Purificação do compartimento da membrana retículo endoplasmático associado a degradação de antígenos exógenos em cruz-apresentação

Summary

O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação dos compartimentos celulares onde os antígenos exógenos são processados pelo retículo endoplasmático associado a degradação em cruz-apresentação.

Abstract

Células dendríticas (DCs) são altamente capazes de processar e apresentar antígenos exógenos interiorizados a classe principal de histocompatibilidade (MHC) moléculas também conhecido como Cruz-apresentação (CP). CP desempenha um papel importante não só na estimulação de ingênuo CD8⁺ T memória CD8 e células⁺ T células para infecciosas e imunidade de tumor, mas também na inativação de auto-agente ingênuo T células por células T anergy ou supressão de células T. Embora o mecanismo molecular crítico da CP continua a ser elucidado, acumula evidências indicam que antígenos exógenos são processados através de retículo endoplasmático associado degradação (ERAD) após a exportação do não-clássica endocítica compartimentos. Até recentemente, caracterizações desses compartimentos endocítica limitavam-se porque não havia nenhum marcadores moleculares específicos além de antígenos exógenos. O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação desses compartimentos endocítica. Usando esta purificada do microsome, nós reconstituído a ERAD, como transporte, ubiquitination e processamento do antígeno exógeno em vitro, sugerindo que o sistema ubiquitina-Proteassoma processado o antígeno exógeno após exportação deste compartimento celular. Este protocolo pode ser mais aplicado a outros tipos de células para esclarecer o mecanismo molecular da CP.

Introduction

O MHC moléculas são expressas na superfície de todas as células nucleadas, com curtos peptídeos antigênicos derivados de antígenos endógenos, que são processados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma no citosol¹. Após o processamento, peptídeos antigênicos são transportados para o lúmen do retículo endoplasmático (ER) pelo transportador peptídeo TAP. No lúmen do ER, uma série de acompanhantes específicos auxiliar o carregamento do peptide e o dobramento correto do MHC complexo eu. Esta série de moléculas é chamado o complexo peptídeo-carregamento (PLC), indicando que o ER é um compartimento central para peptídeo carregando em cima do MHC eu

Protocol

1. cultivo de células e adição de antígenos exógenos

1. preparar bOVA usando uma rotulagem de biotina-proteína kit seguindo o fabricante ' protocolo s.
   Nota: Normalmente, bOVA contém biotina 2 M por 1 M de óvulos em média.
2. DC2.4 crescer células em RPMI-1640 suplementado com 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais de 0,1 mM, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 55 mM 2-Mercaptoetanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) e soro fetal bezerro de 10% (doravante RPMI) a 37 ° C em 5 % CO ₂ em uma incubadora umidificada (doravante sem menção, as células são incubadas a essa condição). Também é possível usar DMEM supleme....

Results

Para elucidar o mecanismo molecular da CP, é necessário identificar os compartimentos celulares, onde se submeter a antígenos exógenos ERAD, como transporte e processamento. Enquanto observações por microscopia de imunofluorescência ou microscopia eletrônica identificaram o compartimento celular onde antígenos exógenos acumularam^16,17,18,19

Discussion

Em estudos anteriores de CP, os antígenos exógenos incorporados acumularam na área restrita do atrasado endosome ou ER por microscopia de imunofluorescência^16,30,31,32. Estima-se que ERAD, como transporte e processamento de antígenos exógenos são realizados nestas áreas especializadas da ER ou endossomo atrasado, como o compartimento celular foi identificado pela sacarose ou iodixanol usando de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco da life technologies	11875-093
Soro fetal bovino	Equitech bio	SFB30
Pirouvato de sódio	gibco da life technologies	11360-070
MEM aminoácidos não essenciais	gibco da life technologies	11140-050
HEPES	gibco da life technologies	15630-080
2-mercaptoetanol	gibco da life technologies	21985-023
L-glutamina	gibco da life technologies	25030-164
Penisicilina-Sreptomicina	gibco da life technologies	15140-122
DMEM	gibco da life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotina-proteína kit de rotulagem	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacistina	SIGMA	L6785
Homogeneizador Dounce	IUCHI	131703
coquetel inibidor de protease	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-contas magnéticas	New England Biolabs	201270
contas magnéticas de controle	Chemagen	M-PVA012
suporte magnético	BD Biosciences	552311
kit de ensaio de proteína BCA	Thermo Fisher Scientific	23225
kits de coloração de prata	Cosmo bio 423413
Lisado de Reticulócitos	Promega
Bandeira marcada ubiquitina	SIGMA	U5382
anti-ovalbumina (OVA, mouse)	Antibody Shop	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitina (mouse)	MBL	D058 e menos;
anti-Bandeira (mouse)	SIGMA	F3165
tripsina	SIGMA	85450C