Reverter a dissecção e dados DiceCT revelar outra forma escondida na evolução do primata rosto

Musculatura mimética, ou musculatura de expressão facial, é o músculo esquelético e é encontrada em toda a Mammalia¹. Enquanto o músculo esquelético mais mamífero anexa a discretos Marcos ósseos, musculatura mimética é única em seus anexos principalmente na pele da face, couro cabeludo e o aspecto ventral do pescoço^{1,2,3, 4}. Contração da musculatura mimética deforma a "máscara facial" em expressões ou facial exibe de intenção social e emocional, altera o tamanho e a forma dos esfíncteres do olho, cavidade nasal e cavidade oral, usada na alimentação, respiração e em vocalizações, e é parte integrante do mecanismo de comunicação visual em geral de arrumação encontrado entre a maioria dos mamíferos^2,3,4,5. Do outro lado Mammalia, o facial exibe gerado pelos músculos miméticas assistir na regulação e manutenção limites territoriais, os laços sociais e o grupo social por cuing coespecíficos as intenções emocionais e comportamentais do remetente^{2, 5}.

Entre os mamíferos, os primatas são caracterizados em parte como empregar um alto nível de comportamento social em todo o ciclo de vida com todas as espécies vivem em um grupo social^2,5. Enquanto alguns táxons, tais como os galagos noturnos e Lóris, podem viver em grupos constituídos apenas por uma mãe e prole, outras categorias, como os macacos diurnos e babuínos, pode viver em grupos de mais de 100 indivíduos⁶. Não importa o tamanho do grupo social, primatas costumam usam comportamentos sociais estereotipados associados com rank e territorialidade e esses comportamentos tipicamente incluem uma componente de exibição facial. Exibe faciais é parte do processo de manutenção de laços entre membros de grupos sociais, hierarquias de dominância, reprodução e comunicação que faz parte da vida diária, especialmente em espécies diurnas^2,5,7 . Enquanto está claro há algum tempo que a musculatura facial é usada para criar estas exposições faciais, só recentemente tornou-se evidente que a fisiologia e a forma da musculatura facial são associados com as exigências funcionais de variáveis sociais^{2, 8}. Estudos anteriores sobre filogeneticamente e comportamentalmente diversas gamas de primatas têm demonstrado que espécies diurnas, vivendo em grande, grupos sociais complexos tendem a ter um número elevado de exposições faciais discretas que se concentram no movimento dos lábios, sobrancelhas, pálpebras e com um elevado número de músculos faciais, agrupados ao redor dos lábios e região orbital⁹. Em contraste, há poucos estudos sobre espécies noturnas, vivendo em pequenos grupos, mas estas espécies têm um número elevado de músculos faciais discretos com acessórios em torno do ouvido externo e lábios, que podem estar associados com os movimentos da orelha e lábios (que tem sido documentada em algumas espécies noturnas, no encontros agonísticos com coespecíficos e localizando sons)^2,9,10,11. Além disso, os seres humanos têm uma percentagem relativamente mais elevada de fibras de contração lenta miosina na musculatura mimética que macacos rhesus ou chimpanzés, o que podem estar relacionados com o "abrandamento" na contração da musculatura mimética humana ao redor dos lábios usado durante a produção dos sons da fala ou a capacidade de resistência a fadiga geral do músculos⁸.

Os seres humanos são, sem dúvida, o mais social de todos os primatas e desenvolveram a linguagem como uma componente de comunicação social. Ainda assim, porém, os seres humanos usam expressão facial como um meio de comunicação visual e tem o maior repertório de visor facial conhecida entre os primatas. Em um esforço para entender mais completamente as variáveis que rodeiam a evolução do comportamento social de primatas humanos e geral, uma maior compreensão da morfologia e fisiologia da musculatura mimética primata é altamente desejáveis. Porque a musculatura mimética é anexada à pele em si e pode, em algumas espécies, ser excepcionalmente fina e difícil de Visualizar, desenvolvemos um método exclusivo de visualizar esta musculatura para ambos os processos de gravação bruta de presença/ausência e anexos, bem como a amostragem para processamento de microanatomical.

"Dissecação reversa" é um método para preservar a musculatura mimética, removendo a máscara facial inteira da cabeça e aumentando a visibilidade do mesmo pequenos músculos. Porque dissecação reversa é um processo destrutivo, espécimes raros e valiosos não podem sempre estar disponíveis para esta metodologia. DiceCT é um método eficaz que pode visualizar muitos dos músculos miméticas em espécie mesmo minúsculo^12,13,14. Esse método pode ser usado em concerto com dissecação reversa ou no caso de espécimes raros, valiosos não podem ser dissecados e podem fornecer muitas informações sem ter que remover a máscara facial em "dissecação reverso"^{12,13, 14}. O presente protocolo descreve um conjunto de métodos para a combinação inversa dissecação com DiceCT a fim de examinar a musculatura mimética primata.

Porque esses procedimentos usam animais que morreram de causas naturais em zoológicos ou foram sacrificados em laboratórios de pesquisa onde eles eram parte de estudos independentes, estes protocolos não requerem aprovações IACUC.

1. reverter a dissecação

Nota: O protocolo para dissecação reversa é eficaz para muito pequenos mamíferos, como ratos de laboratório, até a mamíferos terrestres, como o cavalo doméstico. Os músculos miméticas são frequentemente melhor preservados e melhor visualizados quando saiu com a derme sobrejacente ao invés de deixar para trás no crânio. Veja a Figura 1-3.

1. Desarticular a cabeça da parte cervical da coluna vertebral antes de procedimentos de dissecação. Se o cadáver estiver congelado, deixe-o descongelar completamente antes de prosseguir com este passo.
   1. Independentemente do estado de preservação, palpe a região occipital do crânio e o processo espinhoso da segunda vértebra cervical (C2). Observe que a primeira vértebra cervical (C1) não possui um processo espinhoso, então palpar C2 e a região occipital do crânio vai dar uma localização aproximada de C1.
   2. Usando um bisturi, fazer cortes horizontais entre a região occipital do crânio e C2 para começar separando o crânio da coluna vertebral em C1. Continue a fazer cortes até o crânio é desarticulado da coluna vertebral.
   3. Se o espécime é fresco e não fixada, passos 1.1.2-1.2 precisa ser executado em um período relativamente curto de tempo. Além disso, se o cérebro permanece intacto no interior da cavidade craniana, necrose do tecido neural pode prosseguir rapidamente, então é altamente recomendável que o cérebro ser retirado o cadáver, se a amostra permanece não fixada.
      Nota: Como um passo opcional, a amostra pode ser imerso em formol a 10% tamponada por 24 horas a fim de corrigir o espécime. Isto permitirá um procedimento de coleta de dados sem pressa.
   4. Se a amostra já é fixada com álcool etílico ou 10% tamponada de formalina, enxague durante várias horas com água fresca.
2. Faça incisões para liberar máscara facial do crânio. Se o cérebro e sobrejacente calvaria foram removidos durante a necropsia, fazer uma incisão perto da região glabelar do crânio e outro ao longo da face caudal do crânio onde o osso craniano está intacto.
   1. Uma vez que a amostra tenha sido lavada por várias horas, seque com papel toalha e transferência para trabalhar a estação.
   2. Palpe para a protuberância occipital externa na borda caudal (ou traseira) do crânio. Isto marca a área onde o crânio se encontra com a coluna vertebral. Usando um bisturi #4 para grandes espécimes ou um bisturi #3 para amostras pequenas, faça uma incisão de linha média, começando a protuberância occipital externa e vir rostral (ou para a frente) sobre a região frontal e parietal do crânio, região orbital e entre os olhos, abaixo da região nasal, todo o caminho até a área externa nasal entre as narinas.
   3. Fazer um corte na mandíbula entre os incisivos inferiores, centrais e mover caudalmente (ou para trás) em direção à clavícula.
   4. Escolha um dos lados da máscara facial para remover e deixar o outro lado no lugar.
3. Solte um dos lados da máscara facial do crânio.
   1. Começando na região occipital, use o bisturi para cortar a máscara facial, incluindo a musculatura mimética, longe do osso occipital do crânio, puxando a máscara rostral (ou para a frente) e lateralmente (ao lado). Corte o músculo occipitalis longe do crânio, deixando uma pequena quantidade de músculo atrás no crânio para que sua fixação ainda pode ser visualizada, uma vez que a máscara facial foi removida. Deixando uma parte do músculo atrás no crânio ósseo/cartilaginoso, os anexos podem ser preservados para gravação em um momento posterior.
   2. Uma vez que o ouvido externo é atingido, localize os músculos auriculares. Corte através destes para que uma pequena porção de cada permanece com o crânio. Corte a cartilagem elástica, anexar o ouvido externo do crânio.
   3. Continue a puxar a máscara rostral e liberar cada músculo mimético do crânio, deixando uma pequena porção de cada músculo para trás no crânio.
   4. Uma vez que há uma máscara facial intacta de um lado do crânio, permita a ficar de fora, exposta ao ar, por uma hora (para amostras pequenas como um rato de laboratório) acima de três horas (para um espécime grande como um cavalo doméstico), com o lado de musculatura virada para cima. Esta etapa desidrata alguns do tecido conjuntivo a máscara de rosto e aumenta o contraste de cor entre o músculo e tecido conjuntivo.
4. Remova tecido suficiente para visualizar a musculatura.
   1. Usando um #3 bisturi, pinça e micro-tesouras, arrancam fora o tecido conjuntivo que separa a musculatura mimética de um ao outro.
   2. Para acessar a camada superficial da musculatura mimética nesta dissecação"reversa", suavemente levantar e separar a camada superficial a camada profunda da musculatura e remover o tecido conjuntivo circundante a musculatura superficial. A máscara facial resultante pode ser devolvida a formalina, e o procedimento pode ser pausado aqui antes de passar para dissecação mais ou coloração (etapa 2). Em cada etapa intermediárias na dissecação mais, permitir que a máscara facial secar bastante para que o tecido conjuntivo pode ser facilmente discernido do tecido muscular.

2. processo de coloração para DiceCT

Nota: Amostras devem ser fixadas em formol a 10% tamponada se DiceCT deve ser usado para preservar o tecido durante o processo de coloração moroso. Se a amostra ainda não foi corrigida, colocá-lo em um recipiente com bastante formalina 10% tamponada para submergir todo o tecido e deixá-lo por 48 horas.

1. Solução de iodo de Lugol 1,75% (m/v) de fazer (eu₂KI) para coloração de máscara facial.
   Nota: Basta fazer₂solução KI a submergir totalmente a máscara facial dentro do recipiente escolhido. Faz mais ou menos solução dimensionando os valores de ambos os solutos e solvente igualmente nas etapas 2.1.1 e 2.1.2.
   1. Sob uma coifa, adicione 3,50 g de iodeto de potássio (KI) para 200 mL de água destilada num copo de vidro grande. Misture usando vidro agitando a haste até dissolver totalmente.
      Cuidado: iodeto de potássio (KI) pode causar olho, pele e irritação respiratória ou danos. Usar óculos de proteção e manipular sob uma coifa.
   2. Adicionar lentamente 1,75 g de cristais de iodo (eu₂), mexendo até dissolver totalmente. Isso levará vários minutos.
      CAUTELA: Cristais de iodo (eu₂) podem causar olho, pele e irritação respiratória ou danos. Use proteção para os olhos e a pele e trabalhar sob uma coifa durante a manipulação deste produto químico.
   3. Filtrar a solução em frasco de vidro âmbar, usando papel de filtro com tamanho de poro de 11 mícrons para remover os cristais não dissolvidos que poderiam produzir coloração inconsistente.
      Atenção: Esta solução é altamente tóxica para a vida aquática. Não descarte da solução ralo. Em caso de derramamento, neutralizar Triiodeto aquoso (eu₃^–) em iodeto (I^–) com 5% (m/v) de tiossulfato de sódio (Na₂S₂O₃). Verifica condições de eliminação de resíduos institucionais para iodeto e descarte de resíduos em conformidade.
2. Manche a máscara facial.
   1. Coloque a máscara de rosto cortados lado para baixo em um vidro âmbar ou apaguei o recipiente (para manter para fora a luz) grande o suficiente para permitir que a máscara facial para descansar em uma forma natural e ser totalmente submerso.
   2. Despeje a solução do iodo de Lugol sobre a máscara de rosto até está completamente submersa. Um peso pode ser necessários para manter a máscara de rosto totalmente submergida e impedi-lo de flutuar para o topo da solução. Sele o recipiente para evitar a evaporação e manter para fora a luz.
   3. Agitar o recipiente continuamente em um balancim elétrico ou regularmente à mão para facilitar mesmo manchando e impedir que os cristais se contentar com pelo menos duas semanas. Se mais tempo é necessário para manchar adequadamente os fascículos do músculo, substitua a solução de Lugol solução fresca.
   4. Depois de duas semanas, retire a máscara facial da solução. Despeje uma pequena quantidade de água destilada sobre ambas as superfícies da máscara facial para enxaguar. Embrulhe a máscara facial em toalhas de papel húmido e coloque em um saco plástico selado pelo menos 24 horas permitir a ligeira secagem antes de passar para a próxima etapa.
      Nota: O protocolo pode ser pausado para até uma semana. Certifique-se de que a máscara facial permanece ligeiramente húmida durante este período.

3. DiceCT digitalização

1. Prepare-se para fazer a varredura de CT máscara facial.
   1. Monte as máscaras de rosto para um material de baixa densidade, como a espuma floral, para eliminar quaisquer rugas na máscara e para limitar o movimento da máscara como a máscara seca ligeiramente durante a verificação. Fixe a máscara facial para a espuma com palitos de madeira.
2. Definir os parâmetros de tomografia computadorizada e a digitalização.
   1. Use uma resolução alta para esses exames, como os pequenos fascículos vão ser obscurecidos com resolução menor. Usar um espaçamento de fatia inter e inter distância pixel em torno de 0,05 mm.
   2. Escaneie a máscara de rosto montado em um Scanner de Tomography computado High-Resolution raio-x.
   3. Se não puder ser visualizado totalmente, devido ao excesso de coloração, fascículos coloca máscara facial em solução de formalina 10% ou 5% de tiossulfato de sódio para remover parte da mancha. Se fascículos não são suficientemente manchados, volte a solução do iodo de Lugol. Depois de ajustar a coloração, examina-se a máscara de rosto novo. Continue a fazer os ajustes necessários e digitalizar até fascículos são capazes de ser totalmente visualizado.

4. prepare a máscara facial para preservação a longo prazo.

1. Quimicamente, neutralize a mancha de iodo da máscara de rosto, retirando o processo de coloração descoloração.
   1. Lugar manchado máscara facial em 5% (m/v) de solução de tiossulfato de sódio para neutralizar quimicamente espécime. Isso pode levar várias horas ou dias. Agite-se regularmente durante a descoloração.
   2. Retorne destained máscara para solução de formalina 10% para preservação. Se mancha continua a lixiviar fora da amostra em solução, substitua descolorida formalina formalina fresca até que continua a ser evidente para preservação a longo prazo.

Esta seção apresenta exemplos de resultados no formulário de musculatura facial que pode ser alcançado usando "dissecação reversa" em concerto com a varredura de DiceCT. Usando "dissecação reversa" para criar uma máscara facial, uma representação mais completa de mimética muscular (facial) às vezes pode ser vista do que na metodologia tradicional de dissecação. Este método funciona em uma variedade de tamanhos de corpo, desde os minúsculos, pequeno-bodied primatas, por exemplo o Sagui Callithrix jacchus (Figura 4), aos primatas de grande porte como o chimpanzé Pan troglodytes (Figura 5), e um primata de médio porte como o macaco rhesus Macaca mulatta (Figura 6). Metodologias tradicionais de dissecação podem funcionar bem em primatas de grande porte que têm musculatura robusta de mimética. No entanto, métodos de dissecação de abordagem tradicional"frontal" podem não funcionar bem com primatas pequeno encorpado que têm músculos faciais gracilis. Nestes casos, alguns da musculatura facial podem ser indistinguível do tecido conjuntivo circundante e podem ser perdida durante a dissecção.

A mancha de iodo ligado a musculatura mimética e de pelo menos alguns dos exames são de qualidade suficiente que nós possamos resolver ambos os músculos miméticas individuais (Figura 7), bem como fascículos musculares individuais (Figura 8) e, pela primeira vez, obter volumes de músculo inteiro destes músculos grácil. Como mostrado na Figura 7, alguns dos muito pequenos músculos associados com a orelha externa são claramente visíveis em exames DiceCT. Não é incomum para estes músculos ser desperdiçada em alguns procedimentos de dissecação reverso, talvez devido ao seu pequeno tamanho.

Figura 1 : Vista caudal (ou posterior) da cabeça desarticulada de um sagui comum (Callithrix jacchus) mostrando o início do processo para a criação da máscara facial em "dissecação reversa". Musculatura facial associada com o ouvido externo é mostrada no lado direito da máscara facial em desenvolvimento em tons de laranja. Tecido adiposo, ou gordura, é agrupada em torno da musculatura em tons de amarelo brilhante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Vista dorsal da cabeça de um Sagui (c. jacchus) mostrando a fase intermediária de criar a máscara facial na dissecação reversa, aqui, remoção da máscara da região orbital do crânio desarticulada. A seta preta sem rótulo indica a área onde os músculos como músculo orbicularis oculi estão localizados, antes da remoção do tecido conjuntivo. O músculo temporalis não é um músculo facial, mas é indicado para dar uma ideia da localização relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Vista do lado direito do sagui comum (c. jacchus) quase a fase final de criação da máscara facial no reversa dissecação, aqui removendo a máscara da região de lábio superior e inferior do crânio. O músculo masseter não é um músculo facial, mas é indicado para dar uma ideia da localização relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Visão profunda (ou dentro) do lado direito inteiro da máscara facial do sagui comum (c. jacchus), mostrando a máscara facial totalmente dissecada com músculos selecionados indicado. Vários músculos estão realçados com cor para indicar limites. Abreviaturas: AA - músculo auricularis anterior; DAO - músculo de oris do anguli abaixador; DLI - músculo de abaixador abaixador do lábio; LLS - músculo de superior do levator labii; OO - orbicularis oculi muscle; OOM - orbicularis oris muscular; PA - músculo auricularis posterior; SAL - auriculolabialis superior muscular; ZM - músculo maior zigomático; ZM - menor músculo zigomático. Esta imagem apareceu em tocas, 20082. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Visão profunda (ou dentro) do lado direito inteiro da máscara facial do chimpanzé-comum (Pan troglodytes), mostrando a máscara facial totalmente dissecada com músculos selecionados indicado. O músculo risorius é indicado aqui, um músculo que foi previamente pensado para estar presente entre os primatas apenas nos seres humanos. Esta imagem apareceu no Burrows et al, 2006,15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Visão profunda (ou dentro) do lado direito inteiro da máscara facial do macaco rhesus (Macaca mulatta), mostrando a máscara facial totalmente dissecada com músculos selecionados indicado. CS - músculo de onduladeira supercilli; OOM - orbicularis oris muscular; z menor - zigomático menor músculo; 1 - zigomático maior músculo; 2 - o orbicularis oculi muscle; 3 - caninus muscular; 4 - músculo de superior levator labii; 5 - músculo levantador do lábio superior alaeque músculo; 6 - músculo de septi do depressor; 7 - corte a extremidade do músculo buccinators; 8 - músculo de abaixador do depressor do lábio. Esta imagem apareceu no Burrows et al, 200916. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Visão profunda (ou dentro) do lado direito inteiro de varredura de um Eulemur flavifrons demonstrando as habilidades de DiceCT para pegar miméticas fibras musculares DiceCT. AA: músculo auricularis anterior; CN5: nervos cranianos 5; CN7: nervos cranianos 7; DH: músculo de helicis abaixador; DLI: músculo abaixador do lábio abaixador; F: frontalis porção do músculo occipitofrontal; H: helicis muscular; IAL: auriculolabialis inferior músculo; LL: músculo de labial levantador da; M: mentalis muscular; MA: músculo mandibuloauricularis; ML: músculo maxillolabialis; N: músculo nasal de; NL: músculo nasolabialis; O: occipitalis porção do músculo occipitofrontal; OccA: occipitoauricularis muscular; OO: músculo orbicular da boca; OOc: orbicularis occuli escrito muscular; P: platisma músculo; PA: músculo auricularis posterior; SAL: músculo auriculolabialis superior; T: tragicus muscular; TA: músculo de tragoantitragus por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8 : Visão profunda (ou dentro) do lado esquerdo inteiro de varredura de um Eulemur flavifrons demonstrando seriais seções em vários pontos DiceCT. Mancha azul mais profunda é de áreas onde há uma forte presença de mimética de fibras musculares (por exemplo, em torno da abertura do ouvido externo, secções a. e b. e a região orbital superior, seção c.). Mais leve mancha azul é das áreas onde há menos mimética fibra muscular (por exemplo, a região do lábio superior, seção d.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores têm sem divulgações de relatório.