Her beskriver vi en metode mottagelig å samtidig quantitate og genomet-stort kart ribonucleotides i svært intakt DNA på enkelt-nukleotid oppløsning, kombinere enzymatisk spalting av genomisk DNA alkalisk hydrolyse og påfølgende 5´-ende sekvensering.
Etablerte tilnærminger til å beregne antall ribonucleotides i et genom er begrenset til kvantifisering av innarbeidet ribonucleotides bruker kort syntetiske DNA fragmenter eller plasmider som maler og deretter ekstrapolere resultatene til hele genomet. Eventuelt kan antall ribonucleotides i et genom estimeres alkaliske gels eller sørlige blots. Nyere i vivo tilnærminger ansette neste generasjons sekvensering tillate genomet hele kartlegging av ribonucleotides, posisjon og identiteten til innebygde ribonucleotides. Men tillater de ikke kvantifisering av antall ribonucleotides som er innlemmet i et genom. Her beskriver vi hvordan kart og quantitate antall ribonucleotides som er innlemmet i menneskelig Mitokondrielt DNA i vivo av neste generasjons sekvensering samtidig. Vi bruker svært intakt DNA og innføre sekvens bestemt dobbel-strand bryter ved fordøye det med en endonuclease, senere hydrolyzing innlemmet ribonucleotides med lut. Genererte endene er samskrevet med kort, og disse er sekvensielt på en neste generasjons sekvensering maskin. Absolutte antallet ribonucleotides kan beregnes som antall leser anerkjennelse område per gjennomsnittlig antall leseoperasjoner på webområdet anerkjennelse for sekvensen bestemte endonuclease. Denne protokollen kan også brukes til å tilordne og quantitate gratis kutt i DNA og lar tilpasning til andre DNA lesjoner som kan behandles tilordnes 5´-OH ender eller 5´-fosfat ender. Videre, denne metoden kan brukes til enhver organisme, gitt at en passende referanse genom er tilgjengelig. Denne protokollen gir derfor et viktig verktøy for å studere utryddelse, 5´-end behandling, DNA skade og DNA-reparasjon.
I en eukaryot celle er konsentrasjonen av ribonucleotides (rNTPs) mye høyere enn konsentrasjonen av deoxyribonucleotides (dNTPs)1. DNA polymerases diskriminere mot ribonucleotides, men dette diskriminering er ikke perfekt, og som en konsekvens, ribonucleotides i stedet for deoxyribonucleotides kan innlemmes i genomer utryddelse. Ribonucleotides kan være de vanligste ikke-kanoniske nukleotider innlemmet i genomet2. De fleste av disse ribonucleotides fjernes under Okazaki fragment modning RNase H2 initiert ribonucleotide excision reparasjon (RER) eller Topoisomerase 1 (omtalt i referanse3). Ribonucleotides som ikke kan fjernes bo stabilt inkorporert i DNA2,4 og kan påvirke det på både skadelig og gunstig måter (omtalt i gjennomgått5). Foruten å kunne fungere som positive signaler, for eksempel i parring type bytte i Schizosaccharomyces pombe6 og merke den nye DNA stranden under mismatch reparere (MMR)7,8, ribonucleotides påvirke den strukturen9 og stabilitet av omkringliggende DNA på grunn av 2´-hydroksyl gruppen av deres ribose10, noe som resulterer i replicative stress og genom ustabilitet11. Av ribonucleotides i genomic DNA (gDNA) og deres relevans for replikering og reparerer mekanismer, samt implikasjonene for genomet stabilitet, gir grunn til å undersøke sine presise forekomst og frekvens på genomet-bred måte.
RNase H2 aktivitet har ikke blitt funnet i menneskelige mitokondrier og ribonucleotides er derfor ikke effektivt fjernet i Mitokondrielt DNA (mtDNA). Flere veier er involvert i tilbudet av nukleotider til menneskelig mitokondrier og undersøke om forstyrrelser i mitokondrie nukleotid bassenget forårsake et forhøyet antall ribonucleotides i menneskelige mtDNA, vi utviklet en protokoll for kart og quantitate disse ribonucleotides i menneskelig mtDNA isolert fra fibroblaster HeLa celler og pasienten cellen linjer12.
De fleste i vitro tilnærminger (omtalt i vurdert13) for å fastslå DNA polymerases’ selektivitet mot rNTPs er basert på én ribonucleotide innsetting eller primer forlengelsen eksperimenter der konkurrerende rNTPs er inkludert i reaksjonen Bland, slik at den identifikasjon eller relativ kvantifisering av ribonucleotide innlemmelse i kort DNA-maler. Kvantitativ tilnærminger på korte sekvenser kan ikke reflekterer dNTP og rNTP bassenger i mobilnettet konsentrasjoner og derfor gir innsikt i polymerase selektivitet men har begrenset betydning om hele genomer. Det har vist at relative ribonucleotides innlemmet under replikering av en lengre DNA-malen, for eksempel en plasmider, kan visualiseres på en sekvensering gel bruker radiolabeled dNTPs og hydrolyzing DNA i et alkalisk miljø14. Videre har gDNA blitt analysert på sørlige blots følgende alkalisk hydrolyse, slik at strand-spesifikke undersøkelser og fastsettelse av absolutt priser ribonucleotide innlemmelse i vivo15. Disse tillate en relativ sammenligning av inkorporering frekvens men levere ingen innsikt plasseringen eller identiteten til innarbeidet ribonucleotides. Nye tilnærminger til å analysere ribonucleotide innholdet i gDNA i vivosom HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19, dra nytte av de innebygde ribonucleotides følsomhet for alkaliske eller RNase H2 behandling, henholdsvis, og benytte neste generasjons sekvensering å identifisere ribonucleotides genomet-wide. Disse metodene gir innsikt i absolutt innlemmelse hyppigheten av de oppdaget ribonucleotides. Legger til trinnet sekvens bestemt enzymatisk cleavage HydEn-seq-protokollen, metoden som beskrives her beleilig utvider opplysningene du får en sekvensering tilnærming, slik at samtidig kartlegging og kvantifisering av innebygd ribonucleotides12. Denne metoden gjelder for nesten alle organisme gitt at svært intakt DNA ekstrakter kan genereres og et passende referanse genom er tilgjengelig. Metoden kan være tilpasset quantitate og bestemme plasseringen av alle leksjonen det kan bli fordøyd av en nuclease og forlater en 5´-fosfat eller en 5´-OH slutt.
Kart og quantitate ribonucleotides i genomic DNA, kombinerer metoden spalting av en sekvens bestemte endonuclease og alkalisk hydrolyse generere 5´-fosfat ender på steder der innpassing rekkefølgen for endonuclease er plassert og 5´- OH ender posisjoner der ribonucleotides lå. Siden de genererte ledige endene er senere samskrevet med kort og sekvensielt ved hjelp av neste generasjons sekvensering, er det viktig å bruke svært intakt DNA og unngå tilfeldige fragmentering under DNA utvinning og biblioteket forberedelse. Vurdere disse leser normalisert til lest på endonuclease cleavage nettsteder kan en samtidige kvantifisering og kartlegging av de oppdaget ribonucleotides. Gratis 5´-ender oppdages kontroll eksperimenter hvor alkalisk hydrolyse av DNA er erstattet av behandling med KCl. Ervervet dataene gi innsikt i ribonucleotide plassering og antall og gir analyser med hensyn til ribonucleotide innhold og innlemmelse frekvens.
Her presenterer vi en teknikk for å samtidig kart og kvantifisere ribonucleotides i gDNA og mtDNA spesielt enkle innføringen av DNA cleavage ved sekvens bestemte områder i genomet som et tillegg til etablerte HydEn-seq-protokollen. Mens denne studien fokuserer på menneskelige mtDNA, ble opprinnelig HydEn-seq metoden utviklet i Saccharomyces cerevisiae, illustrerer metodens oversettelse til andre organismer12,16.
For pålitelig resultatene fra denne tilnærmingen, noen viktige skritt bør bemerkes: (A) siden sekvensering kort ligate til alle tilgjengelige 5´-ender, er det avgjørende å jobbe med svært intakt DNA. DNA skal isoleres biblioteker gjøres helst umiddelbart etter DNA isolasjon og DNA kan lagres på 20 ° C. Det anbefales ikke å lagre DNA i kjøleskapet for lenge eller å fryse og tine det gjentatte ganger. (B) for å generere egnet biblioteker med denne metoden, er det avgjørende å utføre KOH behandling av DNA i inkubasjon ovn, snarere enn en oppvarming blokk, sikre homogen oppvarming av hele utvalget og kvantitative hydrolyse. (C) er det viktig å kontrollere kvaliteten på biblioteker før pooling og sekvenser. DNA bør kvantifiseres og analysert ved hjelp av en automatisert geleelektroforese system for å sikre tilstrekkelige mengder biblioteket DNA, bekrefte riktig fragment størrelser, og se etter primer dimers.
For en meningsfull dataanalyse er det også viktig å merke seg at informativ verdien av denne metoden er avhengig av egnede kontroller å vurdere bakgrunn teller og orden eller strand biases. Vi oppnå rutinemessig en kartlegging effektivitet i KCl prøver av nær 70% når bare fordøye med sekvensen bestemte endonuclease (figur 2B, venstre panel). I tillegg er det viktig å bekrefte at endonuclease behandling ikke påvirker totalt påvisning av innarbeidet ribonucleotides ved å sammenligne HincII behandlet og ubehandlet prøver (figur 3B). I disse eksperimentene, har vi brukt HincII for å innføre stedsspesifikke kutt, men andre Hi-Fi-begrensning enzymer kan også brukes.
Protokollen kan tilpasses å studere andre typer DNA lesjoner som kan sendes til 5´-fosfat eller 5´-OH ender. Nøyaktigheten av resultatene er avhengig av spesifisitet av behandling og krever egnede kontroller (f.eks villtype eller ubehandlet) for bekreftelse. Videre, når du tilpasser denne metoden for andre programmer eller for bruk med andre organismer, bør man vurdere at metoden i sin nåværende installasjonsprogrammet krever ca 1 µg av DNA som behandles i et bibliotek. Siden antall ender er avhengig av antall innebygde ribonucleotides, som varierer avhengig av organismen eller mutant, prøver inkludert et lavere antall ribonucleotides ville kreve flere innkommende DNA for å generere et tilstrekkelig antall ender i den etterfølgende biblioteket konstruksjon. Tilsvarende, hvis DNA-prøver har en mye høyere antall ribonucleotides, vil det også kreve bruke mindre inn DNA for å oppnå optimale forhold for hemorroider og andre strand syntese PCR forsterkning. Det er bemerkelsesverdig at biblioteket bygging som beskrevet i denne protokollen også generert angående kjernefysiske genomet (som vist i figur 2D) og bare dataanalyse ble fokusert på mtDNA. Dette illustrerer at større genomer med moderat lavere ribonucleotide frekvenser er også fanget av denne metoden.
Når denne metoden, visse begrensninger bør tas i betraktning: selv om denne metoden bør, i teorien være gjelder for nesten alle organisme, en passende referanse genom er nødvendig for justering av leser. Videre representerer resultatene fra våre Protokoll lest fra et stort antall celler. Bestemt ribonucleotide innlemmelse mønstre av en gruppe celler kan ikke identifiseres ved denne tilnærmingen. Hvis ribonucleotides er tilordnet i større genomer med et svært lavt antall ribonucleotides, det kan være utfordrende for å diskriminere ribonucleotides fra tilfeldige kutt og aktuelle kontroller er derfor nødvendig.
Metoden som beskrives her, utvider tilgjengelig i vivo teknikker som HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19. Disse dra nytte av den innebygde ribonucleotides’ følsomhet for alkaliske eller RNase H2 behandling, henholdsvis ansette neste generasjons sekvensering å identifisere ribonucleotides genomet hele, som gjør deres kartlegging og sammenligning av relativ innlemmelse. Av cleaving DNA sekvensen spesielt, som beskrevet ovenfor, i tillegg til alkalisk hydrolyse på innebygde ribonucleotides, kan lest for ribonucleotides være normalisert til nettstedene cleavage, slik at ikke bare identifikasjon og tilordning av ribonucleotides, men også deres kvantifisering for hver DNA-molekylet. Anvendelsen av vår teknikk i sammenheng med sykdommer relatert til utryddelse, DNA-reparasjon og TLS kunne gi en dypere forståelse av rollen ribonucleotides i underliggende molekylære mekanismer og genom integritet generelt.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av svenske Research Council (www.vr.se) gir ARC (2014-6466 og svensk Foundation til strategisk forskning (www.stratresearch.se) til ARC (ICA14-0060). Chalmers Tekniska högskola gitt økonomisk støtte til MKME under dette arbeidet. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |