Immunostaining para Visualize Murino desenvolvimento do sistema nervoso entérico

Summary

O sistema nervoso entérico é formado por células da crista neural que proliferam, migram e colonizam o intestino. As células da crista neural se diferenciam em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo de neurotransmissor. Este protocolo descreve uma técnica de dissecação, fixação e imunocoloração do trato gastrointestinal embrionário murino para visualizar a expressão de neurotransmissores do sistema nervoso entérico.

Abstract

O sistema nervoso entérico é formado por células da crista neural que proliferam, migram e colonizam o intestino. Após a colonização, as células da crista neural devem se diferenciar em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo de neurotransmissor. Os neurônios colinérgicos, um importante fenótipo de neurotransmissor no sistema nervoso entérico, são identificados pela coloração da colina acetiltransferase (ChAT), a enzima sintetizadora da acetilcolina. Esforços históricos para visualizar neurônios colinérgicos foram prejudicados por anticorpos com especificidades diferentes para ChAT do sistema nervoso central versus sistema nervoso periférico. Nós e outros superamos essa limitação usando um anticorpo contra ChAT placentário, que reconhece ChAT central e periférico, para visualizar com sucesso neurônios colinérgicos entéricos embrionários. Além disso, comparamos esse anticorpo com repórteres genéticos para ChAT e mostramos que o anticorpo é mais confiável durante a embriogênese. Este protocolo descreve uma técnica de dissecação, fixação e imunocoloração do trato gastrointestinal embrionário murino para visualizar a expressão de neurotransmissores do sistema nervoso entérico.

Introduction

Um funcionamento do sistema nervoso entérico (ENS), que controla a motilidade, a absorção de nutrientes e fluxo sanguíneo local, é essencial para a vida ^1. O SNE é formado por células da crista neural (NCC) que proliferam, migram e colonizar o intestino, onde se diferenciam em gânglios contendo neurónios e células gliais. Doença de Hirschsprung (HSCR, on-line Mendelian Inheritance in Man), uma desordem congênita multigeneic com uma incidência de 1 em 4.000 nascidos vivos, pode ser considerada a doença prototípica para estudar a formação ENS interrompido. Em HSCR, NCC não conseguem migrar para colonizar e comprimentos variáveis ​​do intestino posterior distal ^2. Além disso, outro gastrointestinal comum (GI) defeitos de desenvolvimento na população pediátrica, como malformações anorretais, atresias intestinais e distúrbios de motilidade são associados a distúrbios nas funções básicas ENS, e estão provavelmente associados à subtis, subvalorizado, alterações anatômicas e alterações funcionaiso ^3-6 ENS. Portanto, as técnicas que nos permitem entender os determinantes do desenvolvimento da formação ENS pode lançar luz sobre a patogênese e potencial tratamento de distúrbios do trato GI pediátricos.

Na sequência de migração e colonização, NCC diferencia em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo neurotransmissor. Os neurónios colinérgicos representam cerca de 60% ​​de neurónios entéricos ^7, e pode ser detectado por coloração para colina acetiltransferase (ChAT), a enzima de síntese para a acetilcolina neurotransmissor excitatório. Historicamente, as tentativas para visualizar os neurónios colinérgicos foram confundidos pela diferindo a especificidade do antigénio dos anticorpos dirigidos contra o sistema nervoso central (SNC) contra a ChAT sistema nervoso periférico (SNP) ChAT ^8-10. No entanto, os anticorpos dirigidos contra placentária ChAT reconhecer tanto ChAT central e periférica ^11-13, e temos técnicas recentemente descritos que permitem a visuazação da ENS neurônios colinérgicos com alta sensibilidade anteriormente no desenvolvimento do que foi alcançado com linhas de chat repórter ^14.

Aqui, nós apresentamos uma técnica para dissecar, fixação e imunomarcação do murino tracto GI embrionário para visualizar ENS expressão de neurotransmissores nos neurônios. Para estes estudos, nós utilizamos ratos chat-Cre acasalaram com R26R: animais tdTomato para produzir chat-Cre; R26R:: floxSTOP ratos tdTomato (definidos como chat-Cre tdTomato em todo o manuscrito): floxSTOP. Estes animais foram depois acasalados com ratinhos repórter ChAT-GFP homozigóticos, para obter ratinhos que expressam ambos os repórteres fluorescentes que detectam expressão ChAT em ^​​14. Esses dois animais repórter estão em um fundo C57BL / 6J e estão comercialmente disponíveis (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Protocol

A Universidade de Wisconsin Animal Care e do Comitê Use aprovado todos os procedimentos.

1. Preparação de Soluções

1. Use fosfato 1x solução salina tamponada (PBS) como tampão de dissecção e uma solução de enxaguamento.
2. Prepare a 30% de sacarose por pesagem de 30 g de sacarose e em lugar de uma garrafa. Adicionar 99 ml de PBS 1x e adicionar azida de sódio a 1 ml de 10%. Misturar bem até que toda a sacarose é dissolvido. Armazenar a 4 ° C até serem necessárias.
3. Preparar a solução de bloqueio através da mistura de 1x PBS, 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de Triton-X-100. Misture bem e guarde na geladeira até ser necessário.
4. Preparar solução a 8% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x por pesagem da quantidade apropriada de PFA em PBS 1x e, em seguida, incuba-se a 65 ° C até que esteja completamente dissolvido. Armazenar em alíquotas de 25 ml no congelador a -20 ° C até ser necessário. Diluir a 4% de PFA em PBS 1x no dia da utilização.

2. Embryo e Gut Dissectíon

1. De acordo com o Animal Care Institucional e Comitê de Uso protocolos aprovados, eutanásia rato grávida cronometrado e transferir o útero em um 60 milímetros placa de Petri contendo gelada 1x PBS.
2. Sob um microscópio de dissecção com uma tesoura afiada, cortar a parede uterina aberto para expor os embriões. Remova os embriões do útero e lugar em um ambiente limpo 60 milímetros placa de Petri contendo gelada 1x PBS.
3. Euthanize cada embrião por decapitação em 1x PBS gelado. Se você estiver usando ratinhos transgénicos que contenham proteínas fluorescentes, sob iluminação fluorescente, identificar os embriões transgênicos positivos.
4. Dissecar o tracto GI de cada embrião utilizando um microscópio de dissecção. Usando fórceps finos, orientar o embrião de tal modo que o lado esquerdo está virado para cima e o lado direito é contra o fundo da placa de Petri. Remover a parede superior do corpo do embrião para expor os órgãos internos. Inserir uma pinça fina entre a parede do corpo dorsal e os órgãos internos. CrOss fórceps uns contra os outros em uma acção de corte do tipo tesoura para remover os órgãos internos do embrião.
5. Outras sub-dissecar o tracto GI para cima dos órgãos circundantes e, em seguida, colocar cada tracto GI para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo gelada PBS 1x.

3. Fixação de GI Tracts

1. Lavar cada trato GI 3 vezes com 1x PBS gelado e depois substituir com PFA 4%. Fixar os tractos gastrointestinais nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sobre uma plataforma de agitação à TA durante 1,5 h. Lavar os tractos gastrointestinais 3 vezes durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida durante 1 h na plataforma de agitação. Nesta fase, armazenar os trato gastrointestinal, a 4 ° C em 30% de sacarose em 1x PBS contendo azida de sódio a 0,1% até ser necessário.
   NOTA: Como alternativa, armazenar os embriões em 30% de sacarose até um ano, sem qualquer efeito sobre a integridade dos tecidos. Armazenamento das amostras em 30% de sacarose permite o processamento posterior das amostras ou para immunostaining ou em outubro para crio-sectioning. Como alternativa, prosseguir com o protocolo immunostaining detalhado abaixo.

4. Protocolo Immunostaining

1. Se as amostras foram armazenadas em 30% de sacarose, enxaguar três vezes durante 20 minutos em 1x PBS numa plataforma oscilante.
2. Colocar os tractos gastrointestinais em solução numa plataforma oscilante durante 1 h à TA bloqueio.
3. Remover a solução de bloqueio e incubar os tratos GI, com a quantidade adequada de anticorpos primários diluídos em solução, quer por 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C numa plataforma oscilante bloqueio. Use 1: 1000 de diluição de anticorpo anti-Hu humana (soro obtido a partir do paciente), 1: 1000 de diluição de frango anticorpo anti-proteína verde fluorescente (GFP) e diluição 1: 100 de anticorpo de cabra anti-ChAT.
   NOTA: Nós utilizamos um anticorpo anti-Hu humano que foi obtido localmente a partir de um paciente, no entanto, os anticorpos anti-Hu estão disponíveis comercialmente, por exemplo, de ratinho anti-Hu, (utilização a diluição 1: 500).
4. Lavar as trato gastrointestinal em 1x PBS3 vezes durante 5 min e depois durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
5. Substituir o 1x PBS com anticorpos secundários diluídos 1: 500 em solução numa plataforma oscilante ou 4 horas para o bloqueio à TA ou O / N a 4 ° C. Use corante amino-reactivo anti-humana de burro como DyLight, burro Cy2 anti-frango e de burro anti-cabra Cy5. Se o rato utilizando anticorpo anti-Hu, em seguida, usar uma diluição de 1: burro anti-rato de amina de corante reactivo 405 500.
   NOTA: A intensidade da GFP e expressão endógena tdTomato e a clareza de imunocoloração aumento com a idade de desenvolvimento. Nós normalmente imunocoloração tripas embrionárias individualmente em tubos de 0,2 ml com 150 ul de solução de coloração, a fim de reduzir o volume de anticorpo utilizado e também para assegurar a coloração eficaz do tecido.
6. Lavar os tractos gastrointestinais em 1X PBS 3 vezes durante 5 min e depois durante 1 h à TA em plataforma oscilante.
7. Coloque algumas gotas de fluorescência meio de montagem com DAPI numa lâmina de vidro. Mergulhe os tra GICT para o meio de montagem de fluorescência e adicionar uma tampa de vidro directamente em cima do tecido. A fluorescência média de montagem -G é um composto solúvel em água que proporciona uma vedação semi-permanente.
   NOTA: Use meio de montagem de fluorescência, como Vectashield que é uma base de glicerol meio que evita o desbotamento e fotodegradação de anticorpos de montagem. Ambos os produtos permitem tecidos para ser armazenado por longos períodos de tempo, a 4 ° C.
8. Captar imagens de cada um fluoróforo utilizando um microscópio confocal. Use comprimentos de onda de excitação de fluoróforos e filtros empregues apresentados na Tabela 3.
9. Executar análise de imagem assistida por computador, utilizando software apropriado, dependendo do tipo de confocal usado para capturar imagens.

Results

Descrevemos previamente a geração de ratinhos que expressam GFP e ambos tdTomato repórteres fluorescentes que detectam expressão ChAT em ^​​14. Resumidamente, os ratos chat-Cre foram acasalados com R26R: floxSTOP: animais tdTomato para produzir chat-Cre; R26R: ratos tdTomato (chamados chat-Cre tdTomato): floxSTOP. Estes animais foram depois acasalados com ratinhos repórter ChAT-GFP homozigóticos. Os embriões foram isolados e os tecidos foram dissec...

Discussion

O nosso laboratório e outros mostraram que defeitos intestinais em HSCR não são restritas para o cólon proximal alargada aganglionic mas, mesmo para o intestino delgado ganglionados ^5,15,16. Estas alterações incluem modificações nas ENS densidade neuronal e fenótipo neurotransmissor e podem ser responsáveis ​​pela dismotilidade que tem sido observada em pacientes com HSCR. Nós utilizamos as técnicas acima em nossos esforços para entender os determinantes da formação ENS. Especificamente, estas técnicas têm si...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solução salina tamponada com fosfato	Oxóide	BR0014G
sacarose	Fisher	S2
Azida sódica	Fisher	BP9221
Albumina de soro bovino	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldeído	Sigma	158127
60 mm Placas de Petri	Microscópio	Fisher FB0875713A
	Estereoscópio Nikon	SMZ-18 Microscópio
de dissecção	Estereoscópio Nikon	SMZ-18 Pinça
fina	Ferramentas de ciência fina	11252-20
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Corrediças de vidro	Fisher	12-550-15
Vidro de cobertura	VWR	16004-330
Microscópio confocal	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon