使用数字免疫荧光显微镜对大鼠软脑膜小动脉中雌激素受体-α的成像

摘要

本文的目的是展示一种利用数字免疫荧光显微镜优化大鼠软脑膜动脉切片中雌激素受体-α（ERα）免疫荧光检测的方法。

摘要

雌激素对血管反应性的许多作用是通过与雌激素受体相互作用介导的^{1, 2, 3}。尽管存在两种亚型（雌激素受体-α和β），但利用荧光染色结合共聚焦激光扫描显微镜技术，已在软脑膜动脉节段的平滑肌细胞和内皮细胞中鉴定出雌激素受体-α⁴。此外，在大鼠基底动脉的细胞核和细胞质中也发现了ER-α⁵。这些受体数量丰富且荧光信号强，但由于其分布于软脑膜血管节段的多层细胞中，因此难以清晰观察到成簇的受体群。此外，许多采用免疫组织化学技术结合共聚焦显微镜的研究未能详细说明实验可重复所需的关键条件⁶。本文旨在描述一种简单技术，以优化从雌性大鼠脑组织中获取的软脑膜小动脉横切片上ER-α的染色与可视化效果。我们首先用伊文思蓝染料灌注大鼠，以便在解剖显微镜下易于识别脑表面的软脑膜动脉并进行分离。使用冷冻切片机将动脉切成8 μm的横截面，可获得较薄的血管切片，从而更清晰地观察不同层面的血管结构。与使用小段血管相比，横切血管的方式更有利于观察内皮层和平滑肌层。此外，使用配备扩展景深软件的数字免疫荧光显微镜，可清晰呈现十个至十二个不同血管层面的图像，且成本低于共聚焦激光扫描显微镜。

方案

1. 软脑膜动脉的分离与制备

1. 在大鼠麻醉状态下，插入并固定导管至动脉，用含1%伊文思蓝的1×PBS灌注。伊文思蓝染料可使软脑膜血管着色良好，便于分离。
2. 取出脑组织，于-70°C保存备用。最佳情况下，脑组织保存时间不应超过2个月。
3. 在解剖显微镜下，从脑表面分离软脑膜小动脉（平均直径35–50 μm）。使用尖头镊子仔细从大脑皮层的背侧和外侧表面剥离所有被蓝色染色的小动脉。在放入固定液前，去除附着的多余皮层组织。
4. 将收获的小动脉置于含2%冷多聚甲醛的0.1 M PBS中固定30分钟。
5. 为准备切片，将包埋介质倾倒于冷冻台/持样头（设定为-20°C）上。
6. 将小动脉切段平放于持样头上，待其冻结。将血管牢固地直立放置于恒冷箱切片机的冷冻台包埋介质上，动脉尖端朝向操作者。用镊子夹持直至完全冻结。
7. 将带有血管的冷冻台放入恒冷箱切片机头部，用恒冷箱切片机切割8 μm厚的软脑膜小动脉环。
8. 将小动脉切片贴附于铬-钾-明胶处理的载玻片上。
9. 将制备好的载玻片置于玻片盒中，于4°C冰箱内过夜保存。

2. ER-α 免疫荧光染色

第1天

1. 从冰箱中取出载玻片；将其恢复至室温。
2. 清洗载玻片时，加入 1–1.5 ml 0.1 M PBS（足以覆盖所有组织切片），静置 10 分钟，倾去液体，重复此步骤两次。载玻片每一边缘均用疏水性标记笔标记，因此液体可保留在载玻片表面。每次清洗时均倾去旧液并更换新鲜的 0.1 M PBS。
3. 将载玻片在 1 ml 50 mM 氯化铵溶液中室温孵育 30 分钟，以降低内源性荧光。
4. 按照步骤 2.2 所述方法，用 0.1 M PBS 清洗载玻片，每次 10 分钟，共清洗 3 次。
5. 用含 0.1% Triton-X 100 和 1% 正常山羊血清（NGS）的 PBS 封闭载玻片，室温孵育 30 分钟，以减少非特异性结合。
6. 加入一抗（兔多克隆抗 ER-α 抗体；1:500 稀释）溶于 PBS + 0.1% Triton-X + 1% NGS 中，4°C 过夜孵育。

第2天

7. 从冰箱中取出载玻片；将其恢复至室温。
8. 用 0.1 M PBS 洗涤载玻片，每次 10 分钟，共洗 3 次，操作同 2.2 节所述。
9. 在避光条件下，室温孵育 Oregon Green 488 标记的羊抗兔二抗（溶于含 1% NGS 和 0.1% Triton-X100 的 PBS 中）2 小时。从本步骤开始，后续所有操作均需在避光条件下进行。
10. 用 0.1 M PBS 洗涤载玻片，每次 10 分钟，共洗 3 次，操作同 2.2 节所述。
11. 在通风橱内，于样本上滴加一滴 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）与封片剂混合液，然后盖上盖玻片。
12. 用透明指甲油封固盖玻片边缘。在完全干燥前（约需 24 小时）不要移动载玻片。

3. 数字荧光成像

1. 为成像软脑膜血管切片中的ER-α，我们使用配备三种荧光滤光片（蓝色、绿色和红色）及数码相机的尼康Eclipse 80i数字荧光显微镜。
2. 将染色后的软脑膜血管段切片置于显微镜下，调整焦距以观察荧光标记的目标区域；先以100倍放大倍数开始，随后提高至600倍。
3. 使用相机通过DAPI（蓝色）和FITC（绿色）通道采集细胞核（DAPI）和ER-α（Oregon Green）的图像，并利用尼康Extended Depth Focus软件将血管段的多个视野合并为二维图像。

4. 代表性结果：

我们使用荧光探针定位了软脑膜动脉血管中的雌激素受体-α，并通过数字荧光显微镜优化了该受体的可视化效果。为了检测该受体的存在，采用兔多克隆一抗和 Oregon Green 488 标记的二抗对从脑表面分离的软脑膜动脉中的受体进行成像。同时，使用核染料（DAPI）标记细胞核，以确定我们是否能够检测到位于细胞核内的受体，因为已有文献报道 ER-α 可存在于细胞质和细胞核中。此外，我们还进行了验证性实验，以确认一抗的特异性，并验证二抗与一抗的结合。

图1. 从雌性大鼠脑部分离的软脑膜动脉环中ER-α（绿色）免疫荧光染色及DAPI复染（蓝色）。图1A为合并图像，提示存在部分核内雌激素受体-α（箭头所示）。图1B和1C为ER-α的聚焦图像，由Z轴层扫图像叠加而成。图像放大倍数为×600，来自同一血管环状切片的不同成像平面。箭头指示雌激素受体-α。

图2. 雌性大鼠脑部软脑膜动脉环对照组的免疫荧光染色。图2D显示未使用一抗的血管。图2E显示未使用二抗的血管（注意沿内皮侧存在明显的自发荧光）。图像在×600倍放大下采集，来自同一血管切开环的不同平面。

讨论

此前，我们发现，在经历短暂性全脑缺血性脑损伤后，年轻卵巢切除大鼠的软脑膜动脉对血管扩张剂^{7, 8}和血管收缩剂⁹引起管径变化的能力显著降低。长期补充雌激素可恢复血管运动反应^7-9。此外，延迟给予雌激素替代会逆转雌激素对软脑膜动脉血管舒张功能的有益作用¹⁰，这促使我们质疑长期雌激素缺乏是否会影响脑血管系统中雌激素受体-α（ER-α）的密度。我们原计划采用免疫荧光标记结合Western印迹法，评估慢性雌激素缺乏对ER-α表达水平的影响。由于我们在观察受体的离散分布时遇到了一些困难，因此对方法进行了改进，本文即展示这一优化后的方法。因此，本研究的主要目标是首先建立一种相对简便的方法，以优化软脑膜小动脉中受体的可视化效果。与多项研究报道一致^6,11,12，我们发现有必要根据所检测组织的类型、样本厚度、ER-α在血管中的分布情况以及非特异性结合程度等因素对实验条件进行调整。

我们的方法在可视化软脑膜血管切片中ER-α的存在方面非常有效。但正如其他研究者先前指出的，这些方法的成功应用在很大程度上取决于抗体的特异性与浓度、目标蛋白的亚细胞定位、固定与封闭方案以及组织处理方式¹²。在对血管样本进行可视化之前，我们花费了时间优化上述各项变量。本文中我们已重点说明了在该过程中对部分实验方案进行的调整。

我们旨在对软脑膜小动脉中的ER-α进行最佳可视化，这一目标带来了一些挑战。首先，大鼠软脑膜动脉的平均直径为35–50 μm，使其从脑表面分离和取出具有一定的难度。我们发现，在处死前通过灌注伊文思蓝染料可使动脉解剖过程更为容易。伊文思蓝可能影响荧光信号，但我们认为使用该染料的优势远大于其轻微的不利影响。在本方案中，血管经过多次洗涤，以最大限度减少血管内残留的染料，从而降低染料对荧光的潜在干扰。我们遇到的另一个困难是软脑膜血管节段较厚，导致受体的清晰成像较为困难。此外，我们未能获得特别清晰的图像，可能是因为ER-α分散于多个细胞层中。我们曾尝试采用纵向血管切片（如其他研究者所用），但由于软脑膜血管尺寸较小，即使在显微镜下操作，也难以处理血管并防止其在载玻片上发生扭曲。最终，我们成功改进了技术，使用冷冻切片机将血管横向切割成8 μm厚的环状切片。这些环状切片更易于操作，且可在同一张载玻片上放置多个样本。

在获取血管后，我们认为有必要检验Danseshatalb及其同事建议的先对组织进行速冻再固定血管的方法的有效性¹¹。尽管我们发现该方法仅略微降低了免疫荧光背景，但也注意到受体染色强度减弱，导致受体的可视化更加困难。因此，我们更倾向于首先将整个脑组织冷冻并保存至需要时使用（通常为1至2个月）。随后，我们按照所述方法剥离血管，并在使用冷冻切片机切片前对血管进行固定，正如本文所展示的那样。

一个必要的步骤是分别使用一抗和二抗进行对照实验，以确定免疫荧光的特异性和背景信号。雌激素受体-α 抗体可能较难操作。事实上，在获得满意的受体染色结果之前，我们尝试了3种不同的一抗（1种单克隆抗体和2种多克隆抗体）。作为对照的一部分，我们首先通过省略一抗的添加来验证一抗的特异性。图2D显示了未加一抗的血管样本，其中无染色信号，仅有轻微背景信号。由于该一抗为多克隆抗体，存在一定程度的弥散性非特异性背景染色。其次，我们加入了一抗但未加二抗（图2E）。可以观察到沿血管内皮边界呈现的自发荧光清晰轮廓。这一现象与Dan及其同事⁵的研究结果一致。然而，代表ER-α的微小免疫荧光点以及反映大量受体存在的颗粒状结构，均需在一抗和二抗共同作用下才能被检测到。我们注意到血管内皮边缘存在明显的自发荧光分布模式。这些针对抗体特异性的独立验证实验非常重要，因为它们证实了一抗对ER-α的特异性，以及二抗能够特异性结合一抗。

总之，正如其他研究者所证实的那样^{4, 5}，脑血管中含有大量的ER-α亚型受体。在我们的实验中，制备8μm厚的分离软脑膜动脉横切片可增强受体的染色效果和可视化程度。传统方法采用共聚焦显微镜观察样本，而共聚焦显微镜的一个重要优势在于能够对厚样本进行连续光学切片观察。然而，购置一台性能良好的共聚焦显微镜可能非常昂贵。通过使用扩展景深（EDF）软件，我们发现可以显著降低设备成本。利用配备EDF功能的荧光显微镜，我们获得了清晰的图像，并可通过Z轴堆叠在多个层面观察软脑膜动脉中的ER-α受体。EDF软件的一个显著优势是，它能够以有效的方式整合图像，从而生成三维图像。对于无法获得共聚焦显微镜或缺乏购置资金的实验室而言，配备合适软件的数字荧光显微镜可能是一种实用且成本较低的替代方案，具体选择取决于研究者的研究目标。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
伊文思蓝	Sigma-Aldrich	E-2129
PBS 10X	Sigma-Aldrich	P-5493
多聚甲醛	Fisher Scientific	T353
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	VWR international	25608-930
氯化铵	Sigma-Aldrich	A9434
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	T9284
正常山羊血清	Invitrogen	16210-064
ER-α 兔多克隆抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	H-184
Oregon green 488 标记的山羊抗兔 IgG	Invitrogen	O-11038
含 DAPI 的 Vectashield 荧光封片介质	Vector Laboratories	H-1200