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Summary

Esta técnica descreve um processador de imagem de lote automatizado projetado para medir raios de cápsula e corpo de polissacarídeo. Embora inicialmente projetado para medições de Cryptococcus neoformans cápsula o processador de imagem automático também pode ser aplicado a outra detecção de contraste à base de objetos circulares.

Abstract

O objetivo desta técnica é fornecer um processo consistente, preciso e gerenciável para grande número de medições da cápsula de polissacarídeo.

Primeiro, uma imagem de limiar é gerada com base nos valores de intensidade calculados exclusivamente para cada imagem. Em seguida, círculos são detectados com base no contraste entre o objeto e o plano de fundo usando o algoritmo de transformação de Hough de círculo (CHT) bem estabelecida. Finalmente, a célula detectado cápsulas e corpos são comparados de acordo com o tamanho do raio e as coordenadas do centro, e dados são exportados para o usuário em uma planilha gerenciável.

As vantagens desta técnica são simples, mas significativo. Primeiro, porque esses cálculos são executados por um algoritmo, ao invés de um ser humano tanto a precisão e a confiabilidade são aumentadas. Não há nenhuma diminuição na precisão ou confiabilidade independentemente de quantas amostras são analisadas. Em segundo lugar, esta abordagem estabelece um potencial o procedimento padrão para o campo de Cryptococcus em vez da situação atual onde cápsula medição varia de acordo com o laboratório. Em terceiro lugar, dado que a medição manual da cápsula é lentas e monótonas, automação permite medições rápidas em um grande número de células de levedura que por sua vez facilita a análise de dados de alta taxa de transferência e estatísticas cada vez mais poderosas.

As principais limitações desta técnica vem como as funções do algoritmo. Em primeiro lugar, o algoritmo só irá gerar círculos. Enquanto as células Cryptococcus e suas cápsulas assumem uma morfologia circular, seria difícil aplicar esta técnica para detecção de objeto não-circular. Em segundo lugar, devido a como os círculos são detectados o algoritmo CHT pode detectar enormes círculos pseudo baseados-se nas bordas exteriores de vários círculos em cluster. No entanto, qualquer deturpados corpos celulares, pego dentro do círculo de pseudo podem ser facilmente detectados e removidos os conjuntos de dados resultantes.

Esta técnica é destinada a medir as cápsulas circulares polissacarídeo de espécies de Cryptococcus baseado em microscopia de campo claro tinta nanquim; Embora poderia ser aplicada para outro contraste com base em medições objeto circular.

Introduction

Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica ubiquitously encontrada ao redor do globo que está associado com doença humana principalmente em populações de imunossuprimidos. C. neoformans mais notavelmente representa uma importante causa de mortes anuais totais na África subsahariana devido a doenças infecciosas¹. A principal manifestação clínica de infecção criptocócica é meningoencefalite, que segue a invasão do sistema nervoso central de transportes em macrófagos infectados (forma de cavalo de Troia) ou cruzamento direto da barreira sangue – cérebro. C. neoformans manifesta vários fatores de virulência, incluindo a capacidade de replicar na temperatura do corpo humano, a atividade da urease, melanização e formação de uma cápsula de polissacarídeo². A cápsula de polissacarídeo é composta de repetição glucuronoxylomannan e glucoronoxylomannangalactan de polímeros e funções como uma barreira protetora contra fatores como estresse ambiental e de respostas imunes do hospedeiro².

Embora o tamanho do tamanho da cápsula de polissacarídeo criptocócica não foi consistentemente associado com virulência, há provas de que é um fator na patogênese^{2,3,4,5, 6,7}. Cápsula tamanho está associado a meningite patologia⁶, pode afetar a capacidade de macrófago para controlar a infecção de Cryptococcus ⁵e pode resultar em perda de virulência se ausente⁸. Daí, medições do tamanho da cápsula são comuns em pesquisa criptocócica, mas não há nenhum fieldwide padrão para um método de medição da cápsula.

Atualmente, c. neoformans polissacarídeo cápsula medida baseia-se na medição manual de imagens de microscopia, e os métodos exatos de aquisições tanto imagem e medição variam entre laboratórios^{9,10, 11}. Uma preocupação imediata para este método é que alguns estudos exigem a aquisição de milhares de medições individuais, o que torna difícil a manutenção de precisão e confiabilidade. Além disso, mesmo quando os resultados são publicados, lá é muitas vezes insuficiente descrição do método de medição. Muitas publicações não explicam como foram obtidas as medidas, utilizou-se o que plano focal, como determinado o limiar para identificação da cápsula, se eles usaram o raio ou o diâmetro, eles utilizado uma medição ou a média de vários, ou outros detalhes. Algumas publicações único Estado seu método como qual programa foi usado, por exemplo, “Adobe Photoshop CS3 foi usado para medir as células”¹¹. Esta falta de padronização e relatando detalhes pode dificultar a reprodutibilidade se não impossível. Diferenças na visão humana, brilho do computador, configurações do microscópio, deslize a iluminação, e outros fatores podem variar não só entre indivíduos, mas entre as amostras, Considerando que cálculos baseados em proporções de valores de intensidade do pixel permanecerá constantes e aplicáveis entre as amostras. Esta técnica foi gerada no contexto de fornecer uma técnica padronizada, precisa, rápida e simples para medir tamanhos de cápsulas para um campo em que não havia nenhum antes.

Como mencionado anteriormente, o algoritmo CHT é bem estabelecida, e scripts para detectar automaticamente os círculos foram escritos antes. Esse método melhora em duas áreas onde outros scripts que ficam aquém. Em primeiro lugar, simplesmente detectar círculos não é suficiente, porque com células criptocócica devem ser detectados dois círculos distintos em relação à outra. Esse método especificamente detecta corpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre os dois e realiza cálculos apenas sobre os pares de corpo-cápsula relevantes. Em segundo lugar, mesmo quando seguir o mesmo protocolo, diferentes investigadores vai acabar com diferentes adquiridas imagens. Permitindo o controle do investigador sobre cada parâmetro de algoritmo, esta ferramenta pode ser ajustada para coincidir com uma ampla gama de métodos de aquisição. Não há nenhuma necessidade para um escopo padronizado, objetivo, filtro e assim por diante.

Esta técnica pode ser aplicada facilmente a qualquer situação em que o investigador precisa detectar círculos dentro de uma imagem que contrastam com o fundo. Ambos os círculos mais leves e mais escuros do seu plano de fundo pode ser detectado, contados e medidos usando esta técnica.

Protocol

1. preparação de tinta nanquim Slide Pipete 10 µ l de amostra criptocócica numa lâmina. Qualquer levedura circular irá funcionar, mas para este experimento H99 foi a única estirpe utilizada.Nota: Se a amostra for directamente a partir de meios de cultura, diluição 1:2 com PBS ou água pode ajudar a prevenir a tinta da Índia de aglutinação. Pipetar 2 µ l de mancha de tinta da Índia para a amostra e misture fisicamente empurrando a ponta da pipeta para a amostra e movendo-se em movimentos circulares até que a tinta da Índia aparece uniformemente distribuída. Coloque uma lamela sobre a amostra, pressionando a borda esquerda da lamela contra a superfície da lâmina, então delicadamente e uniformente abaixando o lado oposto da lamela da amostra. O slide para o ar deixe secar por 5 min. Aplica suavemente uma leve camada de verniz para fronteira lamela para formar um selo e preservar a mancha de tinta nanquim. 2. Slide de imagem Coloque slides em um microscópio de campo claro com um acessório de câmera e conversão de pixel-a-micron conhecido. Ajuste contraste, objectivos e filtros para que cápsulas de célula são claras e corpos celulares são bandas focadas, escuras.Nota: Vários filtros, objectivos e configurações de contraste vão trabalhar, mas recomenda-se um 20 x objetivo, Ph1 filtro e binning 2×2. Certifique-se que o campo de visão é denso mas não superpovoado com células criptocócica, com claro contraste entre a cápsula de célula e plano de fundo e devidamente concentrado com o corpo de célula visualizado como uma banda escura.Nota: O número exato de células para uma imagem ideal pode variar dependendo da amostra e o objetivo sendo usado. Os aspectos importantes são para células não sejam agrupados ou sobrepostos, que os aviões focal de célula não variam significativamente, e que há significativa Nanquim mancham claramente visível no plano de fundo (pelo menos 25% do campo). Salve imagens em um único diretório com títulos claros, como o algoritmo de medição será executado em imagens em um único diretório e os dados de saída serão organizados de acordo com os nomes dos arquivos de imagem. 3. algoritmo Setup Instalar a versão do Python 2.7 de Instalar bibliotecas python adicionais executando os comandos “pip install travesseiro” e “pip install openpyxl”. Instalar o MATLAB, seguindo as instruções no Compilar a biblioteca python MATLAB, seguindo as instruções fornecidas no https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html. Baixe os três arquivos necessários incluídos em materiais suplementares a este manuscrito (“QCA.py”, “Analysis2.m” e “TestRun.m”).Nota: Esses arquivos podem ser extraídos para qualquer local, mas todos os três devem estar no mesmo diretório. 4. utilização do algoritmo Execute o aplicativo clicando duas vezes em QCA.py.Nota: A aplicação pode levar alguns minutos para começar. O arquivo “QCA.py” contém a estrutura de programa que chama os arquivos “. m” para executar o algoritmo real. Siga as etapas descritas no programa. Entrada, o tipo de extensão de arquivos de imagem, precedido por um ponto e separados por ponto e vírgula (ex. “. TIF;. JPEG”) em seguida clique no botão Enter . Escolha o diretório no qual os arquivos de imagem estão localizados clicando no botão Selecionar diretório e selecionando a pasta que contém as imagens. Gera a lista de arquivos de imagem no diretório clicando no botão Gerar lista de imagem . As imagens serão listadas na caixa de texto à direita. Revisar e assegurar que a lista é exacto e completo. Selecione uma imagem aleatória da lista para usar como uma visualização clicando no botão Selecionar imagem aleatória .Nota: Se a imagem for não é possível abrir devido a um erro de modo”imagem incorreta”, o algoritmo ainda funcionará correctamente apesar de não exibir a imagem. Após a etapa 4.2.7, ainda exibirá a imagem de teste. Objetivo do microscópio e binning configurações de entrada. Se as configurações padrão não coincidem com o microscópio usado, selecione “Custom Pixel conversão” e a conversão de pixel-para-um para os arquivos de imagem de entrada. Uma vez selecionado, clique no botão Calcular conversão e assegurar que a conversão está correta de acordo com a caixa de texto à direita.Nota: Imagens representativas, mostradas na Figura 1 foram calculadas com 40 x ampliação e 2×2 binning selecionado. Parâmetros de algoritmo para a deteção do círculo de entrada. Entrada do raio máximo e mínimo detectável para a deteção da cápsula externa como as entradas de Min e Max cápsula Radius. Um intervalo menor permitirá obter resultados mais precisos. Entrada do raio mínimo e máximo detectável para detecção do corpo celular como as entradas de Min e Max corpo celular Radius.Nota: Todos os quatro dessas entradas devem ser números representando seus respectivos valores em pixels, de acordo com as imagens de origem. Mova os controles deslizantes de cápsula e sensibilidade do corpo celular para ajustar o limiar de sensibilidade do algoritmo. Uma baixa sensibilidade será rigorosa e reduzir a deteção do círculo positivo falso, mas também pode detectar círculos reais menos. Por outro lado, uma alta sensibilidade aumentará a taxa de detecção, mas também pode resultar em falsos positivos círculos.Nota: Resultados representativos foram obtidos com um raio mínimo de cápsula de 7 raio máximo de cápsulas de 45, raio de corpo mínimo de 4, raio máximo de corpo de 30, cápsula sensibilidade de 87 e a sensibilidade do corpo de 87. Teste os parâmetros na imagem aleatoriamente selecionado clicando no botão Executar teste . O resultado será exibido no centro superior do programa, substituindo a imagem original. Se os resultados precisos, é recomendável para selecionar uma imagem aleatória adicional para tentar garantir que os parâmetros selecionados vão caber todas as imagens selecionadas também. Maximizar o número de corpos e cápsulas detectado e inspecionam visualmente se os círculos parecem caber corretamente. O número de corpos dentro de cápsulas detectados será exibido na caixa de texto à direita. Caso contrário, manipule os parâmetros de algoritmo até que os resultados são precisos.Nota: Os espesso círculos coloridos são apenas para ajudar com a visualização. Os círculos reais gerados para medição é uma curva matemática calculada pelo algoritmo HCT. Execute o algoritmo de detecção em todo o diretório de arquivos de imagem clicando no botão Iniciar análise . Cada imagem será analisada e o programa irá exibir “terminado” na caixa de texto para a direita quando todas as imagens foram analisadas. Clique no botão de partida e limpeza . Isto corresponder detectados corpos celulares para as cápsulas detectados que residem no e calcular o raio da cápsula verdadeiro subtraindo o corpo da cápsula.Nota: Se o algoritmo está sendo usado para detectar fluorescência ou outra situação em que apenas um círculo é detectado este passo é desnecessário. Em vez disso, clique os Corpos apenas puxar ou o botão de Cápsulas só puxar para coletar os dados para somente o azul ou só os círculos verdes, respectivamente. É importante notar que se apenas os dados da cápsula são recuperados o raio irá se referir o raio total da célula como o raio do corpo celular não poderia ser subtraído. Localize os dados concluídos no arquivo “CleanedOuput.csv” no diretório de imagens. Se apenas uma parte dos dados foi seleccionada, o arquivo será rotulado “CleanedBodies.csv” ou “CleanedCapsules.csv”.

Representative Results

Imagens primeiro são obtidas pela microscopia de Nanquim slides usando um microscópio de campo claro, juntamente com uma câmera (Figura 1A). É importante que as células separadas e em densidade suficientemente baixa para não sobrecarregar o campo de visão, bem como como usar bastante mancha para criar contraste entre células e plano de fundo. Conforme o protocolo, o número exato de células para uma óptima imagem irá variar depende…

Discussion

Os passos críticos desta técnica estão preparando o slide de tinta nanquim e aquisição de imagens do microscópio. Enquanto o algoritmo foi testado com êxito com uma variedade de técnicas de slide e imagem o protocolo recomendado é descrito neste manuscrito. A cápsula de polissacarídeo é detectada com base na exclusão de partículas de tinta da Índia do domínio da cápsula como estas partículas são muito grandes para penetrar a rede de fibrila de polissacarídeo. Exclusão de Nanquim resulta em um círcul…

Materials

India Ink	Becton, Dickinson and Co.	261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-B	22×22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish	Sally Hansen	N/A	109 invisible
SAB Media	Sigma	S3306
Cryptotoccus neoformans	ATCC	208821	H99 strain
Olympus AX70 Microscope	Olympus	AX70TRF	Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB	MathWorks	N/A	Most recent version recommended
Python Programming Language	Python	N/A	Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P3813