离体双心室工作兔心脏的NADH荧光成像

摘要

本研究的目的是在生理前负荷和后负荷压力条件下，监测离体心脏的线粒体氧化还原状态。本文介绍了一种双心室工作状态的兔心脏模型。通过高时空分辨率的NADH荧光成像，监测心外膜组织中线粒体的氧化还原状态。

摘要

自从朗根多夫（Langendorff）¹首次建立该方法以来，离体灌注心脏一直是研究心脏生理学的重要工具²。然而，该方法并不适用于需要心脏在生理前负荷和后负荷压力条件下做功的心脏代谢研究。尼利（Neely）对朗根多夫技术进行了改进，以建立适当左心室（LV）前负荷和后负荷压力³。该模型被称为离体左心室工作心脏模型，已被广泛用于研究左心室功能和代谢^4-6。然而，该模型无法为右心室（RV）提供适当的负荷。德米（Demmy）等首次报道了一种双心室模型，作为左心室工作心脏模型的改进版本^{7, 8}。他们发现，将心脏从左心室工作模式转换为双心室工作模式后，每搏输出量、心输出量及压力发展均得到改善⁸。一个承受适当负荷的右心室还可减小室间隔上的异常压力梯度，从而改善室间隔功能。研究表明，双心室工作心脏模型可在长达3小时内维持主动脉输出、肺血流、平均主动脉压、心率以及心肌ATP水平⁸。

在研究心肌损伤（如缺血）的代谢效应时，通常需要确定受损组织的位置。这可以通过成像NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式）^9-11的荧光来实现，NADH是一种在线粒体中大量存在的辅酶。NADH荧光（fNADH）与局部氧浓度呈接近线性的反比关系¹²，可作为线粒体氧化还原状态的指标¹³。在缺氧和缺血条件下进行fNADH成像已被用作一种无需染料的方法，用于识别缺氧区域^{14, 15}，并随时间监测缺氧状态的发展进程¹⁰。

该方法的目的是在改变心肌细胞代谢速率、诱导缺氧或二者结合的实验方案中，监测双心室工作心脏的线粒体氧化还原状态。将新西兰白兔的心脏连接至双心室工作心脏系统（Hugo Sachs Elektronik），并在37 °C条件下用改良的Krebs-Henseleit溶液¹⁶进行灌流。记录主动脉、左心室、肺动脉以及左右心房的压力。使用单相动作电位电极测量电活动。为成像游离NADH（fNADH），采用汞灯发出的光经滤光（350±25 nm）后照射心外膜，发射光经滤光（460±20 nm）后由CCD相机采集成像。本文展示了双心室工作心脏在不同起搏频率下心外膜fNADH的变化。该心脏模型与fNADH成像技术的结合，为在接近真实生理条件的情境下研究急性心脏病理提供了新颖且有价值的实验工具。

方案

1. 研究的准备工作

1. 配制四升改良 Krebs-Henseleit 溶液¹⁶（单位：mM：118 NaCl、3.30 KCl、2.00 CaCl₂、1.20 MgSO₄、24.0 NaHCO₃、1.20 KH₂PO₄、10.0 葡萄糖、2.00 NaPyruvate 和 20.0 mg/L 白蛋白）。溶液应尽可能在实验开始前配制。经无菌过滤（孔径：22 μm，Corning）后，调节 pH 至 7.4。溶液渗透压应介于 275 至 295 mOsm/kg 之间。
2. 用纯化水冲洗工作心脏系统的全部管道和腔室。运行泵直至系统内所有水分被完全排出。
3. 在每台灌注泵（Langendorff 灌注泵、左心灌注泵和右心灌注泵）的管路中串联接入纤维素膜滤器（孔径：5 μm，Advantec）。
4. 对每个压力传感器进行两点校准（0 和 60 mmHg）。
5. 开启水浴装置。使用加热循环水浴（Cole Palmer）加热夹套管和热交换器。灌注液在另一独立水浴（Oakton Instruments）中预热。两个水浴均设定为维持溶液温度在 37 °C。
6. 启动泵以使灌注液在闭路系统中循环。灌注液流经微纤维氧合器（血液过滤器），并以 80 kPa 的压力通入 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体进行氧合。氧合后的灌注液随后通过热交换器，以维持其在进入心脏插管前的温度为 37 °C。

2. 心脏切除

1. 首先将工作心脏系统设置为恒压 Langendorff 模式运行，并将主动脉阻断压力设定在 50 至 60 mmHg 范围内。
2. 通过肌内注射给予兔氯胺酮（44 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。待兔进入镇静状态后，经耳缘静脉或后肢内侧隐静脉静脉注射戊巴比妥（50 mg/kg）和肝素（2000 U）。
3. 当兔对疼痛刺激完全无反应时，迅速打开胸腔，切开心包，夹闭主动脉，并将心脏和肺组织一并取出。此时应保留肺组织与心脏相连，以利于肺静脉的分离。
4. 使用连接有装有 60 mL 灌注液和 200 单位肝素注射器的直径为 5 mm 的插管插管主动脉并完成分离。用 0 号丝线将主动脉固定于插管上，并缓慢推动注射器活塞，以冲洗心脏内的血液。

3. 双心室插管

1. 将心脏连接至工作心脏系统的主动脉套管块。防止空气进入主动脉，以免引起冠状动脉栓塞。最佳操作方法是以斜角接近主动脉连接器，并在连接时让灌注液从连接器末端轻柔滴入套管中。
2. 在以恒定压力进行Langendorff模式灌注的同时，清除脂肪和结缔组织，并识别以下血管：下腔静脉、上腔静脉、奇静脉、肺动脉和肺静脉。
3. 结扎上腔静脉。在肺动脉分叉为左、右肺动脉稍下方处将其切断。
4. 将心脏与肺之间剩余的所有血管（即肺静脉）聚集在一起，用一根缝线将其全部结扎。随后移除肺组织。
5. 在左心耳尖角处剪开一个小孔。确保左心房（LA）内充满灌注液。插管时确保套管完全充满灌注液，避免产生气泡，然后将套管缝合固定于左心耳。
6. 启动左侧泵（泵#2），以向左心房供流。将前负荷压力设定在2–6 mmHg范围内，并根据心房扩张情况调整±2 mmHg。
7. 关闭Langendorff泵（泵#1），将心脏切换至工作心脏模式。
8. 短暂将主动脉压力降低至10 mmHg，然后缓慢升高至80–100 mmHg范围。此操作可使主动脉瓣开放，并在接近正常生理条件下发挥功能。最终的后负荷压力取决于左心室的收缩力，应设定为比左心室峰值压力低约20 mmHg的数值。
9. 通过测量从主动脉套管流出的灌注液流速（mL/min），可确定左心室心输出量。正常心输出量为每100 g体重14.77–16.43 mL/min¹⁷，对于一只2.2 kg的兔，平均约为340 mL/min。主动脉压力波形应与图1所示压力信号相似。
10. 经下腔静脉对右心房（RA）进行插管。确保右心房和套管均完全充满灌注液，并在插入过程中防止气泡形成。将套管缝合固定于静脉。
11. 启动右侧泵（泵#3），以向右心房供流。将压力设定在约3 mmHg。
12. 确保右心室充满灌注液后，对肺动脉进行插管。插入时务必确保套管完全充满灌注液，以防产生气泡。将套管缝合固定于肺动脉。

4. 信号采集：压力、单相动作电位和荧光烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

1. 双心室插管完成后，通过主动脉插管将压力换能器导管（Millar）小心插入主动脉。轻柔地将其经主动脉瓣送入左心室（LV）。监测左心室压力信号，以确保导管尖端位置正确。左心室压力示例见图1。
2. 将单相动作电位电极轻压于心室心外膜表面。监测信号以获得合适的动作电位测量结果。信号中存在轻微的运动伪影属于正常现象。
3. 将双极刺激电极置于右心房以起搏心脏。在本实验方案中，心脏起搏周期长度设置为300至150毫秒，分别对应200至400次/分钟的心率。
4. 测量左心室心外膜表面温度。若实验要求维持温度在37 °C，则应将心脏置于水套式心脏腔室中，或将其浸入预热的灌流液浴槽中，以在整个心脏组织中维持恒定温度。
5. 放置CCD相机（Andor iXon DV860，128×128像素），并调节镜头焦距，以获得合适的视野。相机连接至工作站，使用Andor SOLIS软件以每秒2帧的速度采集图像。
6. 成像开始前打开汞灯。光线通过激发滤光片（350±25 nm，Chroma Technology）进入光纤导光管（Horiba Jobin Yvon型号1950-1M），从而照亮心脏表面。紫外光在导光管中的衰减较小。也可使用高功率LED系统提供紫外照明，该系统包括LED聚光灯（Mightex PLS-0365-030-S）和控制单元（Mightex SLC-SA04-US）。
7. 关闭室内光源并尽量减少环境光照。将导光管端帽（或LED聚光灯）对准心脏，以实现心外膜均匀照明。发射的NADH荧光（fNADH）穿过发射滤光片（460±20 nm，Chroma Technology）后由CCD相机成像。
8. 通过成像软件选择感兴趣区域，以随时间监测fNADH的变化。选择实时更新模式，以监测感兴趣区域内平均像素强度的变化。
9. 心脏应处于双心室工作模式，以产生适当的压力。fNADH水平应在心外膜表面保持较低且稳定，以确认冠状动脉灌注充分。此时应实施特定的实验方案以验证假设。
10. 实验结束后，将心脏从系统中取出并排空所有灌流液。用纯水冲洗系统管路和腔室。为进行常规维护，应根据需要定期使用Mucasol溶液或稀释的过氧化氢溶液冲洗系统。

5. fNADH 图像的离线处理

1. 比较不同实验中 NADH 数据集（fNADH(i,j,t)）的一种方法是使用数据集中的参考图像（fNADH(i,j,t₀)）对每幅荧光图像进行归一化处理⁹，如下方公式所示。另一种归一化 NADH 荧光的方法是在实验前将一小块铀玻璃置于视野中^{9, 18, 19}。当用紫外光照射时，铀玻璃会在 450 - 550 nm 范围内产生荧光，提供一个可用作稳定参考的信号。

6. 代表性结果

显示了双心室工作兔心脏制备的前视图和基底部视图 图1通过将压力换能器导管（Millar SPR-407）经主动脉瓣送入左心室，测量左心室压力。主动脉、肺动脉和左心室压力（LVP）如图所示。 图1C舒张期左心室压（LVP）通常介于 0 至 10 mmHg 之间。主动脉最小舒张压约为 60 mmHg。收缩期峰值左心室压取决于充盈压（前负荷或左心房压）和心肌收缩力，理想情况下应介于 80 至 100 mmHg 之间。最大主动脉压与最大左心室压应高度一致，如图所示。 图1C.

典型的兔心单相动作电位（MAP）具有快速去极化相和复极化相，如图1D所示。MAP可相对容易地从跳动的心脏记录获得，但在舒张期通常会出现较小的运动伪影，如图1D所示。MAP可用于确认起搏期间心脏成功同步（即捕获），也可用于测量由缺血或其他急性干扰引起的局部电生理变化。此外，还可通过将心脏浸入温热灌流液浴中，并在心脏左右两侧的浴液中各放置一个电极来测量心电图（ECG）。第三个无关电极可置于远离心脏的浴液中，或连接至主动脉。ECG可提供有关整体兴奋与复极化过程的信息，有助于评估心脏的整体电活动功能，并揭示是否存在缺血。

fNADH 成像可揭示心脏线粒体氧化还原状态的变化，可用于测量缺血或缺氧区域在时空上的进展。本研究中，通过测量心外膜 fNADH 来监测在 300、200 和 150 毫秒周期长度（CL）下三种起搏频率期间氧化还原状态的变化。来自感兴趣区域（红色方框，图 2）的平均 fNADH 值显示，随着周期长度缩短，基础 fNADH 水平升高。当起搏频率接近窦性心律（CL = 300 毫秒）时，基础 fNADH 水平相对稳定。当周期长度短于 300 毫秒时，基础 fNADH 水平上升，并在最短周期长度（150 毫秒）时上升幅度最大。在 200 和 400 bpm 下对整个前表面进行高分辨率 fNADH 成像的结果如 图 3 所示。在 200 bpm 时，fNADH 水平保持恒定且空间分布均匀；而在 400 bpm 时，心外膜各区域的 fNADH 水平均显著升高，并表现出明显的空间异质性，其中右心室和左心室的室间隔区域升高最为显著。

NADH 荧光信号随心脏收缩（运动伪影）而振荡，其振荡频率对应心率（图 2）。在双心室插管过程中，心脏基底部由 4 根插管固定，有助于防止心脏在收缩时摆动。因此，振荡幅度始终小于由缺血或缺氧引起的 NADH 荧光信号在较长时程（5–10 秒）上的变化趋势。

图1. 离体双心室工作兔心脏的典型压力和单相动作电位。A. 心脏基底部视图，显示四个插管位置：1，主动脉；2，肺动脉；3，左心房；和4，右心房。B. 心脏前视图，显示左心室（LV）和右心室（RV）。C. 典型压力图。上图：左心室压力（实线）和主动脉压力（虚线）。下图：肺动脉压力。D. 典型单相动作电位。该信号与C图所示压力对齐。 点击此处查看大图。

图 2. 离体双心室工作兔心的fNADH成像。上图： 显示视野示意图（左）及三幅fNADH图像。每幅图像上标注了相应的起搏周期长度（CL）。下图中fNADH信号的兴趣区域由红色方框标示。单相动作电位电极的尖端位于兴趣区域右侧。如图 5所示，使用汞灯和导光管照射心外膜。仅照射兴趣区域周围的心外膜表面。下图： 上图中红色方框所示兴趣区域的平均fNADH。随着周期长度缩短，平均fNADH升高。

图 3. 离体双心室工作兔心全心前表面的fNADH图像。 心脏由右心房（RA）起搏，频率分别为200 bpm和400 bpm。在使用两个高功率LED（Mightex PLS-0365-030-S，365 nm，4%强度，最大50 mW）照射整个前部心外膜的同时，对fNADH进行成像（2帧/秒，128×128像素，分辨率为0.4 mm）。

讨论

离体的朗根多夫（Langendorff）灌注心脏仍是研究心脏生理学的重要工具²。该方法在心脏心律失常研究中尤其有用，特别是结合跨膜电位荧光成像的研究²⁰。其优势之一在于可以完整观察离体心脏的整个心外膜^{21, 22}。另一个优势是，与血液不同，使用透明的晶体缓冲液进行灌注不会干扰荧光信号。其局限性在于，朗根多夫技术不太适用于心脏代谢研究，后者通常需要心脏在生理前负荷和后负荷压力条件下做功。

为了提高离体心脏制备在代谢研究中的相关性，Neely 对 Langendorff 技术进行了改进，以建立适当的左心室（LV）前负荷和后负荷压力³。该模型被称为离体左心室工作心脏模型，已被广泛用于研究左心室功能和代谢^4-6。与 Langendorff 模型相比，左心室工作心脏模型在功能评估方面更具优势，但它无法提供一个适当负荷的右心室（RV）。Demmy 等 首次报道了一种双心室模型（LV 和 RV），作为对左心室工作心脏模型的改进^{7, 8}。他们发现，将心脏从左心室工作模式转换为双心室工作模式后，每搏输出量、心输出量以及压力发展均得到改善⁸。一个适当负荷的右心室还可通过减少室间隔上的异常压力梯度来改善室间隔功能。研究表明，双心室工作心脏可在长达 3 小时内维持主动脉输出、肺血流、平均主动脉压、平均肺动脉压、心率以及心肌 ATP 和磷酸肌酸水平⁸。双心室工作心脏研究通常采用大鼠和兔等小动物的心脏，因为其心输出量及所需灌注液体积远小于大型动物心脏。然而，也有研究使用猪、犬甚至人类心脏进行双心室工作心脏实验^{23, 24}。

在双心室工作模式下，离体心脏的代谢需求显著高于Langendorff灌注模式。灌注液必须提供充足的氧气和代谢底物，以维持双心室心脏功能。标准的晶体缓冲液，如Krebs-Henseleit^{16, 17, 25}或Tyrodes^{26, 27}，其溶氧量最高可达5.6 mg/L。当这些溶液用碳氧混合气体（由95% O₂和5% CO₂组成的混合气体）饱和，并含有适当的代谢底物（葡萄糖、右旋糖和/或丙酮酸钠）时，适用于以正常窦性心率跳动的双心室工作心脏（兔心约为180次/分钟）。

快速节律会增加代谢需求，而标准灌注液中溶解的氧气量可能不足以完全支持以高速收缩的双心室工作心脏。在工作心脏制备中，已使用含有红细胞或与全血混合的晶体缓冲液，以确保充足的氧气供应。先前的研究表明，在Krebs-Henseleit溶液中添加红细胞可改善在严格起搏方案期间工作心脏的功能，并降低心室颤动的发生率¹⁶。使用红细胞或全血混合物的一个局限性在于，血红蛋白会干扰用于荧光成像的光波长¹³。其他底物（如白蛋白）也可添加至灌注液中，以延长心脏存活时间并减轻水肿²⁸。

在荧光成像过程中，激发光的强度应足够高，且光照分布应均匀。由于心外膜表面具有曲率，实现均匀照明并不总是容易的。在我们的研究中，通过汞灯发出的光经滤光后（350±25 nm）用于成像fNADH。采用分叉式光纤导光管将紫外光引导至心外膜表面。通过适当调整两个输出端陶瓷套管的位置，可实现均匀照明。紫外LED光源也可用于此目的，如图3所示。LED光源相对便宜，因此可在成像系统中集成多个光源。此外，LED还可以高速周期性地开关，以使激发光与图像采集同步。

应通过减少组织照明时间来尽量减少NADH的光漂白²⁹。这可以通过使用电子快门和光源或LED照明系统配合控制器，周期性地开关照明来实现。如果将照明与心动周期同步，则可将fNADH图像采集限制在舒张期，从而减少荧光信号中的运动伪影。利用压力信号（如左心室压力）触发照明和图像采集是实现这一目标的一种方法。

在我们的研究中观察到，400 bpm 时每单位时间内 fNADH 的变化量可比 200 bpm 时高出 5 倍以上。这表明快速节律会升高心脏的氧化还原状态。这种现象是否由缺氧引起，或源于心肌细胞无法足够快地将 NADH 氧化为 NAD+ 从而导致 NADH 积累，目前仍是一个未解的问题。

双心室工作心脏制备的性能取决于多种因素。其中最重要的因素之一是设定适当的前负荷和后负荷压力，以模拟所研究的生理条件。特别是左心室后负荷（主动脉压）必须调整至代表体循环压力的水平。如果压力过高，左心室将无法克服该阻力，导致血液反流；而压力过低则会不利地影响冠状动脉灌注。左心室前负荷压力（左心房压力）也应进行调整，以提供符合实验方案要求的舒张末期容积。

活体组织中fNADH成像是一种成熟的荧光成像方法¹³。Barlow和Chance在结扎冠状动脉后，首次在区域性缺血的心肌组织中观察到fNADH显著升高，从而展示了该技术在心脏组织中的应用¹⁴。他们的fNADH图像使用Fairchild示波器相机结合紫外闪光摄影技术记录在胶片上。Coremans 等 进一步拓展了这一概念，利用NADH荧光与紫外反射率的比值来测量Langendorff灌流大鼠心脏心外膜的代谢状态³⁰。该研究采用视频荧光计进行成像，并使用录像机记录数据。随后，Scholz 等 使用光谱仪和光电二极管阵列测量左心室大范围区域的平均fNADH水平。该方法可减少心外膜荧光的异质性及局部血流差异的影响，同时揭示fNADH与宏观机械做功相关的变动规律³¹。这种方法类似于在fNADH成像数据集的所有帧中，对感兴趣区域计算平均fNADH水平，如图2所示。正如本文所述，当前的技术已具备高速CCD相机和数字控制的高功率紫外光源。这些技术进步使得从多个新角度研究fNADH及心脏代谢的时空动态成为可能。由于光学系统和光源成本相对较低，fNADH成像已成为传统心脏光学标测系统的实用辅助手段^{9, 32}。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma-Aldrich	S-3014
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-500G
CaCl2	Fisher Scientific	C77-500
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-7506
NaHCO3	Fisher Scientific	S-233
KH2PO4	Fisher Scientific	423-316
葡萄糖	Sigma-Aldrich	158968-500G
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256-25G
白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418-100G