Este estudo demonstra a técnica para fazer um modelo minimamente invasivo e facilmente reprodutível de isquemia da medula espinhal em ratos. Vários graus de déficit motor do membro traseiro podem ser produzidos controlando o tempo de oclusão aórtica.
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Artigo de método
Déficit motor reprodutível após oclusão aórtica em um modelo de rato da isquemia da medula espinhal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A isquemia da medula espinal é uma complicação fatal após a cirurgia de aneurisma aórtico toracoabdominal. Os pesquisadores podem investigar as estratégias para prevenir e tratar esta complicação usando modelos experimentais de isquemia da medula espinhal. O modelo aqui descrito demonstra vários graus de paraplegia que se relacionam com o comprimento da oclusão após a oclusão da aorta torácica em um modelo de isquemia da medula espinhal do rato.
A 2-Fr. O cateter com ponta de balão avançou através da artéria femoral para a aorta torácica descendente até a ponta do cateter foi colocada na artéria subclávia esquerda em ratos Sprague-Dawley machos anestesiados. A isquemia da medula espinal foi induzida por inflar o balão do cateter. Após um período definido de oclusão (9, 10 ou 11 min), o balão foi desinflado. A avaliação neurológica foi realizada utilizando o índice de déficit motor às 24 h após a cirurgia e a medula espinhal foi colhida para exame histopatológico. Jove_content "> Os ratos que sofreram 9 min de oclusão aórtica apresentaram comprometimento motor leve e reversível no membro posterior. Os ratos submetidos a 10 min de oclusão aórtica apresentaram comprometimento motor moderado mas reversível. Os ratos submetidos a 11 min de oclusão aórtica exibida completa e persistente Paralisia. Os neurônios motores nas seções da medula espinhal foram mais preservados em ratos sujeitos a menor duração da oclusão aórtica.
Os pesquisadores podem alcançar um déficit motor reprodutor traseiro após a oclusão da aorta torácica usando este modelo de isquemia da medula espinhal.
Introdução
A paraplégia é uma complicação fatal da cirurgia de aneurisma aórtico toracoabdominal. Isso resulta da lesão da isquemia-reperfusão da medula espinhal que ocorre durante o aperto cruzado e o desbloqueio da aorta. 1 Várias estratégias, incluindo hipotermia sistêmica e drenagem cefalorraquidiana, foram introduzidas para proteger a medula espinhal, 2 , 3 , 4 , mas muitos pacientes permanecem afetados pela lesão.
Vários modelos de isquemia da medula espinhal animal foram introduzidos para investigar sua patogênese e desenvolver estratégias de proteção contra a lesão. No presente estudo, descrevemos um modelo de rato da isquemia da medula espinhal com base no método de Taira e Marsala. 5 O sistema de circulação espinhal em ratos é muito semelhante ao sistema vascular e colateral da medula espinhal em seres humanos, embora existam algumas diferenças no tamanho elocalização. 6 , 7 Assim, um rato é um animal anatomicamente adequado para utilizar para um modelo experimental que investiga a patogênese, complicações e tratamento da isquemia da medula espinhal. Além disso, este modelo de isquemia da medula espinhal produz oclusão aórtica confiável com intervenção mínima utilizando uma oclusão intravascular do balão da aorta torácica.
Neste estudo, demonstramos que este modelo de rato da isquemia da medula espinhal induz déficits motor reproduzíveis nos membros traseiros que variam em gravidade dependendo do tempo de oclusão aórtica.
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Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Seul, Hospital Bundang. Os cuidados com os animais e os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia Nacional de Institutos de Saúde dos Estados Unidos para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparação cirúrgica
- Antes da cirurgia, elimine os cateteres com solução salina estéril para garantir a permeabilidade.
- Coloque um cobertor de aquecimento na mesa de operação e cubra a mesa com uma camada estéril.
- Coloque ratos ratos Sprague-Dawley (270-330 g) em uma caixa acrílica com 3,0% -4,0% de isoflurano em 100% de oxigênio.
- Aplique lubrificante nos olhos do rato.
- Coloque o rato na mesa de operação na posição supina, e mantenha a anestesia usando uma máscara facial com administração contínua de isoflurano inalado (1,0% -2,5% vol).
- Coloque uma sonda retal para monitorar e manter a temperatura corporal entre 37,0-38,0 ° C.
2. Cateterização da artéria femoral
- Lavar suavemente a área inguinal direita usando Betadine e 70% de etanol.
- Faça uma incisão horizontal da pele de 2 cm usando uma tesoura na área inguinal direita.
- Usando um retractor, exponha o campo cirúrgico.
- Dissecar a artéria femoral da veia circundante e do nervo. Isolar uma seção de 1 cm da artéria usando fórceps curvados e fórceps embotados.
- Usando uma sutura de seda preto 4,0, coloque uma gravata solta nas extremidades proximal e distal da artéria para maximizar a exposição.
- Faça uma incisão na artéria femoral usando micro-tesoura.
- Insira um 2-Fr. Cateter com ponta de balão na artéria femoral usando micro-fórceps. Fixe o cateter ao vaso a cerca de 1 cm da cabeça do cateter com a ligadura proximal e, em seguida, amarre a ligadura distal.
3. Cateterização da artéria carótida
- Esfolie o pescoço anterior direito usando betadEI e 70% de etanol e, em seguida, faça uma incisão na pele.
- Usando um retractor, exponha o campo cirúrgico. Isolar uma seção de 1 cm da artéria e amarrá-la com uma sutura de seda nas extremidades proximal e distal da artéria para maximizar a exposição.
- Puncionar a artéria carótida usando um cateter intravenoso de 24 G e avançar o 1 cm proximal do cateter para o coração.
- Fixe o cateter com a ligadura proximal e, em seguida, amarre a ligadura distal.
- Usando uma torneira de 3 vias, conecte a extremidade distal do cateter ao micro-tubo com solução salina e ao reservatório externo.
4. Cateterização da artéria caudal
- Esfregue a área ventral da cauda com betadina e 70% de etanol e faça uma incisão da pele de 2 cm.
- Dissecar a artéria da cauda das estruturas circundantes e isolar uma seção de 1 cm da artéria usando fórceps curvados e fórceps embotados.
- Usando uma sutura de seda preto 4.0, solteAmarre as extremidades proximal e distal da artéria para maximizar a exposição.
- Puntar a artéria da cauda usando um cateter intravenoso 24 G e avançar o cateter para a artéria.
- Fixe o cateter ao vaso (cerca de 1 cm da cabeça do cateter) com a ligadura proximal e amarre a ligadura distal.
- Conecte a parte distal do cateter ao dispositivo de monitoramento da pressão arterial.
5. Indução da isquemia da medula espinhal
- Após a conclusão do cateterismo, avance o 2 Fr. Cateter com ponta de balão na aorta torácica descendente de modo que a ponta do cateter atinja a artéria subclávia esquerda.
- Inserir a uma profundidade de 10 cm do local de inserção.
- Injectar 150 unidades de heparina a uma concentração de 100 unidades / mL no cateter carotídeo.
- Inflar o balão do cateter com 0,05 mL de solução salina.
- Simultaneamente, drenar o sangue para o recipiente de sangue externo do cArtéria de artéria para regular a pressão arterial proximal para 80 mmHg.
- Conecte o sistema de monitoramento da pressão arterial ao lúmen restante do galo de parada de 3 vias e controle a quantidade de drenagem sangüínea com monitoramento da pressão arterial.
- Confirme o sucesso da oclusão aórtica por uma diminuição abrupta e perda contínua de pressão arterial distal.
- Após a oclusão aórtica de 9, 10 ou 11 min, esvazie o balão do cateter Fogarty e reinfuse o sangue drenado.
6. Cuidados Pós-cirúrgicos e Avaliação Neurológica
- Ao monitorar a pressão arterial através da artéria da cauda, remova os cateteres das artérias femorais e carótidas e feche as feridas com suturas de seda.
- Depois de confirmar que a pressão arterial é recuperada para o intervalo normal, retire o cateter da artéria da cauda e feche a ferida.
- Após a recuperação da anestesia, devolva o rato à sua gaiola.
- Avalie oiFunção do motor do membro e nas 24 h após a cirurgia com o índice de déficit motor ( Tabela 1 ). O índice de déficit motor é definido como a soma do escore de ambulação e o escore reflexo de colocação / passo. Um índice de déficit motor de 6 indica o déficit máximo.
7. Avaliação histopatológica
- Após a avaliação neurológica, anestesiar ratos com isoflurano administrado com máscara, sacrificá-los por perfusão transcardial com 100 mL de solução salina heparinizada sob anestesia e extrair a medula espinhal. 8
- Incorporar as seções do cordão do nível das vértebras lombares 3-5 na parafina.
- Mancha secções transversais com hematoxilina e eosina (H & E).
- Observe a lesão do neurônio motor sob um microscópio. 9
8. Análise estatística
- Execute análise estatística utilizando o Pacote Estatístico para a Ciência Social, versão 20. O motor defO índice icit dos três grupos foi comparado usando o teste de Kruskal-Wallis, seguido de um teste U de Mann-Whitney. Um valor de P <0,05 foi considerado estatisticamente significante.
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Resultados
Durante um período de isquemia da medula espinal, a oclusão aórtica foi realizada durante 9 minutos (n = 3), 10 min (n = 3) ou 11 min (n = 3). O índice de déficit motor em ratos é apresentado na Tabela 2. Os ratos submetidos a 9 min de oclusão aórtica mostraram comprometimento motor leve e reversível no membro traseiro. Ratos submetidos a 10 min de oclusão aórtica apresentaram déficit motor moderado, mas não paralisia completa. Os ratos que sofreram 11 minutos de tempo de oclusão apresentaram paralisia completa e persis...
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Discussão
No presente estudo, demonstramos um modelo de rato da isquemia da medula espinhal com base no método 5 de Taira e Marsala que induz graus variáveis de déficit motor no membro posterior dependendo do tempo de oclusão aórtica.
O comprimento da oclusão aórtica pode afetar o grau de déficit motor. Se o tempo de oclusão aórtica for maior, o déficit do motor fica mais severo. Assim, os pesquisadores podem atingir um certo grau de déficit motor ao controlar o tempo de oclu...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2012R1A1A3014010 da Fundação Nacional de Pesquisa do Governo coreano.
Agradecimentos
Os autores não têm reconhecimento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cateter de Embolectomia Arterial Fogarty | Edward Life Sciences | 120602F | um cateter com ponta de balão inserido na artéria femoral |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | de 50 mL com cateter intravenoso de calibre 24 |
| VACINA COREANA | KOVAX-SERINGA 50mL | Máscara facial | |
| 1 mL seringa | VACINA DA CORÉIA | KOVAX-SERINGA 1ml | |
| Sonda de recal | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Sonda retal para monitoramento de temperatura |
| Micro tesoura de mola de dissecação | Jeung do bio & Planta co.LTD. | JD-S-10 | Micro-tesoura |
| TESOURA (SHARP-SHARP)Jeung | do bio & Planta co.LTD. | S-51-12-S | Retrator de tesoura |
| Jeung do bio & Planta co.LTD. | Pinça Micro Retrator | JD-S-74A | |
| Jeung do bio & Planta co.LTD. | JD-S-29 | Micro-fórceps | |
| MOSQUITO FORCEP (Curvo) | Jeung do bio & Planta co.LTD. | Pinça Curva S-44-CPK | |
| PINÇA DE DRESSAGEM | Jeung do bio & Planta co.LTD. | Pinça S-37-16S | sem corte |
| 4/0 seda preta | Sutura de | Medical S431 | 4.0 |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way |
| stopcock Monitor de paciente | PHILIPS | MP20 | O dispositivo de monitoramento de pressão arterial. |
| Manta de aquecimento | Autoprodução | Manta de aquecimento | |
| Microtubo e reservatório externo | Autoprodução | Microtubo e reservatório externo | |
| Heparina | JW Farmacêutica | Heparina | |
| 0,9% NS 1000ml | JW Farmacêutica | Solução salina normal | |
| Isoflurano | Hana Med | Isoflurano |
Referências
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
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Reimpressões e permissões
