Denne artikel viser optagelsen af de enkelte celler fra fluorescens tagget neuronale populationer i det intakte mus nethinden. Ved at bruge to-foton infrarøde excitation transgenetically mærkede celler var målrettet til patch-clamp-optagelse for at studere deres lette svar, modtagelige feltegenskaber, og morfologi.
Undersøgelse af fysiologiske egenskaber og synaptiske forbindelser af specifikke neuroner i den intakte væv er en udfordring for de celler, der mangler synlige morfologiske træk eller vise en lav befolkningstæthed. Dette gælder især for retinal amacrine celler, en usædvanlig mangeartet klasse af interneuroner, der udgør omkring 30 undertyper i pattedyr 1. Skønt at være en afgørende del af den visuelle behandling af forme retinale udgang 2, har de fleste af disse undertyper ikke blevet undersøgt indtil nu i en funktionel sammenhæng, fordi støder på disse celler med en optagelse elektrode er en sjælden begivenhed.
For nylig, et væld af transgene mus linjer er til rådighed, der udtrykker fluorescerende markører som grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af initiativtagerne til membran receptorer eller enzymer, som er specifikke for kun en delmængde af neuroner i et givet væv 3,4. Disse pre-mærkede celler er derfor accessible til instrueret mikroelektrode målrette under mikroskopiske kontrol, således at den systematiske undersøgelse af deres fysiologiske egenskaber in situ. Imidlertid er excitation af fluorescerende markører ledsaget af risikoen for fototoxicitet for det levende væv. I nethinden, er denne tilgang yderligere vanskeliggjort af det problem, at excitation lys forårsager passende stimulering af fotoceller, således at påføre photopigment blegning og overføre den retinale kredsløb i et let-tilpasset tilstand. Disse ulemper er overvundet ved hjælp af infrarød excitation leveret af en mode-locked laser i korte pulser af femtosekund rækkevidde. To-foton excitation giver energi nok til fluoroforen excitation og samtidig begrænser irritation til et lille væv volumen minimering af farerne af solskader 5. Også, det forlader nethinden lydhør over for visuelle stimuli siden infrarødt lys (> 850 nm) er kun i ringe grad absorberes af photopigments 6.
<p class = "jove_content"> I denne artikel vil vi demonstrere brugen af en transgen mus nethinden for at opnå elektrofysiologiske in situ optagelser fra GFP-udtrykkende celler, der visuelt målrettet af to-foton excitation. Nethinden er udarbejdet og vedligeholdes i mørke og kan blive udsat for optisk stimuli som forventes gennem kondensatoren til mikroskop (figur 1). Patch-clamp optagelse af lys reaktioner kan kombineres med farvestof påfyldning at afsløre morfologi og at kontrollere for gap junction-medierede dye kobling til de omkringliggende celler, således at målet celle kan ved studeres på forskellige eksperimentelle niveauer.Denne metode giver mulighed for at studere elektriske egenskaber af specifikke neuroner i den intakte nethinden under visuel vejledning uden at påvirke tilpasnings tilstand af nethinden. Det er specielt velegnet til karakterisering af celler, der i øjeblikket er temmelig dårligt undersøgt på grund af lav befolkningstæthed som de fleste populationer af amacrine celler. To-foton excitation giver høj opløsning og høj kontrast imaging selv fra dybere dele af vævet 17, en forudsætning for præcis målretning og vellykket patch-fastspænding af celler især i de INL med sin høje tæthed af celle organer.
Den isolerede musen nethinden er rentabelt for 3-4 timer under eksperimentelle betingelser. Hvis den anden nethinden er gemt i komplet mørke under konstant carbogen gasning, bevarer den lilla farve ubleget photopigment og kan bruges efter endt forsøg med den første nethinden. I begyndelsen, rettet modvalgte celle med mikropipette i retinal wholemount er en smule udfordrende og kræver lidt øvelse, især når der arbejdes i mørke. Herunder et fluorescerende farvestof i mikropipette kan forenkle proceduren, fordi celle og mikropipette er synlige under to-foton excitation på samme tid. Dog kan tilføje komponenter til den intracellulære løsning hindre gigaseal dannelse eller forårsage optagelsen kvalitet til at lide. Når succes opnået, kan en god optagelse, der sidst i ca 1 time
Der henviser til, infrarøde excitation lys i sig selv er kun i ringe grad absorberes af retinal fotoreceptorer, ophidset GFP-udtrykke celler udsender lys i den synlige del af spektret. Dog er fluorophores begejstrede kun i et lille omdrejningspunkt volumen, der ikke er sandsynligt, at ændre tilpasnings tilstand af nethinden. Alle de mere, magnetisering er kun nødvendig for at målrette og kan slukkes under optagelse af lys svar.
Den usefulnESS af denne fremgangsmåde er allerede bevist ved undersøgelser af specifikke populationer af amacrine celler 14,18 hvorfra elektrofysiologiske optagelser ellers ville have været muligt blot ved et uheld 12. Endelig kan denne kraftfulde teknik, yderligere udvides ved at inkludere en farmakologisk tilgang 14, Ca 2 + imaging 19 eller ved at bruge injiceres celler til immuncytokemiske studier eller elektronmikroskopi. På den måde kan den funktionelle placering af en given celletype i retinale kredsløb blive bragt i orden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 til KD og RW). Vi er taknemmelige for Thomas Euler (Töbingen, Tyskland) for lyset stimulation software QDs.
Reagent/Equip-ment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
Optical filter | Schott, Mainz, Germany | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
Recording chamber | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
Flow heater | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
Air table | Newport | VH 3036W-OPT | |
Laser | Spectra-Physics | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
Micromanipulator | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
Patch-clamp amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-05LX npi | |
Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm | |
Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |