Artigo de método

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

DOI:

10.3791/58523

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7 de janeiro de 2019

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1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Neste artigo

Resumo

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O presente estudo descreve um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção biomaterial associada ao longo do tempo com base em microscopia de fluorescência. Este modelo é um sistema promissor complementando modelos animais mamíferos, tais como modelos de rato para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

Resumo

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Infecção associada biomaterial (BAI) é das principais causas do fracasso de biomateriais/dispositivos médicos. Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos em BAI. Atual animal experimental de mamíferos BAI modelos tais como modelos de mouse são dispendiosos e demorados e, portanto, não é adequado para análise de alto rendimento. Assim, novos modelos animais como sistemas complementares para investigar BAI in vivo são desejados. No presente estudo, visamos desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção bacteriana na presença de biomateriais baseado em microscopia de fluorescência. Além disso, estudou-se a resposta de macrófagos provocado. Para este fim, usamos de expressar a proteína fluorescente S. aureus e embriões de zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes em seus macrófagos e desenvolveu um procedimento para injetar o músculo bactérias sozinhos ou em conjunto com microesferas tecido de embriões. Para monitorar a progressão da infecção bacteriana em embriões ao vivo ao longo do tempo, criámos um método simples mas confiável de marcar microscópica de bactérias fluorescentes. Os resultados de marcar microscópica mostraram que todos os embriões com mais de 20 unidades de formadoras de Colônia (UFC) de bactérias produziram um positivo sinal fluorescente de bactérias. Para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção, determinamos os números CFU de S. aureus com e sem 10 µm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriais modelo nos embriões. Além disso, usamos o arquivo de projeto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" operando em ImageJ para quantificar a intensidade de fluorescência da infecção por S. aureus com e sem PS10 ao longo do tempo. Os resultados de ambos os métodos mostraram números mais altos de S. aureus em embriões infectados com microesferas que em embriões sem microesferas, indicando uma susceptibilidade aumentada infecção na presença do biomaterial. Assim, o presente estudo mostra o potencial do modelo de embrião de peixe-zebra para estudar BAI com os métodos desenvolvidos aqui.

Introdução

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Uma variedade de dispositivos médicos (referido como "biomateriais") são cada vez mais utilizados na medicina moderna para restaurar ou substituir as partes de corpo humano1. No entanto, a implantação de biomateriais predispõe um paciente à infecção, chamada uma infecção associada biomaterial (BAI), que é uma grande complicação dos implantes em cirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis são duas espécies bacterianas mais prevalentes responsáveis por BAI2,3,4,5,6. Implantou a forma de biomateriais uma superfície suscetível à formação de biofilme bacteriano. Além disso, resposta imune local pode ser perturbada pelos biomateriais implantados, causando reduzida eficácia do apuramento bacteriana. A autorização inicial de infectar bactérias é realizada principalmente por infiltração de neutrófilos, fortemente reduzida capacidade bactericida na presença de um inserido ou implantado biomaterial7. Além disso, os macrófagos infiltrando o tecido após o fluxo inicial de neutrófilos será fagocitam as bactérias restantes, mas não pode efetivamente matá-los intracelular, devido a demente imunológico sinalizando que é uma consequência da presença combinada de o biomaterial e bactérias8. Assim, a presença de biomateriais pode facilitar a sobrevivência intracelular de bactérias9,10,11,12,13 e biofilme formação sobre o implantado biomateriais4,14. Consequentemente, BAI pode levar ao fracasso e a necessidade de substituição de biomateriais implantados, causando aumento de morbilidade e mortalidade e hospitalização prolongada com custos adicionais2,15.

Um número crescente de estratégias anti-BAI está sendo desenvolvidos2,16,17. Avaliação in vivo da eficácia destas estratégias em modelos animais relevantes é essencial. No entanto, a tradicional BAI animais modelos experimentais (por exemplo, modelos de rato, ) são geralmente caro, demorado e, portanto, não é adequado para testar a alta taxa de transferência de múltiplas estratégias18. O desenvolvimento recente de técnicas bio-óptico de imagem baseado em bioluminescentes/fluorescente rotular de bactérias e células hospedeiras pode permitir o monitoramento contínuo das interações hospedeiro-patógeno/hospedeiro-material e progressão de BAI em único pequenos animais como ratos18,19,20,21. No entanto, esta técnica é relativamente complexa e ainda em sua infância, e várias questões devem ser resolvidas para análise quantitativa de BAI18. Por exemplo, uma dose de alto desafio é necessário para visualizar a colonização bacteriana. Além disso, a luz espalhamento e adsorção de bioluminescência/fluorescência sinais em tecidos de mamíferos teste os animais também devem ser abordadas de19,18,21. Portanto, novo, cost-effective modelos animais, permitindo a visualização intravital e análise quantitativa ao longo do tempo são valiosos sistemas complementares para o estudo in vivo do BAI.

Zebrafish (embriões) têm sido usados como uma ferramenta versátil em vivo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro e patogênese da infecção de diversas espécies bacterianas como micobactérias22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, estafilococose Enterococcus faecalis2526,27. Zebrafish embriões têm muitas vantagens tais como a transparência óptica, um relativamente baixo custo de manutenção e a posse de um sistema imune altamente similar em mamíferos28,29. Isto torna o zebrafish embriões um organismo modelo altamente econômico, vivendo para visualização intravital e análise da progressão da infecção e hospedeiro associados respostas28,29. Para permitir a visualização do comportamento de célula zebrafish transgênicos, vivo em linhas com diferentes tipos de células do sistema imunológico (por exemplo,, de macrófagos e neutrófilos) e até mesmo com estruturas subcelulares fluorescente etiquetadas foram desenvolvidos28 ,29. Além disso, a taxa de reprodução alta de zebrafish fornece a possibilidade de desenvolver sistemas de teste de alto rendimento com injeção robótica automatizada, quantificação de fluorescência automatizada e de análise de sequência de RNA27, 30.

No presente estudo, objetivou-se desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para infecção associada biomaterial, usando técnicas da imagem latente de fluorescência. Para este fim, nós desenvolvemos um procedimento para injetar bactérias (S. aureus) na presença de microesferas de biomaterial no tecido muscular de embriões de peixe-zebra. Usamos o S. aureus RN4220 expressando mCherry proteína fluorescente (s. aureus- mCherry), que foi construída conforme descrito em outro lugar para S. aureus outra estirpe de10,31. A linha de zebrafish transgênicos (mpeg1: UAS/Kaede) expressando Kaede proteína verde fluorescente nos macrófagos32 e azul fluorescente poliestireno microesferas foram usados. Em um estudo anterior, mostramos que a injeção intramuscular de microesferas em embriões de peixe-zebra para imitar o implante do biomaterial é viável33. Para analisar quantitativamente a progressão de BAI e infiltração de célula associada em embriões única ao longo do tempo, usamos o arquivo de projeto "Zebrafish-Immunotest", que é operado dentro de "ObjectJ" (um plug-in para ImageJ) para quantificar a intensidade da fluorescência de as bactérias que residem e macrófagos, infiltrando-se nas proximidades do local da injeção de microesferas33. Além disso, nós determinamos os números de formadoras de Colônia (UFC) de unidades de bactérias na presença e na ausência de microesferas nos embriões para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção. Nosso presente estudo demonstra que, com os métodos desenvolvidos aqui, o embrião de zebrafish é promissor, a novo vertebrado modelo animal para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

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Protocolo

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Neste protocolo, manutenção de zebrafish adulto é em conformidade com os regulamentos locais de bem-estar animal como aprovado pelo Comitê de bem-estar animal local. Foram realizados experimentos com embriões de acordo com a Directiva 2010/63/UE.

1. preparação de "bactérias" e somente as suspensões de bactérias-microesferas

Nota: A tensão de RN4220 de S. aureus expressando a proteína fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry) é usada. A tensão de RN4220 de S. aureus é de mutação do gene regulador de virulência agrA (regulador de acessório gene A)34e portanto pode ter virulência relativamente baixa no modelo de embrião de peixe-zebra. Outras cepas de aureus S. ou outras espécies bacterianas para BAI podem ser usados.

  1. Tomar 4 a 5 colônias de bactérias de RN4220 de S. aureus de placas de cultura de ágar tryptic soja suplementadas com 10 cloranfenicol µ g/mL e a cultura de bactérias para a fase de crescimento meados-logarítmica em 10 mL de caldo tryptic soja suplementado com 10 µ g/mL cloranfenicol em 37 ° C, sob agitação.
    1. Durante a cultura, diluir 100 µ l da suspensão bacteriana em 900 µ l de solução salina estéril tampão de fosfato (PBS) em uma cubeta (largura de 1 cm), para uma medição de densidade óptica (OD) a 620 nm (OD620). Cultura de bactérias até o OD620 atinge 0,4 – 0,8.
      Nota: Uma OD620 de 0.1 geralmente corresponde a 3,0 x 107 UFC/mL de S. aureus. O OD620 de um inóculo de bactérias em fase de crescimento logarítmico meados é entre 0.4-0.8. Períodos de tempo diferentes para cultivo podem ser necessários para outras espécies e cepas de bactérias.
  2. Centrifugar as bactérias em 3.500 x g durante 10 minutos e ressuspender as bactérias peletizadas em 1 mL de PBS estéril. Posteriormente, lavar as bactérias com estéril PBS 2 vezes e finalmente Ressuspender as bactérias em 1,1 mL de solução a 4% (p/v) polivinilpirrolidona40 (PVP40) em PBS.
  3. Vórtice esta suspensão bacteriana e diluir 100 µ l de suspensão em 900 µ l de PBS estéril em uma cubeta para a medição de620 OD. Ajuste a concentração da suspensão bacteriana com solução PVP40 . Esta é a suspensão de ""bactérias-somente.
  4. Biomateriais podem ser escolhidos livremente para misturar com a suspensão bacteriana. No presente estudo, microesferas comercial poliestireno (PS) (azul fluorescente, 10 µm) são utilizadas. Para gerar uma suspensão de bactérias-microesferas, as microesferas por 1 min em 1.000 x g, temperatura de centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as microesferas na suspensão de ""bactérias-somente (em solução de40 PVP).
  5. Para injetar doses aproximadamente iguais de bactérias na presença e na ausência de microesferas, a concentração de bactérias-microesferas suspensão precisa ser dois terços da concentração da suspensão de ""bactérias-somente (sem microesferas). Isto é conseguido por diluir a suspensão de bactérias-microesferas com 0,5 volume da solução de40 PVP. Misture as suspensões por num Vortex. Digno de nota, esta proporção (dois terços) foi avaliada por S. aureus. É também apropriado para S. epidermidis, mas é aconselhável verificar se esta relação também se aplica às outras espécies bacterianas e outros tamanhos (de 10 µm) ou formas de biomateriais (que microesferas) deve ser injetado.
  6. Verificar a concentração da suspensão "bactérias" e somente bactérias-microesferas pela cultura quantitativa de 10 vezes diluições em série como abaixo: transferência 100 µ l das suspensões de um 96-placa e serialmente diluída pela transferência de 10 alíquotas µ l do suspensão em 90 µ l de PBS estéril. Placa duplicados 10 alíquotas de µ l das suspensões não diluídas e diluídas em placas de agarose, incubar as placas a 37 ° C durante a noite, contar as colônias e calcular o número de bactérias (unidades formadoras de colônia. CFU).

2. reprodução, colheita e manutenção de embriões de peixe-zebra

  1. Siga os procedimentos gerais descritos anterior35,36 para reprodução, colheita e manutenção de embriões de peixe-zebra, com modificações descritas abaixo. Atravessar uma família de tipo selvagem Tupfel barbatana longa (TL) zebrafish ou zebrafish da linha selecionada transgénico (aqui, Mpeg1: Kaede) em um tanque com uma rede adicionado para induzir as fêmeas adultas para produzir ovos, depois que a luz acende, então separar adultos dos ovos produzidos.
  2. Recolher os embriões no dia seguinte e descartar os transparentes que não são viáveis. Manter aproximadamente 60 embriões por placa de Petri (100 mm de diâmetro) na E3 médio37 e incubar a 28 ° C. Remover embriões mortos e anormais e atualizar o E3 meio diariamente.

3. preparação de agulhas de injeção

  1. Prepare as agulhas de conta de vidro para injeção usando um instrumento de extrator de micropipeta. Use as seguintes configurações: calor: 772, puxar: 100, vel: 200, altura: 40, gás: 75.
  2. Quebre a ponta da agulha com a pinça na posição onde a agulha tem um diâmetro exterior de cerca de 20 µm (para 10 µm microesferas), usando um microscópio de luz com uma barra de escala na ocular. Evite agulhas com um tamanho de abertura muito grande, pois eles irão comprometer a sobrevivência dos embriões.
    Nota: A abertura pode ser escolhida para ser menor ou maior, dependendo do tamanho e forma dos biomateriais para ser injetado. Na literatura, injeções com agulhas com uma abertura de aproximadamente 50 µm foram relatadas para causar uma diminuição significativa na sobrevivência de embriões38.

4. injeção de ""bactérias-somente ou suspensão de bactérias-microesferas em embriões de peixe-zebra

  1. Aquecer a solução de agarose (1-1,5% (wt) no demi-água) usando um forno de microondas e despeje em um prato de Petri-100mm. Um modelo de molde de plástico em cima a solução de agarose na prato de Petri de lugar para criar recuos no agarose para a colocação de embriões em posições adequadas, facilitando as injeções. Incubar a temperatura ambiente e retire o molde quando a solução de agarose solidificou.
  2. Na pós-fertilização 3 d, coloque os embriões em um prato de Petri de 100mm contendo 0,02% (p/v) de ácido 3-aminobenzoico (tricaina) para anestesiar os. Depois de 5 min, transferir os embriões para a placa de agarose sobreposta com meio de E3 contendo 0,02% (p/v) tricaina e alinhá-los em uma orientação para a injeção. Para o Mpeg1: Kaede transgénica linha primeiro anestesiar embriões em E3 metanosulfonato de 0,02% (p/v) contendo médio. Em seguida, selecione embriões expressando proteínas fluorescentes verdes usando um microscópio de fluorescência estéreo.
  3. Carrega a agulha com aproximadamente 10 µ l da suspensão de ""bactérias-somente ou bactérias-microesferas usando uma ponta de pipeta microloader. Monte a agulha de um micromanipulador conectado para o micro-injector. Para o injetor usado aqui (ver tabela de materiais), utilizar as seguintes configurações para injeções de 2 – 3 nL: pressão: 300-350, pressão de retorno: 0, tempo: 2 ms.
    Nota: As configurações para o micro-injector dependem o injetor usado. Configurações de injector podem precisar de ser ajustados para injeções de bactérias misturadas com biomateriais com outras formas ou tamanhos.
    1. Use agulhas com a mesma abertura para a injeção da suspensão "Somente bactérias" e a suspensão de bactérias-microesferas. Se a agulha está quebrada ou entupida, sempre mude para uma nova agulha para mais injeções.
  4. Insira a agulha no tecido do músculo de embriões sob um microscópio óptico (Figura 1), em um ângulo de 45-60 ° entre a agulha e o corpo de embriões. Ajuste a posição da agulha no tecido, suavemente, movendo-o para a frente e para trás. Injete os embriões usando um pedal conectado ao micro-injector.
  5. Após a injeção de bactérias fluorescentes, marca os embriões para infecção bem sucedida sob um microscópio de fluorescência estéreo. Descarte o embriões marcados negativo (sem bactérias fluorescentes visíveis ou não visíveis microesferas fluorescentes). Manter os embriões individualmente em meio de E3 em placas boas 48. Meio de atualizar diariamente.

5. esmagamento de embriões, marcando microscópico e cultura quantitativa de bactérias

  1. Marca todos os embriões microscopicamente para a presença de bactérias fluorescentes, utilizando um microscópio de fluorescência estéreo, começando imediatamente após as injeções e todos os dias subsequentes até que os embriões são selecionados aleatoriamente para cultura quantitativa.
  2. Aleatoriamente, selecione alguns embriões de infectados ao vivo (5 a 6 no presente estudo) logo após a injeção e transferi-los individualmente para microtubos de 2ml separadas usando dicas estéril. Remover o meio, lave os embriões suavemente com PBS estéril uma vez e adicione 100 µ l de PBS estéril.
  3. Adicionar contas de zircônia estéril de 2 – 3 (2 mm de diâmetro) para cada frasco e esmagar os embriões usando o homogeneizador (ver Tabela de materiais) a 3.500 rpm por 30 s. cultura o homogenate quantitativamente, conforme descrito na etapa 1.3.
    Nota: Outros Homogeneizadores podem exigir configurações diferentes.
  4. Selecione aleatoriamente vários embriões nos dias subsequentes após a injeção para a cultura quantitativa, conforme item 5.3.

6. fluorescência microscopia de progressão da infecção e infiltração celular provocado em embriões de peixe-zebra

  1. Anestesiar os embriões conforme descrito na etapa 4.2. Pipete 500 µ l de solução PBS - 2% (wt) metil celulose para uma placa de Petri contendo meio de E3 com 0,02% (p/v) tricaina. Coloque os embriões na solução metil celulose e mantê-los em linha reta e horizontal.
    Nota: Solução de metil celulose é usada como uma "cola", que, devido a sua viscosidade, imobilizar temporariamente embriões na melhor orientação para a imagem latente.
  2. Uso de um microscópio de fluorescência estéreo equipado com campo claro, mCherry, proteína verde fluorescente (GFP) e UV filtros para embriões individual de imagem sob configurações otimizadas idênticas (por exemplo,, exposição, intensidade e ganho de tempo) na ampliação de 160 x . Defina o plano focal, tal que o dano tecidual causado pela injeção está em foco, usando o filtro de campo brilhante. Defina a profundidade Z-pilha 10 tamanho µm e passo a 5 µm, que permite a gravação de 3 imagens consecutivas.
  3. Embriões de imagem individuais uma vez por dia de pós-injeção de 5h até pós-injeção de 2 dias. Exclua embriões mortos (sem batimento cardíaco ou embrião parcialmente degradado) por mais de imagem e análise. Manter os embriões individualmente em meio de E3 em placas boas 48. Meio de atualizar diariamente.

7. análise quantitativa da intensidade de fluorescência da progressão da infecção e infiltração celular provocado usando o arquivo de projeto do objeto J "Zebrafish-Immunotest"

  1. Download "Zebrafish-Immunotest" e o manual detalhado da ligação: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, conforme descrito em um anterior estudo33. Em breve, abrir imagens para análise com "Zebrafish-Immunotest", operando sob o programa freeware imagem J. Em cada imagem carregada, marca manualmente o local de injeção baseado o dano no tecido observado de embriões.
    Nota: o local marcado é usado pelo "Zebrafish-Immunotest" como o ponto central para detectar o pico de fluorescência, a uma distância de 50 µm. O pico de fluorescência detectada é usado como o centro de uma área padronizada (diâmetro de 100 µm) para medição de fluorescência.
  2. Clique em "cálculo" no menu objeto J para executar a medição fluorescente para múltiplos canais, se for o caso, automaticamente para todas as imagens. Exportar os dados e analisar por métodos de ensaio de estatística adequada.

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Resultados

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O presente estudo avaliou a aplicabilidade do zebrafish embriões de novela modelo animal vertebrado para investigar infecção associada biomaterial. Técnica de microinjeção tem sido comumente usada para injetar diferentes espécies bacterianas em embriões de peixe-zebra para causar infecção22,26,,27,30,36. Usando o procedimento d...

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Discussão

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Infecção associada biomaterial (BAI) é uma complicação clínica grave. Uma melhor compreensão da patogênese de BAI em vivo proporcionaria novas ideias para melhorar a prevenção e tratamento do BAI. No entanto, atual BAI animais modelos experimentais tais como modelos de murino são caro, trabalhoso e exigem pessoal especializado treinado em técnicas cirúrgicas complexas. Portanto, estes modelos não são adequados para análise de alto rendimento. Desde que os requisitos para os modelos de embrião de zebrafish são menos compl...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este estudo foi financeiramente apoiado pelo projecto IBIZA do programa materiais biomédicos (BMM) e co-financiado pelo Ministério dos assuntos económicos. Os autores gostaria de agradecer a Prof. Dr. Graham Lieschke da Universidade de Monash, Austrália para fornecer a linha de zebrafish transgênicos (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ágar soja trípticaBD Difco236950Unidade de preparação de meios na AMC
Caldo de soja trípticoBD Difco211825
Polivinilpirrolidona40AplicaçãoA2259.0250
10 µ microesferas de poliestireno de m de diâmetro (fluorescente azul)Tecnologia de vida/ThemoFisherF8829
Microcapilary de vidro (1 mm O.D. x 0,78 mm I.D.)Harvard Apparatus30-0038
Sutter Instrument IncFlaming p-97
Microscópio de luz LM 20LeicaMDG33 10450123
ácido 3-aminobenzóico (Tricaine)Sigma-AldrichE10521-50G
Agarose MPRoche11388991001
Microscópio fluorescente estéreo LM80LeicaMDG3610450126
MicroloaderEppendorf5242956.003
Micromanipulador M3301 com suporte M10World Precision Instruments00-42-101-0000
Microinjetor FemtoJet expressEppendorf5248ZO100329
Microtrube 2 mL ppSarstedt72.693.005
Contas de zircôniaBio-connect11079124ZX
MagNA lyserRoche41416401
placas MSA-2 (Mannitol Salt Agar-2)Biomerieux43671Chapmon 2 médio
Metilcelulose 4000cpSigma-AldrichMO512-250G
CloranfenicolSigma-AldrichC0378
Agitador giratório (para crescimento bacteriano)IncubadoraG10
VWRIncu-line
CuvettesMARCA759015
CentrífugaEspectrômetro Hettich-ZentrifugenROTANTA 460R
Pharmacia biotechUltrospec® 2000
FórcepsSigma-AldrichF6521-1EA
48 placas de poçosGreiner bio-one677180
96 placas de poçosGreiner bio-one655161 placa de
PetriFalcon353003
PetriBiomerieuxNL-132
ImageJNão aplicávelNão aplicávellink: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0PrismNão aplicável
Instrumento extrator de micropipeta Pontas de pipeta de peixe-zebra da New Brunswick Scientificplaca de

Referências

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