In vivo avbilding og sporing av Technetium-99m Merket Bone Marrow stamceller i Equine tendinopati

Summary

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Abstract

Nylige fremskritt i bruk av benmarg stamceller (BMMSC) for behandling av sene og ligamentskader i hesten foreslår forbedret utfallsmål i både eksperimentelle og kliniske studier. Selv om BMMSC blir implantert i senen lesjon i store antall (vanligvis 10 – 20 millioner celler), bare et relativt lite antall overleve (<10%), selv om disse kan vare i opptil 5 måneder etter implantasjon. Dette synes å være en vanlig observasjon i andre arter hvor BMMSC har blitt implantert i andre vev, og det er viktig å forstå når dette tapet inntreffer, hvor mange som overlever den første implantasjon prosessen og hvorvidt cellene er fjernet inn i andre organer. Sporing skjebnen til cellene kan oppnås ved å radiomerke de BMMSC før implantering som tillater ikke-invasiv in vivo avbildning av celleplassering og kvantifisering av celletall.

Denne protokollen beskriver en celle labeling prosedyre som bruker Technetium-99m (Tc-99m), og sporing av disse celler etter implantasjon i flexor skadede sener i hester. Tc-99m er en kortvarig (t _{1/2 av} 6,01 time) isotop som sender ut gammastråler, og kan internaliseres av celler i nærvær av det lipofile forbindelsen hexamethylpropyleneamine oksim (HMPAO). Disse egenskapene gjør den ideell for bruk i nukleærmedisin klinikker for diagnostisering av mange forskjellige sykdommer. Skjebnen til de merkede cellene kan følges på kort sikt (opp til 36 timer) ved gamma-scintigrafi for å kvantifisere både antallet celler som holdes tilbake i lesjonen, og fordelingen av cellene i lungene, skjoldbruskkjertel og andre organer. Denne teknikken er tilpasset fra merkingen av blodleukocytter og kan brukes til å bilde BMMSC implantert i andre organer.

Introduction

Regenerative strategier for reparasjon av syke eller skadde vev er basert på multipotente stamceller avledet fra en rekke forskjellige vev, og implantert inn i det berørte området. Nylige fremskritt i bruk av autolog BMMSC for behandling av sene og ligamentskader i hesten har vist bedret utfallsmål i både eksperimentell ^{1-5 og} kliniske studier ^6. Hesten er en spesielt attraktiv modell for å vurdere effekten av stamcellerelaterte behandlinger fordi den lider av alder og overanstrenge relaterte skader i senene i distale forbena, det er en atletisk dyr, og det er en stor, tilrettelegging benmarg utvinning og nøyaktig implantasjon. Sene skader leges naturlig med fibrose men helbredet senen er funksjonelt dårligere ⁷ og har en høy risiko for ny skade ^åtte. Den overfladiske digitale flexor sene (SDFT) er mest påvirket som det har utviklet seg til å fungere som en elastisk energibutikk og opplevelser høy lastestreker for å oppnå energieffektive og høy hastighet bevegelse. Gjenopprette funksjon etter skade er derfor avgjørende. Disse skadene er lik de som påvirker akillessenen i mennesker som utfører en lignende funksjon ^ni. Det finnes ingen gode behandlingsalternativer for å behandle eller oppnå god reparasjon for slike skader, derfor Cell-baserte regenerative strategier tilby en attraktiv mulighet til å forbedre resultatene og redusere re-skade.

I de fleste studiene fem – 20 millioner kroner autologt BMMSC blir injisert direkte inn i lesjonen som vanligvis forekommer i kjernen av den sene legeme som derfor fungerer som en beholder for cellene. Skjebnen til cellene når injisert ikke er klare og forskjellige cellemerkingsmetoder for å spore cellene er nylig blitt beskrevet. Celler merket med en fluorescens-tag ble vist å overleve kun i forholdsvis små tall (<10%) ^10,11. Fluorescens etiketter nødvendigvev ekstraksjon og snitte for histologiske analyser som er tidkrevende og ikke lett lette temporal analyse i et stort dyremodell eller i kliniske tilfeller. I nyere arbeid har vi brukt radioisotop ^99m Tc å merke celler og følge deres skjebne ved gamma scintigrafi ^en. Denne metoden gir raske sammenligninger gjøres mellom ulike ruter av celle levering, inkludert intralesional, intravenøse via jugularvenen ^pt eller regional perfusjon via intra-arterielle ¹² eller intravenøse ^1,12 injeksjoner. Det utholdenhet og fordelingen av cellene kan deretter bli avbildet ved gamma-scintigrafi av forskjellige organer. Dette har vist at bare 24% av cellene injisert intralesjonalt forble i lesjonen med 24 hr ^1, og dette er støttet av en annen studie ved hjelp av eksperimentelt laget lesjoner, og ved hjelp av den samme radiomarkøren ^5. Videre cellene viser begrenset evne til å hjem i sene lesjoner når delivered av regional perfusjon eller intravenøst, men er dispergert i lungene hos de sistnevnte rutene ^4.

BMMSC merket med jernnanopartikler er en alternativ metode for å spore celler implantert i forbena sener ^13. Selv om jern nanopartikkel merkede celler tillate celle sporing in vivo ved MRI, blir tidsmessige undersøkelser i et stort dyr er begrenset av antall ganger anestesi kan administreres ved hvert tidspunkt for utførelse av MR. Videre jern nanopartikler er hypointense på MR som begrenser informasjonen på migrering av merkede celler i senen kroppen. Andre radioisotoper som kan benyttes, innbefatter indium-111, men dette lider av den ulempe at en lengre halveringstid enn Tc-99m (2,8 dager vs 6,0 time), og høyere gammastråleemisjon energi. I tillegg har celleviabilitet blitt rapportert å bli redusert når det merkes med Indium-111 ^14. Tc-99m, på den annen side, blir rutinemessig brukt i både equine og human nukleærmedisin for å merke perifere mononukleære blodceller og følge deres fordeling in vivo ved scintigrafi. Det kan være forholdsvis lett tatt opp av cellene ved hjelp av HMPAO som en linker molekyl for å binde technetium, som Tc-99m-HMPAO, til celler. Tc-99m-HMPAO merket BMMSC viser god levedyktighet og kan spre seg in vitro ^4. Denne protokollen beskriver merking og sporing av hest autolog BMMSC implantert i naturlig forekommende lesjoner i forbena SDFT.

Det er viktig å merke seg at protokollen er kun ment å bli brukt som et forskningsverktøy. Dens bruk som et klinisk terapeutisk modalitet er ikke anbefalt som effekten av radiomarkøren på cellulær fenotype er ikke blitt fullstendig klarlagt.

Protocol

Sakene som er beskrevet her ble utført følgende Etisk tillatelse gitt av dyreetikk og velferdskomiteen i Colegio de Veterinarios de Malaga, Spania, og Royal Veterinary College, North Mymms, UK de prosedyrer som brukes på hester er basert på godkjente protokoller som er brukes i klinikk på hester som fikk stamcellebaserte behandlingsformer som inkluderer sedasjon, benmarg aspirasjon, intra-sene injeksjon, regional perfusjon, intravenøs injeksjon, post-prosessuelle behandling og smertebehandling og oppfølging etter…

Representative Results

Tc-99m-HMPAO innlemmelse i BMMSs ikke påvirker deres evne til å forholde seg til vev kultur plast og mens de viser spredning evne til å danne monolagene (figur 1) har vi ikke helt bestemt om spredningstakt eller andre cellulære fenotyper er berørt. Deres morfologi er lik umerkede celler med en typisk spindel form. Den cellulære merking effektivitet (det vil si., Opptak av etiketten) varierer typisk fra ca. 1,5% til 25%. Hovedårsaken til den lave merking effektiviteten var relatert til fo…

Discussion

I tillegg til benmargen, stamceller isolert fra kilder som fettvev er egnet for merking med denne protokollen. Videre kan celler fra en frossen tilstand bli gjenopplivet og utvidet i kulturen til de ønskede tallene for merking studier ^12.

En kritisk faktor som bestemmer effektiviteten av merking av BMMSC er tiden mellom eluering av Tc-99m fra molybden generatoren ved radiofarmasi, fremstilling av Tc-99m-HMPAO og bruken av radio-farmasøytiske forbindelse i klinikken. Det er et in…

Materials

Technetium99m			Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.  The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator
Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)	GE HealthCare		Please enquire directly with GE HealthCare
Microfuge, Minispin/Minispin Plus	Ependorf	22620100
18G and 19G Needles	Terumo Medical	NN-1838R (18G);         NN1938R (19G)
Syringes 1 mL and 2 mL	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Greiner Bio-One Ltd	616201
PBS – Phosphate-Buffered Saline	LifeTechnologies	14190
Sterile Gauze Swabs	Shermond Ltd	UNG602
CoflexVet self adhering bandage	Andover Healthcare, Inc.	3540RB-018
Ultrasound imaging software	Scion Image, Scion Corporation, USA
MicasXplus Scintigram processing software	Bartec Technologies Ltd		http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html
Field isotope counter for monitoring isotope	John Caunt U.K.	GMS1800a	http://www.johncaunt.com/
Well counter for isotope measurements, dose calibrator	Capintec Southern Scientific	CRC-25R