उद्देश्य के लिए शारीरिक प्रीलोड और afterload दबाव के के संदर्भ में पृथक दिल की mitochondrial redox राज्य की निगरानी है. एक बाइवेन्ट्रिकुलर काम खरगोश दिल मॉडल प्रस्तुत किया है. उच्च spatiotemporal NADH संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए epicardial ऊतक के mitochondrial redox राज्य की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है.
Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited for studies of cardiac metabolism, which require the heart to perform work within the context of physiologic preload and afterload pressures. Neely introduced modifications to the Langendorff technique to establish appropriate left ventricular (LV) preload and afterload pressures3. The model is known as the isolated LV working heart model and has been used extensively to study LV performance and metabolism4-6. This model, however, does not provide a properly loaded right ventricle (RV). Demmy et al. first reported a biventricular model as a modification of the LV working heart model7, 8. They found that stroke volume, cardiac output, and pressure development improved in hearts converted from working LV mode to biventricular working mode8. A properly loaded RV also diminishes abnormal pressure gradients across the septum to improve septal function. Biventricular working hearts have been shown to maintain aortic output, pulmonary flow, mean aortic pressure, heart rate, and myocardial ATP levels for up to 3 hours8.
When studying the metabolic effects of myocardial injury, such as ischemia, it is often necessary to identify the location of the affected tissue. This can be done by imaging the fluorescence of NADH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)9-11, a coenzyme found in large quantities in the mitochondria. NADH fluorescence (fNADH) displays a near linearly inverse relationship with local oxygen concentration12 and provides a measure of mitochondrial redox state13. fNADH imaging during hypoxic and ischemic conditions has been used as a dye-free method to identify hypoxic regions14, 15 and to monitor the progression of hypoxic conditions over time10.
The objective of the method is to monitor the mitochondrial redox state of biventricular working hearts during protocols that alter the rate of myocyte metabolism or induce hypoxia or create a combination of the two. Hearts from New Zealand white rabbits were connected to a biventricular working heart system (Hugo Sachs Elektronik) and perfused with modified Krebs-Henseleit solution16 at 37 °C. Aortic, LV, pulmonary artery, and left & right atrial pressures were recorded. Electrical activity was measured using a monophasic action potential electrode. To image fNADH, light from a mercury lamp was filtered (350±25 nm) and used to illuminate the epicardium. Emitted light was filtered (460±20 nm) and imaged using a CCD camera. Changes in the epicardial fNADH of biventricular working hearts during different pacing rates are presented. The combination of the heart model and fNADH imaging provides a new and valuable experimental tool for studying acute cardiac pathologies within the context of realistic physiological conditions.
अलग Langendorff perfused दिल हृदय 2 शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए एक प्रमुख उपकरण है. कार्डियक arrhythmias, विशेष रूप से उन है कि की transmembrane 20 संभावित प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है. एक लाभ यह है कि पृथक दिल के पूरे epicardium 21, 22 देखा जा सकता है. एक और लाभ यह है कि, रक्त के लिए इसके विपरीत में, एक स्पष्ट बिल्लौर की तरह बफर समाधान के साथ छिड़काव प्रतिदीप्ति संकेत के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. एक सीमा है कि हृदय चयापचय, जो अक्सर दिल शारीरिक प्रीलोड और afterload दबाव के के संदर्भ के भीतर काम पूरा करने की आवश्यकता के अध्ययन के लिए Langendorff तकनीक नहीं अच्छी तरह से अनुकूल है.
चयापचय अध्ययन, नीली Langendorff तकनीक के लिए संशोधन पेश करने के लिए उपयुक्त बाएं निलय (LV) प्रीलोड और afterload के 3 दबाव की स्थापना के लिए पृथक हृदय की तैयारी की प्रासंगिकता तरक्की.मॉडल अलग एल.वी. काम दिल मॉडल के रूप में जाना जाता है और बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है के एल.वी. प्रदर्शन और 4-6 चयापचय अध्ययन. एल.वी. काम दिल मॉडल कार्यात्मक मूल्यांकन Langendorff मॉडल के लिए करने के लिए बेहतर है, अभी तक यह एक अच्छी तरह से भरा हुआ सही वेंट्रिकल (आर वी) प्रदान नहीं करता है. Demmy एट अल. एल.वी. काम दिल मॉडल 7, 8 के एक संशोधन के रूप में पहली बार एक बाइवेन्ट्रिकुलर मॉडल (एल.वी. और आर.वी.) की सूचना दी. उन्होंने पाया कि स्ट्रोक मात्रा, कार्डियक आउटपुट, और दबाव काम कर एल.वी. मोड से बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर रहे आठ मोड परिवर्तित दिलों में सुधार विकास. एक अच्छी तरह से भरा हुआ आर.वी. भी पट भर असामान्य दबाव gradients ह्रासमान द्वारा वंशीय समारोह में सुधार है. बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल को 3 8 घंटे के लिए महाधमनी उत्पादन, फेफड़े प्रवाह, महाधमनी दबाव मतलब है, फेफड़े रक्तचाप, हृदय गति और myocardial एटीपी मतलब है, और creatine फॉस्फेट के स्तर को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है. बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल अध्ययन आमतौर पर दिल fr उपयोगओम चूहों और खरगोशों के रूप में छोटे जानवर, क्योंकि कार्डियक आउटपुट और perfusate की आवश्यक मात्रा बड़े जानवरों के दिल के लिए तुलना में बहुत कम हैं. हालांकि, बाइवेन्ट्रिकुलर काम दिल अध्ययन सूअर, कुत्तों, और यहाँ तक कि इंसानों 23, 24 से दिलों का उपयोग आयोजित किया गया है.
बाइवेन्ट्रिकुलर कार्य मोड में अलग दिल की चयापचय की मांग काफी Langendorff छिड़काव की तुलना में अधिक है. यह महत्वपूर्ण है कि perfusate समाधान पर्याप्त ऑक्सीजन और चयापचय सब्सट्रेट लिए बाइवेन्ट्रिकुलर दिल समारोह का समर्थन प्रदान करते हैं. क्रेब्स – Henseleit 16, 17, 25 या 26 Tyrodes, 27 के रूप में मानक बिल्लौर की तरह बफर समाधान, के रूप में उच्च के रूप में ऑक्सीजन solubilities 5.6 मिलीग्राम / एल. जब इन समाधान carbogen (95% 2 हे और 5% सीओ 2 के एक गैस मिश्रण) के साथ मार डाला जाता है और चयापचय उपयुक्त सब्सट्रेट (ग्लूकोज, dextrose, और / या सोडियम पाइरूवेट) होते हैं, वे बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर आदर्श पर दिलों की धड़कन के लिए उपयुक्त हैंअल साइनस दर (लगभग 180 एक खरगोश के लिए bpm).
तेजी से लय के लिए मेटाबोलिक मांग बढ़ जाती है और हैं मानक perfusates में भंग ऑक्सीजन की मात्रा पर्याप्त नहीं हो सकता है पूरी तरह से एक बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल है कि उच्च दर पर करार का समर्थन हो सकता है. बिल्लौर की तरह बफर एरिथ्रोसाइट्स या पूरे रक्त के साथ मिश्रित युक्त समाधान काम कर दिल की तैयारी में इस्तेमाल किया गया है करने के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन की उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एक समाधान क्रेब्स – Henseleit एरिथ्रोसाइट्स जोड़ने कठोर पेसिंग प्रोटोकॉल के दौरान काम कर दिल समारोह में सुधार और भी दिया ventricular fibrillation के 16 घटनाओं को कम. एरिथ्रोसाइट्स या पूरे रक्त का मिश्रण का उपयोग की एक सीमा है कि कि हीमोग्लोबिन प्रकाश तरंग दैर्ध्य है कि प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए 13 उपयोग किया जाता है के साथ हस्तक्षेप है. Albumin जैसे अन्य substrates, भी के समाधान perfusate दिल व्यवहार्यता लम्बा और 28 के edema कम करने के लिए जोड़ा जा सकता है.
प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता अधिक हो सकता है और प्रकाश वितरण एक समान होना चाहिए चाहिए. वर्दी रोशनी हासिल हमेशा epicardial सतह की वक्रता की वजह से आसान नहीं है. हमारे अध्ययन में, हम छवि fNADH पारा दीपक से प्रकाश (350 ± 25 एनएम) फ़िल्टरिंग. एक बंटवारा फाइबर ऑप्टिक प्रकाश गाइड epicardial सतह पर यूवी प्रकाश प्रत्यक्ष करने के लिए प्रयोग किया जाता है. वर्दी प्रकाश उपयुक्त स्थिति दो उत्पादन ferrules द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. यूवी एलईडी प्रकाश स्रोतों को भी इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में हम 3 चित्र में दिखा दिया है. एलईडी स्रोतों अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे हैं तो कई स्रोतों एक इमेजिंग सिस्टम में शामिल किया जा सकता है. एल ई डी भी उच्च दरों पर पर और बंद कर सकते हैं साइकिल छवि अधिग्रहण के साथ उत्तेजना प्रकाश सिंक्रनाइज़.
NADH की Photobleaching ऊतक रोशनी के समय को कम करने से 29 कम से कम किया जाना चाहिए. इस पर रोशनी साइकिल द्वारा और एक इलेक्ट्रॉन का उपयोग बंद किया जा सकता हैआईसी शटर और एक चिराग या एक एलईडी प्रकाश व्यवस्था और एक नियंत्रक के साथ. अगर रोशनी हृदय चक्र के साथ सिंक्रनाइज़ है, तो fNADH छवि अधिग्रहण पाद लंबा करने के लिए सीमित किया जा सकता है, जो प्रतिदीप्ति संकेतों में गति विरूपण साक्ष्य को कम करेगा. Trigging रोशनी और छवि अधिग्रहण एल.वी. दबाव के रूप में एक दबाव संकेत, का उपयोग करते हुए, एक तरीका यह करना होगा.
हम अपने अध्ययन में देखा है कि fNADH में प्रति इकाई समय के परिवर्तन से अधिक 400 bpm में अधिक से 200 bpm में 5X हो सकता है. यह इंगित करता है कि तेजी से लय दिल की redox राज्य तरक्की. चाहे या नहीं इस hypoxia या NAD NADH oxidize के myocytes की अक्षमता के कारण होता है जल्दी से NADH के संचय से बचने के लिए पर्याप्त + अभी भी एक अनुत्तरित प्रश्न है.
एक बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल की तैयारी के प्रदर्शन कई कारकों पर प्रासंगिक है. सबसे महत्वपूर्ण में से एक उचित प्रीलोड और afterload दबाव के सेट करने के लिए शारीरिक नकलस्थिति है कि जांच के अधीन हैं. विशेष रूप से, एल.वी. afterload (महाधमनी दबाव) के प्रणालीगत दबाव का प्रतिनिधित्व करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. अगर यह बहुत अधिक है, एल.वी. दबाव से उबरने, प्रत्यावहन में जिसके परिणामस्वरूप में सक्षम नहीं होगा. दबाव है कि बहुत कम है पर प्रतिकूल कोरोनरी छिड़काव प्रभावित करेगा. एल.वी. प्रीलोड दबाव (बाएं आलिंद दबाव) भी एक अंत डायस्टोलिक मात्रा है कि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त है प्रदान करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
ऊतक रहने fNADH इमेजिंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग के 13 की स्थापना की एक विधा है. हृदय ऊतक के लिए आवेदन बारलो और संभावना द्वारा सचित्र किया गया था जब वे क्षेत्रीय इस्कीमिक ऊतकों के भीतर fNADH के हड़ताली एक कोरोनरी पोत 14 की ligation के बाद उन्नयन की सूचना दी. उनके fNADH छवियों में फेयरचाइल्ड आस्टसीलस्कप कैमरा और यूवी फ़्लैश फोटोग्राफी का उपयोग कर फिल्म पर दर्ज किया गया. Coremans एट अल. इस measur के लिए NADH reflectance / प्रतिदीप्ति यूवी अनुपात का उपयोग अवधारणा पर विस्तारई Langendorff रक्त perfused चूहा 30 दिल की epicardium की चयापचय राज्य. एक videofluorimeter इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक वीडियो रिकॉर्डर का उपयोग कर डेटा दर्ज की गई थी. बाद में, Scholz एट अल. एक spectrograph और photodiode के एल.वी. के एक बड़े क्षेत्र से औसत fNADH को मापने के सरणी इस्तेमाल किया. इस दृष्टिकोण epicardial प्रतिदीप्ति विषमताओं और संचलन में स्थानीय रूपांतरों के प्रभाव को कम करते हुए 31 fNADH की macroscopic काम से संबंधित बदलाव खुलासा. इस दृष्टिकोण एक fNADH इमेजिंग डाटासेट, के रूप में चित्रा 2 में सचित्र के सभी तख्ते भर में ब्याज की एक क्षेत्र के लिए औसत fNADH स्तर कंप्यूटिंग के लिए समान है. जैसा कि हम इस लेख में प्रस्तुत किया है, आज की तकनीक उच्च गति सीसीडी कैमरों प्रदान करता है और डिजिटल उच्च शक्ति spotlights यूवी नियंत्रित. इन प्रौद्योगिकियों fNADH और हृदय चयापचय की गतिशीलता spatiotemporal कई नए दृष्टिकोण से अध्ययन करने के लिए सक्षम करें. प्रकाशिकी और प्रकाश स्रोत की अपेक्षाकृत कम लागत च बनाता हैNADH पारंपरिक हृदय ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टम के लिए एक उपयोगी सहायक इमेजिंग 9, 32
The authors have nothing to disclose.
इस काम एनआईएच (मेगावाट Kay R01-HL095828) के से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Chemical | Company | Catalogue Number |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911-500G |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968-500G |
NaPyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256-25G |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418-100G |