Tejidos de Drosophila a menudo contienen una mezcla heterogénea de tipos celulares. Para examinar la expresión génica en tipos de células específicas de un tejido particular, los núcleos pueden ser etiquetados genéticamente y aislados posteriormente utilizando un enfoque basado en la afinidad. Núcleos aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores tales como análisis de la expresión génica y la inmunoprecipitación de la cromatina.
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Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de
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Resumen
Resumen
Tejidos de embriones y larvas de Drosophila melanogaster a menudo contienen una mezcla altamente heterogénea de tipos de células, lo que puede complicar el análisis de la expresión génica en estos tejidos. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, puede ser necesario aislar los tipos de células específicas con alta pureza y con rendimientos suficientes para aplicaciones posteriores tales como el perfil transcripcional y de inmunoprecipitación de la cromatina. Sin embargo, la morfología celular irregular en tejidos tales como el sistema nervioso central, junto con la población rara de tipos específicos de células en estos tejidos, puede plantear problemas para los métodos tradicionales de aislamiento de células, tales como la microdisección láser y de células activadas por fluorescencia (FACS) . Aquí, un enfoque alternativo para la caracterización de los perfiles de expresión de genes específicos de células usando el aislamiento basado en la afinidad de los núcleos marcados, en lugar de células completas, se describe. Núcleos de la c específicaTipo de interés ell están etiquetados genéticamente con un sobre-localizada etiqueta EGFP nuclear utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS. Estos núcleos EGFP-etiquetados se pueden aislar utilizando anticuerpos contra la GFP que están acoplados a perlas magnéticas. El enfoque descrito en este protocolo permite el aislamiento consistente de los núcleos de tipos de células específicas en el sistema nervioso central de Drosophila larvas en alta pureza y en niveles suficientes para el análisis de expresión, incluso cuando estos tipos de células comprenden menos del 2% de la población total de células en el tejido. Este enfoque se puede utilizar para aislar los núcleos a partir de una amplia variedad de Drosophila embrionario y tipos de células de larvas utilizando controladores específicos Gal4, y puede ser útil para el aislamiento de núcleos de tipos de células que no son adecuados para FACS o microdisección por láser.
Introducción
Tejidos de Drosophila tales como el sistema nervioso central contienen una mezcla compleja de tipos de células. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, es primero necesario aislar una población homogénea de células específicas en cantidades suficientes para permitir que las aplicaciones posteriores. Métodos para aislar células de tejidos intactos incluyen microdisección por láser, y de células activadas por fluorescencia (FACS) de células enteras. Mientras FACS se ha utilizado para aislar las células y los núcleos de embriones de Drosophila y de Caenorhabditis elega....
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Protocolo
1. Generación y caracterización de EGFP :: KASH de Drosophila
- Controlador Cruz Gal4 vuela a UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vuela. Alternativamente, moscas recombinantes que llevan tanto el conductor de Gal4 y el transgén UAS-EGFP :: MSP-300 KASH se pueden generar usando técnicas genéticas estándar. Este segundo enfoque es ventajoso si se requieren un gran número de progenie.
- Caracterizar la expresión del marcador EGFP :: KASH usando técnicas de microscopía estándar. Nota: EGFP expresión se puede observar mediante técnicas de microscopía estándar en los tejidos de Drosophila dise....
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Resultados
El conductor repo-GAL4 (Bloomington código RS 7415) se expresa específicamente en las células gliales en el sistema nervioso de Drosophila en múltiples etapas de desarrollo 18. Las moscas se generaron que expresa de manera estable UAS-EGFP :: MSP-300 KASH bajo el control del controlador de repo-GAL4 utilizando técnicas genéticas estándar. Para caracterizar el patrón de expresión de la EGFP :: KASH transgén en estas moscas, se examinó el patrón de expresión de GFP.......
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Discusión
Este protocolo se puede utilizar para aislar o enriquecer altamente específicamente etiquetados núcleos de poblaciones de células mixtas en embriones de Drosophila o tejidos de larvas. Usando este protocolo, los núcleos se pueden aislar a partir de tejidos disecados en aproximadamente 1 hora. La pureza y el rendimiento de los núcleos aislados deben determinarse experimentalmente para cada tipo de célula. Puede ser difícil de cuantificar los núcleos de talón unida en la etapa de post-aislamiento del protocolo us.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a Janice Fischer para proporcionar el plásmido UAS-EGFP :: Msp-300 KASH. El anticuerpo mAB24B10 se obtuvo del Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Biología. El stock de repo-GAL4 (BL7415) se obtuvo del Stock Center Bloomington en Indiana University. El apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer Institucional Investigación Grant (IRG # 58-006-53) al Centro de la Universidad de Purdue para la Investigación del Cáncer se agradece. Jingqun Ma se apoya en una Investigación Agrícola de Purdue ayudantía en la Agricultura y la....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo anti-chaoptina (monoclonal de ratón) | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | mAB24B10 | |
| Anticuerpo anti-GFP (monoclonal de ratón) | Roche | 11814460001 | Este anticuerpo específico se recomienda para este protocolo. Sin embargo, también se podrían utilizar anticuerpos alternativos. |
| 2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix con ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, sal de diclorhidrato) | Biotium | 40011 | |
| Homogeneizador de onzas (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Pinzas, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G para inmunoprecipitación | Invitrogen | 10003D | Esta marca específica de perlas magnéticas está recomendada para este protocolo. |
| EpiScript Transcriptasa Inversa | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Filtros de células Falcon, 40 μ m tamaño de poro | VWR | 21008-949 | Se pueden utilizar tamaños de poro alternativos, dependiendo del tamaño de los núcleos de las células objetivo. |
| Soporte magnético (8 tubos de 1,5 ml) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini rotador de tubos | Genemate | H-6700 | |
| Qubit kit de inicio | Life Technologies | Q32871 | Se podrían utilizar métodos similares basados en fluorescencia para cuantificar el rendimiento de ARN. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | El uso de este reactivo para inactivar ARNasas es opcional. |
| Máquina RT-PCR Termociclador | BioRad | CFX Connect Termociclador | |
| Placa de vidrio siliconada de 9 pocillos | Hampton Research | HR3-134 | |
| Estereomicroscopio Adaptador de fluorescencia (Royal Blue (440-460 nm) excitación + barrera amarilla | Nightsea | Este adaptador permite examinar la fluorescencia GFP utilizando un microscopio de disección típico (por ejemplo, Nikon) | |
| Microscopio StereoZoom 83604 Set con oculares de campo amplio 10X y soporte de brazo universal | Nikon | SMZ 745 | |
| Termociclador | BioRad | T100 | |
| Reactivo Trizol | Technologies 15596018 | PRECAUCIÓN; Se pueden utilizar métodos alternativos de extracción de ARN. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
Referencias
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chro....
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Reimpresiones y permisos
