial arterierne, som vi isolerer under et dissektionsmikroskop. Brug af et kryostat at skære 8 μm tværsnit af arterierne giver os mulighed for at få tynd fartøj sektioner, således at forskellige fartøj planer er mere tydeligt visualiseres. På tværs skibet frem for at bruge et lille fartøj segment har den fordel, lettere visning af endotel og glatte muskulatur lag. Hertil kommer, brug af en digital immunofluorescent mikroskop med udvidet dybde software giver klare billeder af 10-12 forskellige fartøj fly og er mindre omkostningskrævende end brugen af en konfokal laser scanning mikroskop.
Tidligere viste vi, at efter forbigående global iskæmisk hjerneskade de pial arterie evne til at ændre diameter som reaktion på begge vasodilatorer 7, 8 og vasokonstriktorer 9 er markant deprimeret hos unge ovariectomized rotter. Kronisk østrogen Mætning genskaber vasomotoriske reaktioner 7-9. Desuden forsinkede østrogen vender de gavnlige virkninger af østrogen på pial pulsåre vasodilaterende kapacitet 10 fører os til spørgsmålet om, hvorvidt langsigtede østrogen nedbrydning påvirker ER-α tæthed i cerebrovasculature. Vi har planlagt at bruge immunofluorescent mærkning kombineret med western blotting til at vurdere ændringer i ER-α udtryk i reaktion på kronisk østrogen udtynding. Fordi vi havde nogle problemer med visualisering af diskrete grupper af receptorer vi ændrede den metode, som vi viser her. Derfor er vores primære mål i denne undersøgelse var først at udvikle en relativ simpel metode til at optimere den visuelleization af receptorer i pial arterioler. Efter aftale med flere rapporter, 6,11,12 vi fandt det nødvendigt at foretage justeringer for den type væv vi var sondering, prøve tykkelse, fordelingen af ER-α i skibet, samt graden af ikke-specifik binding .
Vores metode er meget effektiv til at visualisere tilstedeværelsen af ER-α i pial fartøj skiver. Men som andre tidligere har påpeget den vellykkede brug af disse metoder er meget afhængig af specificitet og koncentrationer af antistoffer, subcellulære placering af proteiner af interesse, fiksering og blokering protokoller og væv håndtering 12. Forud for visualisering af vores fartøj præparater brugte vi tid til at finde ud af alle disse variabler. Vi har fremhævet, hvordan vi havde brug for at justere nogle af vores tilgang i dette papir.
Vi satte ud for at optimalt visualisere ER-α i pial arterioler og dette præsenteres et par udfordringer.Først, den gennemsnitlige størrelse af en rotte pial arterie er mellem 35-50 μm gør isolation og fjernelse fra hjernen overfladen lidt tricky. Vi fandt, at perfusion med Evans blå farvestof forud for ofre gør dissektion af arterierne lettere. Evan er blå kan påvirke fluorescens, men vi føler, at fordelen ved at bruge denne farve opvejer dets mindre ulemper. I vores protokol skibene er vasket flere gange. Dette minimerer den resterende farvestof i karrene og reducerer de mulige virkninger af farvestoffet på fluorescens. Et andet problem vi mødte var, at tykkelsen af pial skibssegmenter gjort det klart, visualisering af receptorer vanskelig. Derudover kunne vi ikke skaffe særligt tydelige billeder skyldes formentlig det faktum, at ER-α blev spredt rundt flere cellelag. Vi forsøgte at arbejde med langsgående fartøj skiver (som andre har), men på grund af de små pial størrelse var det vanskeligt at håndtere de fartøjer og forhindre vrid i skibe, mens monteringpå lysbilleder selv ved hjælp af et mikroskop. Endelig har vi med succes ændret vores teknik ved hjælp af en kryostat og mindsker skibets tværs kloge i til 8 μm tykke ringe. Ringene er nemmere at håndtere, og flere kan monteres på et dias.
Når vi købte de skibe, vi følte det nødvendigt at teste effektiviteten af første flash fryse vævet så om fastsættelse af fartøjer som foreslået af Danseshatalb og associerede virksomheder 11. Selv om vi fandt en anelse mindre baggrund immunfluorescens, vi bemærkede også, at de receptorer farvede mindre intenst gøre visualisering af receptorer vanskeligere. Derfor foretrækker vi først at fryse hele hjernen og gemme indtil de skal bruges (normalt mellem 1-2 måneder). Vi så pull off skibene, som beskrevet og løse de fartøjer, før udskæring med kryostat. som vi viser her.
Et nødvendigt skridt er at køre kontrol med både den primære og den sekundære antistof særskilttil at bestemme specificitet og baggrund immunofluorescens. Østrogen receptor-α-antistoffer kan være svært at arbejde med. Faktisk forsøgte vi 3 forskellige primære antistoffer (1 monoklonale og 2 polyklonalt), før vi var tilfredse med den succes, vores receptor farvning. Som en del af vores kontrol, vi først undersøgt specificiteten af det primære antistof ved undladelse af tilsætning af det primære antistof. Figur 2D viser fartøjet uden primær antistof. Der er ingen pletter og lidt baggrund signal. Da den primære antistof er polyklonale, der er en vis diffus non-specifik baggrund farvning. For det andet, vi tilføjet det primære antistof, men ikke det sekundære antistof (fig. 2E). Man kan se en pæn margen repræsenterer autofluoresence langs endotel grænser fartøjer. Dette er i overensstemmelse med det arbejde, som Dan og associerede virksomheder 5. Men hverken de små punkter i immunfluorescens, der repræsenterer ER-α, eller kornet udseende reflecting tilstedeværelsen af mange receptorer kan opdages uden en kombination af både den primære og sekundære antistoffer. Vi bemærkede et klart mønster med autofluoresence langs endotel udkanten af fartøjer. Disse uafhængige tests for antistoffer specificitet er vigtige som de bekræfter specificiteten af antistoffet til ER-α og den sekundære antistof binder sig til den primære.
Som konklusion, som det fremgår af andre 4 5 hjernens blodkar indeholder mange ER-α sub-type receptorer. I vores hænder, øger forberede 8μm tværsnitsareal skiver fra isolerede pial arterier farvning og visualisering af receptorer. Traditionelle metoder bruger konfokal mikroskopi til at undersøge prøver. Har kapacitet til at se seriel optisk sektioner fra tykke prøver er en vigtig fordel ved konfokal mikroskopi. Dog kan købe en god konfokal mikroskop blive meget dyrt. Ved at bruge Extended Dybde (EDF) software, fandt vi, atkunne reducere vores udgifter til udstyr. Ved hjælp af en fluorescerende mikroskop med EDF vi fået klare billeder, og er i stand til at visualisere pial arterielle ER-α på forskellige niveauer ved hjælp af Z-stakke. En væsentlig fordel ved EUF software er, at den tillader billedoptagelse på en måde til effektivt at skabe en 3-D billede fra billederne. Til laboratorier, der ikke har adgang til en konfokal mikroskop eller midlerne til at købe en en digital fluorescerende mikroskop med tilegnet software kan være en praktisk og billigere løsning, afhængigt af målene for investigator.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet for dette projekt blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health R01-NR5339 og den uniformerede University of the Health Sciences-R061LD.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
EVANS BLUE | Sigma | E-2129 |
PBS 10X | Sigma | P-5493 |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 |
Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 |
Triton X-100 | Sigma | T9284 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 |
ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz | H-184 |
Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 |
Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI |
Vector Lab | H-1200 |