Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em> Drosophila</em> Los tejidos para análisis de expresión génica

Summary

Tejidos de Drosophila a menudo contienen una mezcla heterogénea de tipos celulares. Para examinar la expresión génica en tipos de células específicas de un tejido particular, los núcleos pueden ser etiquetados genéticamente y aislados posteriormente utilizando un enfoque basado en la afinidad. Núcleos aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores tales como análisis de la expresión génica y la inmunoprecipitación de la cromatina.

Abstract

Tejidos de embriones y larvas de Drosophila melanogaster a menudo contienen una mezcla altamente heterogénea de tipos de células, lo que puede complicar el análisis de la expresión génica en estos tejidos. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, puede ser necesario aislar los tipos de células específicas con alta pureza y con rendimientos suficientes para aplicaciones posteriores tales como el perfil transcripcional y de inmunoprecipitación de la cromatina. Sin embargo, la morfología celular irregular en tejidos tales como el sistema nervioso central, junto con la población rara de tipos específicos de células en estos tejidos, puede plantear problemas para los métodos tradicionales de aislamiento de células, tales como la microdisección láser y de células activadas por fluorescencia (FACS) . Aquí, un enfoque alternativo para la caracterización de los perfiles de expresión de genes específicos de células usando el aislamiento basado en la afinidad de los núcleos marcados, en lugar de células completas, se describe. Núcleos de la c específicaTipo de interés ell están etiquetados genéticamente con un sobre-localizada etiqueta EGFP nuclear utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS. Estos núcleos EGFP-etiquetados se pueden aislar utilizando anticuerpos contra la GFP que están acoplados a perlas magnéticas. El enfoque descrito en este protocolo permite el aislamiento consistente de los núcleos de tipos de células específicas en el sistema nervioso central de Drosophila larvas en alta pureza y en niveles suficientes para el análisis de expresión, incluso cuando estos tipos de células comprenden menos del 2% de la población total de células en el tejido. Este enfoque se puede utilizar para aislar los núcleos a partir de una amplia variedad de Drosophila embrionario y tipos de células de larvas utilizando controladores específicos Gal4, y puede ser útil para el aislamiento de núcleos de tipos de células que no son adecuados para FACS o microdisección por láser.

Introduction

Tejidos de Drosophila tales como el sistema nervioso central contienen una mezcla compleja de tipos de células. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, es primero necesario aislar una población homogénea de células específicas en cantidades suficientes para permitir que las aplicaciones posteriores. Métodos para aislar células de tejidos intactos incluyen microdisección por láser, y de células activadas por fluorescencia (FACS) de células enteras. Mientras FACS se ha utilizado para aislar las células y los núcleos de embriones de Drosophila y de Caenorhabditis elegans para la expresión génica y la cromatina de perfiles de ^1-3, FACS y microdisección por láser puede ser difícil de realizar con éxito en los tejidos que contienen tipos de células altamente mezclados o que las células con contener morfología irregular, tales como neuronas. Para superar esta dificultad, los núcleos en lugar de las células se pueden aislar a partir de tipos de células específicos y se utilizan para la posterior generaciónde perfiles de expresión de correo. Es importante destacar que el análisis de la expresión de mRNA microarrays basado en el uso de muestras de ARN nucleares muestra resultados generalmente comparables con la realizada utilizando ARN total ^{4, 5.} Por otra parte, el análisis de la expresión génica usando ARN nuclear ha sido utilizado con éxito para estudiar la expresión génica en varios organismos, incluyendo C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, y los seres humanos ^{4, 5 2, 3.}

Varios enfoques han sido recientemente descrita para el aislamiento de poblaciones específicas de núcleos marcados de tejidos de Drosophila que son adecuados para el análisis de la expresión génica y / o la inmunoprecipitación de la cromatina. El aislamiento lote de cromatina específica de tejido para el método de inmunoprecipitación (BITS-CHIP) utiliza FACS para aislar los núcleos fijos sobre la base de la expresión específica de tipo celular de GFP-nuclear localizada ^2. Este enfoque ha sido doccessfully utilizado para analizar la distribución de las modificaciones de histonas y los factores de transcripción de la cromatina utilizando inmunoprecipitación de núcleos aislados a partir del mesodermo de Drosophila embriones ^2. Sin embargo, los enfoques basados ​​en FACS pueden ser menos adecuado para el aislamiento de núcleos marcados que constituyen sólo una pequeña proporción de una población mixta debido al aumento del tiempo de tipo necesario para obtener números adecuados para aplicaciones posteriores. Para superar estas limitaciones, varios grupos han utilizado técnicas de aislamiento basados ​​en afinidad para purificar los núcleos que están etiquetados con un epítopo específico de un tipo de célula particular. El aislamiento de los núcleos marcados en tipos de células específicos de método (INTACTO) desarrollados para su uso en Arabidopsis thaliana ^{6, 7} ha sido recientemente adaptado para su uso en Drosophila ^8. En este método, una proteína de fusión envoltura nuclear que es un sustrato para la biotinilación en vivo es coexpressed con la Escherichia coli biotina ligasa BirA en tipos celulares específicos. Núcleos marcados con biotina pueden ser posteriormente purificados a partir de poblaciones mixtas que utilizan el aislamiento de afinidad basada-estreptavidina. El uso de este enfoque, los núcleos fueron etiquetados con éxito y aislados del mesodermo de embriones de Drosophila en la que una proteína de fusión envoltura nuclear se expresó bajo el control de un promotor-mesodermo específica ^8. Los autores también generaron proteínas de fusión de la envoltura nuclear que se pueden expresar en cualquier tipo de célula bajo el control de la secuencia reguladora de Gal4, UAS ^9. Este enfoque es capaz de subconjuntos de núcleos marcados de poblaciones mixtas aislar rápidamente, pero requiere tres construcciones transgénicas independientes y por lo tanto puede ser inadecuado para aplicaciones particulares genéticos. Recientemente, un enfoque ha sido descrito en el que dom (S AD1 y de la ONU C-84), las proteínas que contienen el dominio que se localizan en la membrana interna de la envoltura nuclear fueron etiquetados conproteínas fluorescentes y expresado bajo el control del sistema de Gal4/UAS ^10. Los núcleos se aislaron en presencia de detergente no iónico para eliminar la membrana externa de la envoltura nuclear, y se purificó por afinidad usando perlas magnéticas acopladas a anticuerpos anti-GFP. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para aislar las poblaciones pequeñas de núcleos marcados de subtipos neuronales específicos en el cerebro adulto de Drosophila ^10.

Aquí, se describe un protocolo para el aislamiento de núcleos marcados de una población mixta de células de tejido de larvas de Drosophila. Este método fue desarrollado de forma independiente, pero es similar al enfoque descrito por Henry et al. ¹⁰ En primer lugar, los núcleos fueron marcadas con una etiqueta fluorescente que se expresa sólo en tipos de células específicos en Drosophila melanogaster para facilitar el posterior aislamiento de los núcleos etiquetados de poblaciones mixtas utilizando un enfoque basado en la afinidad. Para etiquetar núcleos,Se utilizó el dominio KASH (K larsicht / A nc-1 / S ino h omology). El dominio KASH es un dominio transmembrana que se localiza en la membrana externa de la envoltura nuclear, en parte a través de interacciones con proteínas que contienen el dominio dom dentro del espacio perinuclear ^11. El dominio KASH C-terminal de las proteínas tales como Drosophila MSP-300 y Klarsicht ancla estas proteínas a la membrana nuclear externa, mientras que sus dominios N-terminal de interactuar con las proteínas del citoesqueleto, tales como actina o los microtúbulos en el citoplasma ^12-14. Las construcciones se generaron en el que el dominio KASH de Drosophila MSP-300 se fusiona al C-terminal de EGFP, bajo el control de la secuencia reguladora de Gal4, UAS en el vector pUAST-attB ^{15, 16.} Uso de integración específica de sitio phiC31, se generaron moscas transgénicas en las que los UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH transgén se inserta en los loci en el cromosoma attP23L ^17. La UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH moscas pueden ser cruzado con moscas que expresan el controlador de Gal4 en un tipo de célula particular, que resulta en la expresión dirigida de EGFP en la membrana nuclear externa en el tipo celular de interés. Núcleos marcado puede entonces purificarse a partir de poblaciones de células mixtas usando anticuerpos frente a GFP acoplados a perlas magnéticas. En este enfoque, no se requiere el uso de detergente no iónico porque la etiqueta EGFP se localiza en el lado citoplásmico de la membrana nuclear externa, y por lo tanto es accesible a los anticuerpos.

El protocolo descrito a continuación se puede utilizar para aislar / enriquecer núcleos EGFP marcado de tipos de células específicas en los tejidos de las larvas de Drosophila, para cuantificar la pureza y el rendimiento de núcleos aislados, y para extraer ARN nuclear adecuado para la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QRT -PCR), análisis de la expresión génica. El aislamiento y la purificación por afinidad de los núcleos (excluyendo tissue disección) se puede realizar en menos de una hora. Los resultados se presentan mostrando que los núcleos gliales se pueden aislar con éxito desde el lóbulo óptico de las larvas y el ojo disco imaginal, y se utilizaron para el análisis de la expresión génica posterior. Se prevé que este enfoque será útil para el aislamiento / enriquecimiento de núcleos marcados a partir de tejidos de embriones y larvas en el que las células diana constituyen menos del 5% de la población general. Todas las poblaciones de Drosophila y plásmidos generados en este estudio están disponibles a partir de los autores que lo soliciten.

Protocol

1. Generación y caracterización de EGFP :: KASH de Drosophila Controlador Cruz Gal4 vuela a UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vuela. Alternativamente, moscas recombinantes que llevan tanto el conductor de Gal4 y el transgén UAS-EGFP :: MSP-300 KASH se pueden generar usando técnicas genéticas estándar. Este segundo enfoque es ventajoso si se requieren un gran número de progenie. Caracterizar la expresión del marcador EGFP :: KASH usando…

Representative Results

El conductor repo-GAL4 (Bloomington código RS 7415) se expresa específicamente en las células gliales en el sistema nervioso de Drosophila en múltiples etapas de desarrollo 18. Las moscas se generaron que expresa de manera estable UAS-EGFP :: MSP-300 KASH bajo el control del controlador de repo-GAL4 utilizando técnicas genéticas estándar. Para caracterizar el patrón de expresión de la EGFP :: KASH transgén en estas moscas, se examinó el patrón de expr…

Discussion

Este protocolo se puede utilizar para aislar o enriquecer altamente específicamente etiquetados núcleos de poblaciones de células mixtas en embriones de Drosophila o tejidos de larvas. Usando este protocolo, los núcleos se pueden aislar a partir de tejidos disecados en aproximadamente 1 hora. La pureza y el rendimiento de los núcleos aislados deben determinarse experimentalmente para cada tipo de célula. Puede ser difícil de cuantificar los núcleos de talón unida en la etapa de post-aislamiento del pro…

Materials

Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9 well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L