This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
Det apoplast är en distinkt extracellulära rummet i växtvävnader som ligger utanför plasmamembranet och innefattar cellväggen. Den apoplastiska utrymme blad är platsen för flera viktiga biologiska processer, inklusive cellvägg bildning, cellulär näringsämne och vattenupptag och export, växt entofyt interaktioner och försvars svar på patogener. Den infiltration-centrifugeringsmetoden är väl etablerad som en robust teknik för analys av den lösliga apoplast sammansättningen av olika växtarter. Vätskan som erhålls med denna metod är allmänt känd som apoplast tvättvätska (AWF). Följande protokoll beskriver en optimerad vakuuminfiltrering och centrifugeringsmetoden för AWF extraktion från Phaseolus vulgaris (böna) ev. Tendergreen blad. Begränsningarna av denna metod och optimering av protokollet för andra växtarter diskuteras. Återvunna AWF kan användas i ett brett spektrum av experimen nedströmsts som försöker karakterisera sammansättning apoplasten och hur den varierar till följd av växtarter och genotyp, växtutveckling och miljöförhållanden, eller att avgöra hur mikroorganismer växer i apoplast vätska och reagera på förändringar i dess sammansättning.
Anläggningen apoplast är den intercellulära utrymmet som omger växtceller. Detta är en dynamisk miljö där många metaboliska processer och transportprocesser ske. Den största strukturella komponenten i apoplasten är cellväggen, som monteras och modifieras av enzymer, strukturella proteiner och metaboliter ligger inom apoplasten. Hos friska växtceller apoplasten upprätthålls generellt i en sur tillstånd möjliggör aminosyror, socker och andra näringsämnen som skall importeras från apoplasten till cytoplasman av H + symport 1. Under sackaros transporter, sackaros flyttar från fotosyntetiska källor via apoplasten och in floem kärl; sackaros transporteras sedan genom en osmotisk potential underhålls av apoplastisk invertaser klyvnings sackaros i diskhon organen 2. Socker och andra näringsämnen kan också transporteras uppåt och ansamlas i stomatala kaviteter genom transpiraströmmen 3.
"> Den apoplast representerar också en miljönisch där många patogener fastställa deras parasit livsstil. Bakteriella växtpatogener har förmågan att föröka till höga tätheter i apoplasten, som de har tillgång genom naturliga öppningar såsom klyvöppningar eller genom sår fyra. Koncentrationen av amino syror och andra kväveföreningar i tomat apoplast har visat sig vara tillräckligt för att stödja näringsbehov bakterie- och svamp patogener 5,6. Primära försvarssvar mot mikrobiella patogener förekommer även i apoplasten, nämligen produktionen av reaktiva syreradikaler genom extracellulära peroxidaser . och oxidaser och en förstärkning av cellväggen genom tvärbindning och callose nedfall 7 växtcellvägg är rik på sekundära metaboliter med antimikrobiella aktiviteter, den biokemiska naturen hos dessa sekundära metaboliter varierar mellan arter 8.Som ett resultat av den ovan nämnaEd och andra processer, blad apoplastiska fluiden innehåller en mängd olika proteiner, sockerarter, organiska syror, aminosyror, sekundära metaboliter, metaller och andra katjoner (t.ex., Mg2 +, K +, Na +, Ca2 +, Fe 3/2 +). Lösta koncentrationer i apoplast av skott styrs till stor del av balansen mellan transportprocesser som sker mellan apoplasten och xylem, floem och cytoplasma 9. Men metaboliska reaktioner och mikrobiell tillväxt konsumerar också eller producerar apoplastisk lösta ämnen. Sammansättningen av apoplasten är känd för att skilja sig mellan växtarter och genotyper och som svar på förändrade miljöförhållanden inklusive ljus, näring och biotisk och abiotisk stress 9. Genom att studera sammansättningen av apoplasten och hur det förändras, inklusive egenskaper såsom redox och osmotisk potential, pH, näring / metabolit tillgänglighet och enzymatiska aktiviteter, kan man få nya insikter i hur växter restämmer till sin miljö. Förståelse eller karakterisera de molekylära förändringar som sker i apoplasten lösningen är komplicerat eftersom det är ett rumsligt strukturerad och dynamisk fack där metaboliter och / eller joner kan vara volatil, övergående eller associerad med cellväggen och plasmamembranet. Dessutom är olika analysmetoder som krävs för att täcka den rad olika kemiska typer.
För att studera sammansättningen av lösliga apoplast behöver vätska brukar extraheras från vävnaden. Det finns flera metoder för att utvinna apoplast vätska från olika vävnader, däribland en nyligen föreslagna filter remsmetoden 10, men den mest etablerade extraktionsmetod för löv är infiltration-centrifugering. Denna teknik har utvärderats tidigare 11-13 och Lohaus et al. 2001 14 ge en grundlig undersökning av många av metodens tekniska parametrar. Som namnet antyder, infiltration-centrifugesöknings teknik är en metod i två steg som i huvudsak inbegriper utbyte av den apoplastiska luftrummet med en vattenbaserad infiltration vätska, vilket blandar sig med den nativa apoplastiska vätska, följt av utvinning av infiltration / apoplastiska fluidblandningen genom försiktig centrifugering av bladen. Som det återvunna fluiden utspädes och innehåller inte alla föreningar som finns i apoplasten (se nedan) är denna vätska allmänt känd som apoplasten tvättfluidum (AWF), eller ibland intercellulär tvättfluidum, snarare än apoplastiska vätska. Infiltreringen-centrifuge teknik är skalbar tillåter enkla eller sammanslagna AWF prover av lämplig volym som skall genereras och utsattes för en lång rad nedströms biokemiska och analystekniker (t.ex. proteinelektrofores, enzymaktivitetsmätning, NMR, många typer av kromatografi och massa spektrometri). Leaf AWF är också användbart som en apoplasten mimicking tillväxtmedium för att studera interaktionen av växt koloniserande mikrober with deras miljö 5.
I följande protokoll beskriver vi hur du utför infiltrationen-centrifuge teknik med hjälp av Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen blad och ge några exempel på analyser nedströms med fokus på metabolomik. Viktigt metoder bedöma kvaliteten på AWF tillhandahålls tillsammans med råd för att optimera förfarandet för olika blad.
Optimering av växtvävnadskällan
Biologisk och teknisk variation kan vara stora när du utför apoplast extraktioner, alltså en mycket standardiserad arbetsflöde är bra att öka kontinuiteten mellan experiment (figur 1). Viktigt måste källan av växtvävnad standardiseras, inklusive blad typ, blad ålder, tillväxt / miljöförhållanden och tid på dagen (tabell 1). Stora skillnader föreligger i den lätthet med vilken olika bladen infiltreras och AWF utvanns därefter genom centrifugering; dessa skillnader är korrelerade med klyvöppningar nummer, hålstorlek och mesophyll motståndet 12,14. Även bland olika sorter av P. vulgaris det finns stora skillnader i den lätthet och avkastningen av AWF extraktionsmetod; till exempel blad från Tendergreen sorten som används här är mer mottagliga för AWF extraktion med hjälp av denna metod än den kanadensiska Wonder sorten. InomP. vulgaris de första riktiga bladen är de största och lättast att infiltrera, vilket gör dem till självklara valet för apoplastisk extraktioner. Den apoplastiska luft och vatten volym har visat sig variera med blad ålder i flera arter som leder till skillnader i AWF extraherbarhet 12,14. I P. vulgaris, äldre blad blir avsevärt svårare att infiltrera och ger mindre AWF vid centrifugering; Därför löv skördades när de nådde full expansion. Löv som är svåra att infiltrera därefter kräva högre centrifuge hastigheter att återvinna AWF. Man bör därför noga screena flera olika typer blad och sorter innan beslut fattas om en vävnadskälla för storskaliga AWF extraktioner.
Växt tillväxtbetingelser måste också standardiseras så mycket som möjligt inom ramen för experimentet. Användningen av växtkammare är att föredra eftersom de möjliggör konsekvent luftfuktighet, temperatur och light intensitets regementen upprätthållas. Skörd av blad bör alltid ske vid samma tid på dagen, eftersom koncentrationerna av metaboliter, enzymer etc. varierar hela dygnscykeln 14. Slutligen, för att säkerställa att anläggningen lämnar alla har liknande saftspänningen bör växterna vattnas snart innan (~ 1 tim) skörden.
Optimering av blad infiltration och centrifugering
Oönskad cytoplasma förorening av AWF grund av partiell cellslys kommer resultera om mekanisk påfrestning stött av cellerna är för hög under infiltrations eller centrifugeringssteg. Därför bör förfarandet för en given blad typ vara en optimerad avvägning mellan att maximera avkastningen och minimera cytoplasma förorening av AWF. I samtliga fall bör man använda lägsta centrifuge hastighet med vilken analysregister kan utvinnas för att undvika eventuell mekanisk sprängning av bladceller. Optimering av centrifugesökningshastigheten bör bestämmas empiriskt för varje typ blad genom att övervaka den återvunna volymen och apoplasten förorening över ett område av centrifugehastigheter. Det har observerats att markörenzymaktiviteter, såsom MDH, G6PDH och glukos-fosfatisomeras, fortsatt låga tills en tröskel centrifugalkraft överskrids, över vilken dessa aktiviteter ökar snabbt, förmodligen på grund av cytoplasmatisk läckage 9,12,14. Användningen av Parafilm för stöd under centrifugeringssteget, som noterats av Baker et al. 2012 11, kan förbättra effektiviteten av AWF utvinning och kan minimera mekaniska skador på bladet bladet orsakas av överdriven vikning och komprimering. Vidare användning av Parafilm förbättrar visualisering av bladet efter centrifugering när man bör undersöka bladet för skador och fullständighet AWF extraktion.
Nouchi 12 beskriver optimering av AWF återhämtning från cut ris bladsektioner, vilka är difficult att infiltrera och kräva högre centrifuge hastigheter för att samla AWF grund av deras små stomatala öppningar. Förbättrad vätning av ris bladytan, antingen genom förblötning bladen i destillerat vatten eller tillsats av ett ytaktivt ämne till infiltrationen vätska, underlättade infiltrationsprocessen. En högre centrifugehastighet (6.000 xg) användes också under övervakning för apoplastisk förorening 12. Vid användning av cut bladsektioner finns det alltid en risk att cytoplasma kontamination blir vanligare även med omfattande tvättning av sårställen; skurna blad bör därför endast användas när det är nödvändigt.
För många studier destillerat vatten används som infiltrations fluiden 11. Emellertid kan föreningarna sättas till infiltrationsvätska, såsom salter eller buffertar, för att förbättra utvinningen av vissa apoplastisk föreningar, särskilt proteiner 13. Lohaus 14 utvärderade effekten av joniska och osmotisk styrka on sammansättningen av den återvunna AWF och funnit dem vara försumbar. Förändringar i pH i infiltrationsmediet kan dock påverka AWF sammansättningen 14.
Korrekt hantering och lagring av den extraherade apoplastiska vätskan är viktigt. AWF har visats innehålla ett överflöd av proteaser och andra enzymer 13,20, samt flyktiga organiska föreningar. Därför, för att reducera ändringar i sammansättningen av analysregister efter återvinning är det rekommenderat att hålla prover på is eller på annat sätt lagras vid -80 ° C. Vidare bör enzymatiska analyser av AWF utföras så snart som möjligt efter extraktion för att begränsa enzyminaktivering på grund av proteolys, långvarig utspädning eller frysning-upptining.
Processen för infiltration späder ut apoplastiska vätska och det är ofta nödvändigt att fastställa omfattningen av denna utspädning. Centrifugeringssteget kan också späda AWF med vatten från intracellulära fack. En utspädningsfaktor behövered att uppskatta in vivo apoplast kemiska koncentrationer när mätningar görs på AWF. Det behövs också en utspädningsfaktor att koncentrera AWF tillbaka till full styrka när den används som en apoplast härma tillväxtmedium för mikrober – alltså matcha in vivo metabolitkoncentrationer så noggrant som möjligt. Flera variationer existera på den metod som beskrivs i steg 4 för att bestämma AWF utspädningsfaktor genom mätning av utspädningen av en markörförening sättes till infiltrationsvätskan. För alla metoder spädberäkningen AWF förutsätter att infiltrationen vätskan inte nämn absorberas eller utspädd med bladcellerna under återställningsprocessen AWF. Detta antagande har tidigare verifierats för infiltration steg 14 men overifierade för centrifugeringssteget. Markörföreningen får inte heller absorberas, transporteras eller modifierad medan apoplasten. Indigokarmin är den mest använda och noggrant testade av färgämnen som användsför AWF utspädnings beräkningar. Indigokarmin visar en låg absorbans till katjonbytarharts och isolerade cellväggar och visades vara lämplig för AWF beräkningar i Brassica napus, Pisum sativum, Solanumlycopersicum och Glycine max 11,21,22. Men i vissa bladtyper, t.ex. ris och gurka, indigokarmin verkade inte återhämtat sig helt efter infiltration, vilket skulle leda till en underskattning av AWF utspädningsfaktorn 12,21. Bristen på återhämtning av indigokarmin kan bero på dess känslighet för klyvning in isatin sulfonat genom superoxid 23, som är känt för att produceras i apoplasten, särskilt under stress 24. Klyvning av indigokarmin i isatin sulfonat kommer att resultera i en förlust av absorbans vid 610 nm och en ökning vid 245 nm. Huruvida denna reaktion sker i nämnvärd omfattning i apoplasten, eller om denna reaktion kan hämmas genom tillsats av superoxid asätare att infiltration vätska har inte undersökts hittills. Blå dextran har använts i stället för indigokarmin för kvantifiering av AWF utspädningsfaktorn i ris bladen 12, även om dess stabilitet och återhämtning i AWF inte har rapporterats. Alternativt kan radioaktivt märkta föreningar, såsom [14 C] sorbitol eller andra kvantifierbara interna standarder användas i stället för färgämnen och minskningen i radioaktivitet eller koncentration mäts och används för beräkning av utspädningsfaktorn på ett analogt sätt 11,14,25.
Begränsningar av tekniken
Några varningar finns för infiltration-centrifuge AWF isoleringsmetod. Först, kan utspädningen av apoplasten under infiltreringen framkalla ett svar från växten. Om den omgivande bladcellerna detekterar en minskad koncentration för vissa komponenter i apoplastiska vätska, kan de svara genom att utsöndra ytterligare metaboliter, förvränga tolkningen av metabolitkoncentrationer. Ien bedömning av detta problem konstaterades att varken tid mellan infiltration och centrifugering eller måttliga skillnader i jonstyrka infiltration vätskan påverkat sammansättningen av den extraherade AWF 14,22. Därför att några artefakter som härrör från apoplast utspädning tros vara minimal.
En andra potentiell nackdel är att eluering av AWF genom centrifugering inte fångar alla de molekyler som är närvarande i apoplasten av flera skäl. Vissa föreningar, i synnerhet katjoner och proteiner kan vara tätt förknippad med den negativt laddade cellväggen och inte eluera med AWF 13. Andra molekyler som proteiner kan vara för stor för att eluera effektivt ur apoplasten vid centrifuge hastigheter används 14. Reaktiva syreradikaler är en viktig klass av förening som produceras i apoplasten, men på grund av den kortlivade karaktären av dessa föreningar, och ospecificerade krav på sin produktion, deras presence är inte väl fångats av AWF extraktion. Det är inte känt hur exakt AWF representerar sammansättningen in vivo av apoplasten vätskan och kan variera mellan arter.
Flera analyser finns för att bestämma cytoplasmatisk förorening, men ingen är allmänt accepterad. Analyser av övervägande cytoplasmiska enzymer (t.ex. G6PDH, hexos fosfatisomeras, MDH) har fördelen av att vara lätt att utföra men kan inte korrelerar väl med cytoplasmatisk läckage 14,18. Bedömningen av cytoplasmiska metaboliter (t.ex., hexos fosfater, klorofyll) är kanske mer vägledande men är mindre väletablerat 11. Ändå kan antingen typ av analys vara användbar för relativ kvantifiering av apoplastisk kontamination mellan prover. Helst bör flera oberoende mätningar användas för att verifiera integriteten av AWF provet.
Samtidigt som vi erkänner sina begränsningar, infiltration-centrifugatipå teknik som beskrivs här är fortfarande en enkel och robust teknik i studiet av apoplastiska proteiner, primära och sekundära metaboliter och oorganiska joner.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
razor blade | Fisher | 12-640 | |
60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
vacuum source | |||
5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
indigo carmine | Sigma | I8130 | |
microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
NADH | Roche | 10128023001 | |
MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
ribitol | Sigma | A5502 | |
methanol | Sigma | 650471 | |
chloroform | Sigma | 472476 | |
vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |