完整视网膜中表达GFP的细胞群体的电生理特征分析

摘要

本文描述了从小鼠完整视网膜中荧光标记的神经元群体记录单个细胞的方法。通过使用双光子红外激发，对转基因标记的细胞进行膜片钳记录，以研究其光反应、感受野特性及形态学特征。

摘要

在完整组织中研究特定神经元的生理特性和突触连接是一项挑战，尤其对于那些缺乏显著形态特征或细胞密度较低的细胞。这尤其适用于视网膜无长突细胞，这是一类高度多样化的中间神经元，在哺乳动物中包含约30种亚型¹。尽管这类细胞通过调控视网膜输出在视觉信息处理中起着关键作用²，但由于用记录电极捕获这些细胞的概率极低，迄今为止大多数亚型尚未在功能层面上得到研究。

近年来，已有大量转基因小鼠品系可供使用，这些小鼠在特定细胞膜受体或酶的启动子调控下表达荧光标记物，例如绿色荧光蛋白（GFP），且这些启动子仅在特定组织中的一小部分神经元中具有活性^3,4。因此，这些预先标记的细胞可在显微镜控制下通过定向微电极进行靶向定位，从而能够在原位系统性地研究其生理特性。in situ。然而，激发荧光标记物的同时会带来光毒性对活体组织造成损伤的风险。在视网膜组织中，该方法还面临另一个问题：激发光会有效刺激光感受器，导致视色素漂白，并使视网膜环路转入光适应状态。这些问题可通过使用锁模激光器发出的飞秒级短脉冲红外激发光得以克服。双光子激发能够提供足够的能量以激发荧光分子，同时将激发区域限制在微小的组织体积内，从而最大限度地降低光损伤风险⁵。此外，由于红外光（>850 nm）被视色素吸收的程度极低，因此视网膜仍能对视觉刺激保持响应⁶。

本文中，我们展示了利用转基因小鼠视网膜获取电生理学数据的方法 原位 使用双光子激发对表达GFP的细胞进行视觉定位记录。视网膜样本在暗室中制备并保存，并可通过显微镜聚光镜投射光学刺激（图1）。光反应的膜片钳记录可结合染料填充，以揭示细胞形态，并检测是否存在通过缝隙连接介导的邻近细胞间染料耦合，从而可在多个实验层面对目标细胞进行研究。

方案

以下描述假设实验人员已具备视网膜结构、膜片钳记录和双光子显微镜的基本知识。有关建立和运行膜片钳装置及双光子成像系统的实用信息，请参见参考文献[7-12]。

1. 动物和组织准备

1. 将小鼠在暗环境中适应至少 3 小时。在此期间，准备 1-2 升细胞外液，其成分为（单位：mM）125 NaCl、2.5 KCl、1 CaCl₂、1.6 MgCl₂、25 NaHCO₃、10 D-葡萄糖，并在室温下用碳氧混合气（5% CO₂ 与 O₂ 混合）通气，调节 pH 至 7.4。
2. 将小鼠置于密闭容器中，通过过量 CO₂ 窒息处死，随后进行颈椎脱位。该操作及后续步骤均应在黑暗中进行。使用低强度长波长照明（我们通过 690 nm 长通滤光片阻断冷光源中的短波成分）以辅助操作者视觉，同时保持动物眼睛处于暗适应状态（小鼠在光谱红光区域视觉能力较差）。若需在完全黑暗中操作，请使用红外照明（>800 nm）并佩戴夜视镜。
3. 使用弯头虹膜剪摘除眼球，并将其转移至置于解剖显微镜下的培养皿中的细胞外液中。
4. 使用弹簧剪沿锯齿缘（视网膜与睫状体的边界）剪开眼球壁（可先用采血针刺出起始切口），去除角膜和睫状体。取出晶状体，并小心地将视网膜从色素上皮层分离。若视网膜的方向对实验研究至关重要，请参照文献[12]的方法进行标记。在视网膜与色素上皮之间剪断视神经，并将视网膜从巩膜杯中取出。注意视网膜各面的方向：卷曲视网膜的内侧为节细胞侧，外侧为光感受器侧。
5. 用木制牙签轻轻牵拉，去除视网膜内表面的玻璃体。操作时使用少量细胞外液，仅覆盖视网膜即可。玻璃体会黏附于牙签上，并可自视网膜表面离心方向拖出。随后，在视网膜边缘做数个短切口，以利于组织展平。
6. 将视网膜光感受器侧朝下转移至记录室，用细毛刷将其铺展在玻璃底面上，并用不锈钢丝网框固定。以相同方法准备第二片视网膜，并将其保存于通有碳氧混合气的细胞外液中，保持暗适应状态以备后续使用。

2. 记录

1. 在黑暗环境中将记录室安装于直立式激光扫描显微镜下，并持续灌流以含碳合气的细胞外液（流速不低于 5 ml/min），温度维持在 35 °C。显微镜（配备红外敏感 CCD 相机）置于法拉第笼内的防震气浮台上，以实现电子屏蔽。用不透明帘布覆盖法拉第笼，确保视网膜制备物处于黑暗状态。我们还使用红色透明薄膜遮蔽计算机显示器发出的光线。
2. 将红外激光调至 850–870 nm 或更长波长，切换至锁模模式，利用双光子激发观察表达 GFP 的细胞。通过激光扫描软件控制中性密度滤光片，衰减激光输出至刚好能够清晰识别荧光细胞的程度。
3. 进行电流钳模式下的膜片钳记录时，使用玻璃微电极（我们采用外径 1.5 mm、壁厚 0.225 mm 的硼硅酸盐玻璃管），内充液成分为（单位：mM）125 K-葡萄糖酸盐、10 KCl、0.5 EGTA、10 HEPES，用 KOH 调节 pH 至 7.4（电极电阻约为 5 MΩ）。请注意，其他实验条件（如电压钳记录）需使用不同的内充液。若需进行染料注射，可添加荧光探针（我们使用 10 mM Alexa Fluor 594）或示踪分子（3% Neurobiotin）。将微电极插入电极夹持器，并确保参考电极（氯化银丝）与记录室中的细胞外液接触。
4. 对微电极施加正压，靶向目标 GFP 表达细胞（我们使用 40 倍水浸物镜，数值孔径 NA 1.25）。无长突细胞的胞体位于节细胞层（在当前视网膜取向中紧贴表面）以及内核层近端部分（约在组织深部 55–75 μm 处）。在微电极接触目标细胞前，需穿透视网膜表面的内界膜（由胶质细胞终足构成的鞘状结构）。成功穿透的标志是微电极尖端排出的细胞内液将内界膜从下方视网膜组织推开，该现象可在红外 CCD 相机捕获的透射图像中观察到。
5. 通过比较双光子图像中胞体的位置与红外 CCD 相机显示的记录微电极位置，接近目标细胞。请注意，此步骤较难实现，需要一定练习，因为必须在红外透射图像中识别出表达 GFP 的细胞，才能引导微电极准确接近。当微电极尖端引起细胞表面凹陷（在双光子图像中可见）时，即表示已正确靶向。作为替代方法，可在内充液中加入荧光染料（如 Alexa Fluor 594，100 μM），以在双光子图像中显示微电极位置。双光子红外激发足以使该染料产生足够荧光，从而清晰辨识微电极。为此，需在激光扫描软件中调整检测范围，以涵盖红色荧光信号。
6. 释放微电极压力，形成全细胞膜片钳构型，进行电流钳记录。有效的记录应获得 -50 至 -55 mV 的膜电位，并持续至少 20 分钟。
7. 通过刺激软件（我们使用德国图宾根大学 Thomas Euler 开发的 QDS 软件）¹¹ 在计算机显示器上呈现视觉刺激。调整刺激的空间位置，使其中心对准被记录细胞：在显示红外 CCD 透射图像的显示器上标记细胞位置，并将点状刺激居中对准该点。通过在光路中插入中性密度滤光片调节刺激强度。有关显示器光谱和强度的校准，请参见参考文献 [14]。选择较长的刺激间期（例如 15 秒），以避免适应效应。在光路中加入光电二极管，用于记录刺激时序。
8. 启动刺激程序并记录光反应（对于非放电细胞，我们采用 10 kHz 采样率，5 kHz 滤波；对于动作电位记录，建议使用更高采样率，如 20 kHz）。使用光刺激软件触发记录软件。
9. 进行染料填充时，让荧光剂在细胞内扩散 30–45 分钟后，再小心地将微电极从细胞中撤出，注意避免带出细胞胞体。若使用非荧光示踪剂 Neurobiotin，则需通过与荧光素偶联的链霉亲和素进行显色（我们采用 streptavidin-Cy3，1:400，4 °C 过夜孵育，在视网膜经 20 分钟多聚甲醛固定后；对于染料偶联研究，链霉亲和素孵育时间可延长至 3 天）。此外，也可使用尖锐电极（>100 MΩ）进行注射，通过离子电泳方式将染料注入穿刺细胞（矩形脉冲：0.25–1 nA，100 ms，间隔 100 ms，总时间 3–6 分钟）。

3. 代表性结果：

以下结果来源于一项针对在酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠（TH::GFP 小鼠）的研究^13,14，该酶是儿茶酚胺合成限速步骤的催化剂。根据 GFP 信号的亮度，可区分出两个不同的细胞群体（图 2A）。表达较高 GFP 水平的细胞，其胞体位于内核层（INL，图 2A）或移位至节细胞层（GCL，图 2B），并在内丛状层（IPL）中部形成分层（图 2C）。这些细胞被鉴定为 2 型细胞^14-16，尽管其细胞密度仅为 250 个细胞/mm²，仍可系统地对其形态学特征（图 3）和电活动（图 4）进行研究。

图1。实验装置示意图。双光子激发（红色虚线光路）完整视网膜中表达荧光蛋白的细胞，可通过微移液管进行可视化靶向（绿色发射光路）。视网膜接受通过显微镜聚光镜投射的光学刺激（黄色光路），并记录细胞的光反应。

图2．TH::GFP小鼠视网膜平铺切片中表达GFP的细胞。根据GFP信号的亮度可区分出两种细胞群：位于内核层（INL）的1型细胞（DA细胞），其荧光较弱（A，见箭头所示）；以及标记强烈的2型细胞，其胞体位于内核层（INL）（A，见箭头所示）或移位至神经节细胞层（GCL）（B），并在内丛状层（IPL）的S3亚层形成树突分层（C）。比例尺，50 μm。

图3．注入示踪剂神经生物素的2型细胞形态。示踪剂随后通过链霉亲和素-Cy3结合（紫红色）显影。该显微图像同时显示了GFP信号（绿色），是覆盖颗粒细胞层（GCL）和内丛状层（IPL）的图像堆栈的投影。比例尺，50 μm。

图4。位于内核层（GCL）的一种2型细胞对光的反应。在暗视觉范围内，随着白光全视野刺激强度逐渐增加，细胞的反应模式。刺激强度以每秒每视杆细胞的光异构化事件数（Rh*/rod/s）表示。采用持续3秒的长时间刺激，以便更清晰地区分刺激开始（ON反应）和刺激终止（OFF反应）时的反应成分。

讨论

该方法可在视觉引导下研究完整视网膜中特定神经元的电学特性，同时不干扰视网膜的适应状态。该方法特别适用于目前因细胞密度较低而研究较少的细胞类型，例如大多数无长突细胞群体。双光子激发能够对组织深层区域实现高分辨率和高对比度成像¹⁷，这是精确定位并成功对内核层（INL）等细胞体密集区域中的细胞进行膜片钳记录的前提条件。

在实验条件下，分离的小鼠视网膜可保持活性3-4小时。如果将第二只视网膜在持续通入碳氧混合气（carbogen）的条件下完全避光保存，则其未漂白的感光色素可维持紫色状态，并可在完成第一只视网膜的实验后继续使用。起初，在视网膜铺片中用微电极靶向选定细胞具有一定挑战性，需要一定练习，尤其是在暗环境中操作时。在微电极内加入荧光染料可简化操作过程，因为细胞和微电极可在双光子激发下同时可见。然而，在细胞内溶液中添加成分可能会影响吉欧封接（gigaseal）的形成，或导致记录质量下降。一旦成功建立记录，良好的电生理记录可持续约1小时。

尽管红外激发光本身被视网膜感光细胞吸收的程度很低，但表达GFP的被激发细胞会发射出可见光谱范围内的光。然而，荧光分子仅在很小的焦体积内被激发，这种激发不太可能改变视网膜的适应状态。更重要的是，激发光仅用于定位，在记录光反应时可以关闭。

该方法的有效性已在特定类型的无长突细胞研究中得到证实^14,18，若无此技术，对这些细胞进行电生理记录几乎只能偶然实现¹²。最后，该强大技术还可进一步拓展，例如结合药理学方法¹⁴、Ca²⁺成像¹⁹，或利用注射标记的细胞开展免疫细胞化学研究及电子显微镜分析。通过这些方式，可揭示特定细胞类型在视网膜神经环路中的功能定位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
夜视护目镜	Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany	Xtron F1	包含 800 nm 光源
光学滤光片	Schott AG	RG9	长通滤光片，截止波长为 690 nm
虹膜剪刀	Fine Science Tools	14061-09	弯曲型，刀片长 22 mm
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15000-00	直型，刀片长 3 mm
记录室	Luigs & Neumann	200-100 500 0180 type A(TC)	聚四氟乙烯材质室体，底部安装玻璃盖玻片（约 0.15 mm；编号 200-100 500 0182）
灌流加热器	Multi Channel System MCS GmbH	PH01, TC01	可加热灌流套管，配有温度传感器和温度控制器
激光扫描显微镜	Leica Microsystems	DM LFS	由 Leica 共聚焦软件控制
防震光学平台	Newport Corp.	VH 3036W-OPT
激光器	Newport Corp.		Tsunami 锁模钛宝石激光器
CCD 相机	pco AG, Kelheim, Germany	PixelFly QE	含控制软件
微电极玻璃毛细管	Hilgenberg, Malsfeld, Germany	1408411
微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004	荧光染料
神经生物素	Axxora	VC-SP-1120-M050	非荧光示踪剂
链霉亲和素-Cy3	Dianova	016-160-084
显微操作器	Luigs & Neumann	210-100 000 0010	电动 Mini25 操作单元，配有 SM-5 显示器
膜片钳放大器	npi electronic	SEC-05LX npi
数据采集卡	National Instruments	BNC-2090
数据采集软件 WinWCP	John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK		http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm
视觉刺激发生器 QDS	Thomas Euler, University of Tübingen, Germany		需在独立计算机上运行，控制两台显示器（用户界面显示器和刺激显示器）
中性密度滤光片	ITOS, Mainz, Germany