利用菜豆（Phaseolus vulgaris）作为示例的植物叶片质外体液渗透-离心提取技术

摘要

本方案详细介绍了从植物叶片中优化提取质外体洗涤液的方法，以菜豆（Phaseolus vulgaris）作为模式植物示例。

摘要

质外体是植物组织中一个独特的细胞外区室，位于质膜之外，包含细胞壁。植物叶片的质外体区室是多种重要生物学过程的发生场所，包括细胞壁的形成、细胞对养分和水分的吸收与外排、植物与内生菌的相互作用以及对病原体的防御反应。浸润-离心法已被广泛确立为分析多种植物可溶性质外体成分的可靠技术。通过该方法获得的液体通常称为质外体洗脱液（AWF）。以下方案描述了一种优化的真空浸润与离心方法，用于从菜豆（Phaseolus vulgaris）品种Tendergreen的叶片中提取质外体洗脱液。本文还讨论了该方法的局限性，以及针对其他植物物种进行方案优化的相关问题。所获得的质外体洗脱液可用于多种后续实验，旨在表征质外体的组成成分，研究其在不同植物物种与基因型、植物发育阶段及环境条件下的变化，或探究微生物在质外体液体中的生长情况及其对液体成分变化的响应。

引言

植物的质外体是包围植物细胞的细胞间空间。这是一个动态的环境，许多代谢和运输过程在此发生。质外体的主要结构成分是细胞壁，由位于质外体内的酶、结构蛋白和代谢物组装并修饰而成。在健康的植物细胞中，质外体通常维持酸性状态，从而通过H⁺共转运将氨基酸、糖类和其他营养物质从质外体转运至细胞质¹。在蔗糖运输过程中，蔗糖从光合作用的源器官经质外体进入韧皮部维管组织；随后，通过质外体中的转化酶在库器官中裂解蔗糖，维持渗透势，从而实现蔗糖的运输²。糖类和其他营养物质也可通过蒸腾流向上运输，并在气孔腔中积累³。

质外体也是许多病原体建立寄生生活方式的生态位。植物病原细菌能够通过气孔等自然开口或伤口进入质外体，并在其中大量繁殖⁴。研究表明，番茄质外体中的氨基酸及其他含氮化合物浓度足以满足细菌性和真菌性病原体的营养需求^5,6。植物对微生物病原体的初级防御反应也发生在质外体，主要包括由胞外过氧化物酶和氧化酶产生活性氧，以及通过交联和胼胝质沉积来增强细胞壁结构⁷。植物细胞壁富含具有抗菌活性的次生代谢产物；这些次生代谢产物的生化性质在不同物种间存在差异⁸。

由于上述及其他过程，叶片质外体液中含有多种蛋白质、糖类、有机酸、氨基酸、次生代谢物、金属及其他阳离子（例如 Mg²⁺_, K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Fe^2/3+）。茎部质外体中溶质的浓度主要受质外体与木质部、韧皮部及细胞质之间运输过程平衡的调控⁹。然而，代谢反应和微生物生长也会消耗或产生质外体中的溶质。已知质外体的组成在不同植物物种和基因型之间存在差异，并且会随着光照、营养以及生物和非生物胁迫等环境条件的变化而改变⁹。通过研究质外体的组成及其变化，包括氧化还原电位和渗透电位、pH值、营养物质/代谢物的可利用性以及酶活性等性质，可以获得植物如何响应环境的新见解。由于质外体是一个具有空间结构且动态变化的区室，其中的代谢物和/或离子可能具有挥发性、瞬时性，或与细胞壁及质膜相关联，因此理解或表征质外体溶液中发生的分子变化较为复杂。此外，需要采用不同的分析技术来覆盖多种化学物质类型。

为了研究可溶性质外体的组成，通常需要从组织中提取液体。目前存在多种从不同组织中提取质外体液体的方法，包括一种新近提出的滤纸条法¹⁰，但针对叶片最成熟的方法是浸润-离心法。该技术此前已有评估^11-13，Lohaus et al. 2001¹⁴ 对该方法的诸多技术参数进行了系统详尽的分析。顾名思义，浸润-离心法是一种两步法，其基本过程包括：先用液体浸润液置换质外体中的空气空间，使浸润液与天然质外体液混合，随后通过温和离心叶片回收浸润液与质外体液的混合物。由于所回收的液体被稀释，且并不包含质外体中存在的所有化合物（见下文），因此该液体通常被称为质外体洗脱液（AWF），有时也称为细胞间隙洗脱液，而非直接称为质外体液。浸润-离心法易于扩展，可制备单个或混合的足量体积AWF样品，并适用于多种后续生化与分析技术（例如，蛋白质电泳、酶活性测定、核磁共振、多种色谱技术及质谱分析）。叶片AWF还可作为模拟质外体环境的培养基，用于研究定殖植物的微生物与其环境之间的相互作用⁵。

在以下方案中，我们描述了如何利用菜豆（Phaseolus vulgaris）品种Tendergreen的叶片进行浸润-离心技术操作，并提供了一些以代谢组学为重点的后续分析示例。尤为重要的是，本文提供了评估AWF质量的方法，以及针对不同类型叶片优化该操作流程的建议。

方案

注意：起始叶片材料的选择以及植物生长条件的标准化至关重要，因为这些因素会显著影响AWF的质量、变异性和得率（图1）。需考虑的参数见表1，并在讨论部分进行更详细的阐述。

参数	示例标准化方法
	菜豆	Solanum lycopersicum	拟南芥
叶片类型	第一片真叶，完全展开，健康	2nd 和 3rd 从底部开始取叶片，选取4个最大的小叶，顶端小叶不用于质外体提取	完全展开的莲座叶
植物年龄	21 天	7 - 9 周	7 周
一天中的时间	光照期中间（12:00）	光照期中间（12:00）	光照期中间时段（12:00）
水合作用	所有植物在收获前 1 小时充分浇水	所有植物在收获前 1 小时充分浇水	所有植物在收获前1小时充分浇水
光	16 小时光照，400 µmol m⁻² s⁻¹-2 秒-1	16小时光照，400 µmol m⁻² s⁻¹-2 秒-1	第2周开始每日光照10小时（短日照），400 µmol m⁻² s⁻¹-2 秒-1
湿度	70%	70%	70%
温度	22 °C 光照，18 °C 黑暗	22 °C 光照，18 °C 黑暗	21 °C

表1. 用于AWF提取的叶片标准化参数示例。

1. 制备质外体洗涤液

注意：在本实验方案过程中，含有来自感染叶片的微生物病原体等危险物质不应倒入下水道；应采用适当的处置程序进行处理。

1. 根据叶片大小选择合适的装置：
   1. 使用无针头注射器对较小的叶片（例如 拟南芥、菜豆）进行浸润。对于过大无法放入注射器的叶片，使用真空抽滤瓶进行浸润。当需要同时浸润多个叶片时，采用真空抽滤瓶法。
   2. 若叶片过大，无法适用于现有的浸润方法，可使用剃刀片将其分割成较小的片段。在浸润前，用蒸馏水彻底冲洗切割后的叶片片段，以去除从受损细胞中渗出的细胞质污染物。
2. 使用60 ml注射器进行叶片浸润：
   1. 使用剃刀片在叶柄处将叶片从植株上切下。对于番茄等复叶植物，应在小叶柄处切下小叶。
   2. 将新切下的叶片浸入蒸馏水中清洗，以去除叶片表面的污染物。用吸水纸或滤纸轻轻按压叶片表面，使其干燥。
   3. 在浸润前测量叶片重量。
   4. 小心地将叶片卷起或折叠后放入60 ml注射器中，并注入蒸馏水（也可使用其他浸润液，参见讨论部分）。在将活塞下压至约40 ml刻度时，排出注射器内的所有空气。
   5. 用戴手套的手指或一块Parafilm封住注射器前端，然后向外拉动活塞至60 ml刻度，以在注射器内产生负压。随后缓慢释放活塞。
      注意：若快速释放压力，可能导致细胞裂解和细胞质污染。
   6. 打开注射器前端排出空气，然后重新封住前端，并进一步向下推动活塞，产生适度的正压。
   7. 重复 步骤1.2.5–1.2.6，直至叶片完全浸润，表现为浸润区域颜色变深。
   8. 从注射器中取出叶片。用吸水纸轻轻但彻底地按压叶片，去除表面液体。
   9. 测量浸润后叶片的重量。计算浸润前后重量的差值，该值可近似代表浸润液体积。
3. 使用真空抽滤瓶进行叶片浸润：
   1. 使用剃刀片在叶柄处将叶片从植株上切下。
   2. 将新切下的叶片浸入蒸馏水中清洗，以去除叶片表面的污染物。用吸水纸轻轻按压使其干燥。
   3. 在浸润前测量叶片重量。
   4. 将叶片（或多个叶片）放入一个250 ml或更大容积的侧臂烧瓶中，烧瓶内盛有蒸馏水（也可使用其他浸润液，参见讨论部分），确保液体完全覆盖叶片。
   5. 对烧瓶施加真空。轻轻振荡以释放叶片中的气泡。然后小心且缓慢地释放真空。
      注意：若快速释放真空，可能导致细胞裂解和细胞质污染。
   6. 重复 步骤1.3.5，直至叶片完全浸润，表现为浸润区域颜色变深。
   7. 从烧瓶中取出叶片。用吸水纸轻轻但彻底地按压叶片，去除表面液体。
   8. 测量浸润后叶片的重量。计算浸润前后重量的差值，该值可近似代表浸润液体积。
4. 通过离心回收叶际洗脱液（AWF）：
   1. 将叶片置于一段4英寸（10 cm）宽的Parafilm上。使用一个5 ml移液器吸头（或类似大小的物体）将叶片连同Parafilm一起卷起。
   2. 将卷好的叶片连同移液器吸头一起插入一个20 ml注射器中。确保任何切割边缘朝上。将注射器放入一个洁净的50 ml聚乙烯或聚碳酸酯离心管中。
   3. 在4 °C条件下，使用摆桶转子以1,000 × g离心10分钟。
      注意：离心后肉眼观察叶片应显示大部分浸润液已被排出。若仍有深绿色斑块，表明需要延长离心时间。
   4. 用移液器将回收的AWF转移至新的1.5 ml离心管中。
      注意：AWF体积应大致等于该叶片的浸润体积；若体积偏小，则需增加离心时间或提高离心速度。
   5. 将AWF样品在15,000 × g下离心5分钟，以去除任何细胞或颗粒物。也可选择将AWF通过0.22 µm滤膜过滤，以去除细胞和颗粒物。
   6. 将上清液转移至新的离心管中。样品在储存前应保持在冰上。
   7. 将AWF样品储存在-80 °C条件下。

2. 胞质污染检测方法

1. 将AWF样品置于冰上，以最大限度减少酶促反应（例如，蛋白水解），并在离心步骤完成后立即进行检测。
   注意：对于代谢物检测，样品可在提取后立即冷冻，并在-80 °C下保存至使用。
2. 标准苹果酸脱氢酶（MDH）检测方案参见¹⁵；否则使用市售的MDH检测试剂盒。
3. 标准葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）检测方案参见¹⁶；否则使用市售的G6PDH检测试剂盒。
4. 如需定量检测细胞质代谢物（如葡萄糖-6-磷酸，G-6-P），请按照步骤5所述使用气相色谱-质谱法（GC-MS）。否则，使用市售试剂盒直接检测G-6-P。

3. 胞外空间稀释因子的计算

1. 准备上述使用的浸润液的两倍体积 步骤 1.2.4 或 1.3.4 例如， 蒸馏水）。向其中一份溶液中加入靛蓝胭脂红粉末至终浓度为 50 µM，另一份不添加任何物质。
2. 在610 nm处测定吸光度（OD₆₁₀使用酶标仪测定200 µl靛胭脂渗透溶液的OD值，并通过减去空白对照的OD值进行校正。₆₁₀ 200 µl不含靛蓝胭脂红的浸润溶液。将此校正值作为OD_610浸润 代入下面的公式。
3. 至少重复三次上述叶片浸润实验步骤 1.2 或 1.3）分别与含和不含靛胭脂的浸润溶液进行处理。
4. 浸润后，用蒸馏水冲洗叶片，以去除外表面残留的任何靛蓝胭脂红。
5. 按照上述步骤进行离心（步骤1.4).
6. 测定平均 OD₆₁₀ 200 µl 靛蓝胭脂红AWF提取液的OD值。通过减去平均OD值对该数值进行校正₆₁₀ 200 µl 无靛胭脂红AWF的校正值。将此校正值作为OD_610AWF 代入下方公式。
7. 计算稀释因子（即， 倍数稀释）根据校正后的吸光度值计算为：
   质外体稀释因子 = OD_610浸润 /（OD_610浸润 - OD_610AWF)
8. 将 AWF 中的浓度或活性值乘以稀释因子，以估算质外体液中的浓度/活性 在植株中.

4. 通过冷冻干燥将 AWF 浓缩至全浓度

1. 开启冷冻干燥机，并使其在工作温度和压力下稳定。
2. 汇集所需量的新鲜或保存的质外体液（AWF）样品。
3. 将样品均匀分装至2 ml离心管中。
4. 确定重悬体积：
   重悬体积 = 冻干前体积 / 质外体稀释因子
5. 盖紧管盖，将离心管在液氮中速冻。
6. 将冷冻后的离心管转移至一个或多个预冷的冷冻干燥容器中。转移过程中，将管盖更换为已用尖锐物体刺孔的管盖，以允许气体交换。
7. 将容器连接至冷冻干燥机，彻底冻干样品。
8. 从仪器中取出样品，加入计算量的蒸馏水重悬质外体液（AWF）。
9. 换回未穿孔的管盖，并将样品于-80 °C保存。

5. 采用气相色谱-质谱法进行代谢物分析¹⁷

1. 用移液器将 200 µl AWF 加入 1.5 ml 离心管中
2. 加入 700 µl 含有 10 µg/ml 核糖醇（作为内标）的甲醇。
3. 在 70 °C 下加热 10 分钟。
4. 在 11,000 x g 下离心 10 分钟。
5. 将 700 µl 上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中。
6. 加入 375 µl 冷氯仿，涡旋振荡 10 秒。
7. 加入 500 µl 去离子水（dH₂O），涡旋振荡 10 秒。
8. 在 2,200 x g 下离心 15 分钟。
9. 将 150 µl 上层水相转移至新的 1.5 ml 离心管中，然后在真空浓缩仪中完全干燥样品（不加热）。
10. 用 30 µl 含有 20 mg/ml 盐酸甲氧胺的吡啶溶解样品。
11. 在 70 °C 下剧烈振荡孵育 2 小时。
12. 加入 50 µl MSTFA（N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺）。
13. 在 37 °C 下振荡孵育 30 分钟。
14. 将样品转移至适用于 GC-MS 的玻璃小瓶中。
15. 对样品进行 GC-MS 分析。有关 GC-MS 仪器设置和操作的详细信息，请参见 Lisec et al. 2009¹⁷。

结果

使用蒸馏水作为浸润液，对健康生长3周的P. vulgaris cv. Tendergreen叶片进行离体水分（AWF）提取的典型结果如表2所示。幼嫩的P. vulgaris叶片易于浸润，在本实验所采用的离心速度（1,000 × g）下，通过离心可去除大部分浸润液，这一过程可直接观察到叶片恢复至原始绿色。浸润前P. vulgaris叶片的平均鲜重为1.1 × g，每克鲜重可获得0.5 ml的AWF。采用标准Bradford蛋白测定法测得AWF的蛋白浓度为0.18 ± 0.08 mg/ml。通过测定靛蓝胭脂红的稀释倍数计算得出，这些叶片的稀释倍数为2.3 ± 0.3倍。上述数值在不同物种间可能存在显著差异，因此需要通过预实验确定特定叶型每克鲜重叶片可获得的AWF产量，以及预期的AWF蛋白浓度和稀释倍数。

在渗透步骤中，如果压力变化过快，以及在离心步骤中，如果离心力过高，均可能导致细胞完整性受损。因此，有必要对质外体洗涤液（AWF）样品进行胞质污染标志物的检测；理想情况下，应进行多个独立的检测。此处，表2报告了三种可能检测的结果。在操作良好的P. vulgaris AWF提取物中，通过标准酶学检测方法无法检测到G6PDH。这与其他报道一致，即G6PDH活性仅在离心力超过某一阈值时才可被检测到¹²。相比之下，使用标准代谢检测方法可在所有P. vulgaris AWF样品中检测到基础水平的苹果酸脱氢酶（MDH）活性（2.5 U/ml）。当离心力超过1,000 × g的阈值后，MDH活性随之升高（结果未显示）。由于已知其他物种的质外体含有内源性MDH活性¹⁸，此处检测到的水平被视为真实的质外体活性，而显著高于此基础水平的MDH活性则提示存在污染。此外，也可利用被认为主要存在于胞质中的代谢物（如己糖-6-磷酸）来评估AWF的污染情况。本研究中，GC-MS分析在AWF提取物中未检测到或仅检测到痕量的葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）。相比之下，在切割的玉米根段中，AWF提取后在所有离心速度下均可检测到G-6-P，且其浓度随离心速度升高而增加，表明存在胞质污染¹⁰。

通过气相色谱-质谱法（GC-MS）对 P. vulgaris 叶片气相水相组分（AWF）进行代谢物分析，通常可鉴定出 40 至 60 种代谢物，以及数量大致相当的未鉴定化合物（图 2）。可鉴定的代谢物主要为有机酸、简单糖类和氨基酸，但已有研究在 AWF 中检测并定量了植物次生代谢物¹¹。图 2 中标注了来自这些不同分子类别的若干代表性峰。此外，还可对这些 AWF 样品采用多种后续分析技术以定量各类分子，例如：电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、核磁共振（NMR）、高效液相色谱法（HPLC）、原子吸收光谱法、蛋白质质谱分析。

如图3中考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶所示，胞外体（apoplast）的蛋白质组分也在AWF中得到体现。胞外酶具有多种功能，其中包括细胞壁的合成以及胞外活性氧的产生。对来自不同物种的AWF进行的蛋白质组学研究已鉴定出数十种独立的蛋白质，并表明胞外体的蛋白质组分可响应环境胁迫^13,19。理想情况下，AWF提取物应不含细胞质蛋白（如Rubisco）的污染；但在实际操作中，这一点难以实现。在SDS-PAGE后出现约53 kDa的Rubisco蛋白条带，可作为AWF样品完整性的另一种定性检测指标。例如，图3中第2泳道上样样品所含的Rubisco污染程度高于第1泳道。

	Phaseolus vulgaris AWF
AWF 体积 (ml g-1 叶片鲜重)	0.49 ± 0.09
蛋白质浓度 (mg ml-1)	0.18 ± 0.08
稀释倍数	2.3 ± 0.3
G6PDH 活性 (U ml-1)	未检测到
葡萄糖-6-磷酸 (mg ml-1)	未检测到
MDH 活性 (U ml-1)	2.5 ± 0.9

表2. 从P. vulgaris cv. Tendergreen 叶片中提取 AWF 的典型结果。

图 1. 标准的质外体提取工作流程。 图中数字对应实验方案中的步骤。

图 2. P. vulgaris cv. Tendergreen AWF 的 GC-MS 色谱图示例。 编号的代谢物峰分别为：1-丙二酸盐，2-磷酸盐，3-琥珀酸盐，4-未知物，5-苹果酸盐，6-天冬酰胺，7-核糖醇（内标物），8-柠檬酸盐，9-葡萄糖，10-肌醇，11-咖啡酸，12-蔗糖。

图3. P. vulgaris AWF 叶片提取物的 SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色凝胶示例。 本凝胶展示了两种 AWF 提取物中蛋白质组分的比较，二者在由丰富的质体酶 Rubisco 引起的胞质污染程度上有所不同。AWF 提取后，两个样品均用冷丙酮以4倍体积（v/v）进行丙酮蛋白沉淀，并重溶于原体积十分之一的水中。泳道1和2各含有40 µg 蛋白质。箭头所指为对应 Rubisco 大亚基（~53 kDa）的条带。M_r：蛋白质分子量标记。

讨论

优化植物组织来源

在进行质外体提取时，生物和实验技术上的变异可能较大，因此高度标准化的操作流程有助于提高不同实验之间的一致性（图1）。重要的是，植物组织的来源必须标准化，包括叶片类型、叶龄、生长/环境条件以及采样时间（表1）。不同叶片在渗透难易程度以及通过离心回收质外体洗脱液（AWF）的效率方面存在显著差异；这些差异与气孔数量、气孔开度大小和叶肉阻力相关^12,14。即使在P. vulgaris的不同栽培品种之间，AWF提取的难易程度和得率也存在显著差异；例如，本研究中使用的Tendergreen品种叶片比Canadian Wonder品种更适用于本方法的AWF提取。在P. vulgaris中，第一对真叶最大且最容易渗透，因此是质外体提取的首选材料。已有研究表明，在多个物种中，质外体空气和水体积随叶龄变化，从而影响AWF的可提取性^12,14。在P. vulgaris中，较老的叶片渗透难度显著增加，离心后获得的AWF量也更少；因此，应在叶片完全展开时进行采收。难以渗透的叶片后续需要更高的离心速度才能回收AWF。因此，在确定大规模AWF提取的组织来源之前，应仔细筛选多种不同类型的叶片和品种。

植物生长条件也必须在实验允许的范围内尽可能标准化。使用生长培养箱更佳，因其可维持稳定的湿度、温度和光照强度。叶片的采收应始终在每天同一时间进行，因为代谢物和酶的浓度 等等。 在昼夜周期中发生变化¹⁴最后，为确保植物叶片具有相似的膨压，应在收获前约1小时对植物进行浇水。

叶片浸润与离心条件的优化

在浸润或离心步骤中，若细胞所受机械应力过大，可能导致细胞部分裂解，从而引起AWF中出现不期望的胞质污染。因此，针对特定类型的叶片，该操作程序应在最大化提取产量与最小化AWF胞质污染之间取得优化平衡。在所有情况下，应使用能够回收AWF的最低离心速度，以避免叶片细胞可能发生的机械性破坏。离心速度的优化需针对每种叶片类型通过实验确定，即在一系列不同离心速度下监测回收液体积及质外体污染程度。已有观察表明，标志酶活性（如MDH、G6PDH和葡萄糖-磷酸异构酶）在达到某一临界离心力之前保持较低水平，超过该阈值后这些酶活性迅速升高，推测是由于胞质泄漏所致^9,12,14。根据Baker et al. 2012¹¹的报道，在离心过程中使用Parafilm作为支撑材料，可提高AWF提取效率，并可能减少因叶片过度折叠和压缩造成的机械损伤。此外，使用Parafilm有助于在离心后更清晰地观察叶片，以便检查叶片是否受损以及AWF提取是否完全。

Nouchi¹²描述了从切割的水稻叶片片段中优化离体液（AWF）回收的方法，由于水稻叶片气孔较小，难以渗透，需要更高的离心速度才能收集到离体液。通过将叶片预先浸泡在蒸馏水中或在渗透液中添加表面活性剂，可改善水稻叶片表面的润湿性，从而促进渗透过程。同时采用较高的离心速度（6,000 × g），并监测是否存在质外体污染¹²。使用切割叶片片段时，即使对伤口部位进行充分洗涤，仍存在较高的胞质污染风险；因此，仅在必要时才应使用切割叶片。

在许多研究中，蒸馏水被用作渗透液¹¹。然而，可在渗透液中添加某些化合物，如盐类或缓冲液，以提高特定质外体化合物（尤其是蛋白质）的提取效率¹³。Lohaus¹⁴评估了渗透液的离子强度和渗透强度对回收的质外体洗涤液（AWF）组成的影响，发现其影响可忽略不计。然而，渗透介质pH值的变化可能会影响AWF的组成¹⁴。

正确处理和储存提取的质外体液非常重要。已有研究表明，质外体洗脱液（AWF）含有丰富的蛋白酶及其他酶类^13,20，以及挥发性有机化合物。因此，为减少AWF回收后其成分发生变化，建议将样品置于冰上或在-80 °C条件下储存。此外，AWF的酶学测定应尽量在提取后尽快进行，以避免因蛋白水解、长时间稀释或反复冻融导致的酶失活。

渗透过程会稀释质外体液，通常需要确定这种稀释的程度。离心步骤也可能使质外体液（AWF）受到细胞内区室中水分的稀释。因此，当对AWF进行测定时，需要一个稀释因子来估算体内（in vivo）质外体的化学物质浓度。此外，当将AWF用作模拟质外体环境的微生物生长培养基时，也需要该稀释因子将其浓缩回原始浓度，以尽可能准确地匹配体内的代谢物浓度。目前存在多种方法变体，用于通过测定添加至渗透液中的标记化合物的稀释程度来确定AWF稀释因子，这些方法基于步骤4所述流程。所有方法均假设在AWF回收过程中，叶片细胞不会显著吸收或进一步稀释渗透液。这一假设此前已在渗透步骤中得到验证¹⁴，但在离心步骤中尚未得到验证。标记化合物在质外体中也必须不被吸收、转运或修饰。靛蓝胭脂红是目前用于AWF稀释计算中最广泛使用且经过充分测试的染料。靛蓝胭脂红对阳离子交换树脂和分离的细胞壁具有较低的吸附性，并已在Brassica napus、Pisum sativum、Solanum lycopersicum和Glycine max中被证明适用于AWF的计算^11,21,22。然而，在某些类型的叶片中，例如水稻和黄瓜，靛蓝胭脂红在渗透后似乎未能完全回收，这将导致对AWF稀释因子的低估^12,21。靛蓝胭脂红回收率低可能与其易被超氧阴离子裂解为异吲哚磺酸盐有关²³，而超氧阴离子已知可在质外体中产生，尤其是在胁迫条件下²⁴。靛蓝胭脂红裂解为异吲哚磺酸盐会导致其在610 nm处的吸光度降低，而在245 nm处的吸光度升高。目前尚未研究该反应在质外体中是否显著发生，也未研究是否可通过在渗透液中添加超氧清除剂来抑制该反应。在水稻叶片中，已有研究使用蓝色葡聚糖代替靛蓝胭脂红来定量AWF稀释因子¹²，但其在AWF中的稳定性及回收率尚未见报道。此外，也可使用放射性标记化合物（如[¹⁴C]山梨醇）或其他可定量的内标物代替染料，通过测量放射性或浓度的下降，以类似方式计算稀释因子^11,14,25。

该技术的局限性

对于浸润-离心法分离离体液（AWF）的方法，存在一些注意事项。首先，浸润过程中可能稀释质外体，从而引发植物的响应。如果周围的叶细胞检测到质外体液中某些组分的浓度降低，可能会通过进一步分泌代谢物作出反应，从而干扰对代谢物浓度的准确解读。在对该问题的评估中发现，浸润与离心之间的时间间隔，以及浸润液离子强度的适度差异，均未影响所提取AWF的组成^14,22。因此，由质外体稀释引起的任何人为假象被认为可以忽略不计。

第二个潜在的缺点是，通过离心法洗脱离体壁面液（AWF）由于多种原因并不能捕获存在于质外体中的所有分子。一些化合物，特别是阳离子和蛋白质，可能与带负电荷的细胞壁紧密结合，因而无法随AWF一起洗脱¹³。其他分子如蛋白质可能因分子量过大，在所用的离心速度下无法有效地从质外体中洗脱出来¹⁴。活性氧物种是质外体中产生的一类重要化合物，但由于这些化合物寿命短暂，且其生成条件尚不明确，因此通过AWF提取难以有效检测其存在。目前尚不清楚AWF在多大程度上能够准确反映质外体液的in vivo组成，且这种代表性可能因物种而异。

目前存在多种用于检测细胞质污染的检测方法，但尚无一种被普遍接受。对主要存在于细胞质中的酶（例如 G6PDH、己糖磷酸异构酶、MDH）进行检测具有操作简便的优点，但其结果可能与细胞质渗漏情况相关性较差^14,18。对细胞质代谢物（例如 己糖磷酸、叶绿素）的评估或许更具指示意义，但该方法尚未广泛应用¹¹。尽管如此，上述任一类检测方法均可用于不同样品间质外体污染程度的相对定量。理想情况下，应采用多种独立的测量手段来验证质外体洗脱液样品的完整性。

尽管存在局限性，本文所述的渗透-离心法在研究质外体蛋白质、初级和次级代谢物以及无机离子方面，仍是一种简单且可靠的实验技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微量离心管	Eppendorf	22364111
剃刀刀片	Fisher	12-640
60 ml 注射器	Becton Dickinson	300865
20 ml 注射器	Becton Dickinson	300613
4 英寸封口膜	Bemis	PM-996
侧臂烧瓶	SciLabware	12972831
真空源
5 ml 移液器吸头	Fisher	50-813-28
离心机	Beckman Coulter	392932
摆动桶转子	Beckman Coulter	369702
靛胭脂红	Sigma	I8130
酶标仪	Tecan	Infinite 200
96 孔板	Becton Dickinson	353072
冷冻干燥机	SciQuip	Christ Alpha 2-4 LD
微量离心机	biorad	166-0612EDU
草酰乙酸	Sigma	O4126
D-葡萄糖-6-磷酸	Sigma	G7250
NADH	Roche	10128023001
苹果酸脱氢酶（MDH）检测试剂盒	Biovision	K654-100
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）检测试剂盒	Sigma	MAK015-1KT
葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）检测试剂盒	Biovision	K657-100
核糖醇	Sigma	A5502
甲醇	Sigma	650471
氯仿	Sigma	472476
真空浓缩仪	Thermo Scientific	SC250EXP
甲氧胺盐酸盐	Sigma	226904
N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺	Sigma	394866