Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Resumo

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

Resumo

HIV permanece incurável devido à existência de um reservatório de células que abriga o formulário estável e latente do vírus, que permanece invisível para o sistema imunológico e destina-se não pela atual terapia anti-retroviral (carrinho). Transcrição e emendando foram mostrados para reforçar a latência do HIV-1 em células T CD4 + a descansar. Reversão de latência pelo uso de agentes de reversão de latência (órgãos) na abordagem de "choque e matar" tem sido estudado extensivamente na tentativa de purgar este reservatório, mas até agora não mostrou qualquer sucesso em ensaios clínicos, devido à falta de desenvolvimento de pequenas adequada moléculas que podem eficientemente a perturbar este reservatório. O protocolo apresentado aqui fornece um método para confiável e eficiente avaliação de agentes de reversão de latência (órgãos) na transcrição de HIV e de emenda. Esta abordagem baseia-se na utilização de um repórter de cor dupla LTR-driven que simultaneamente pode medir o efeito de um LRA na transcrição e emenda por citometria de fluxo. O protocolo descrito aqui é adequado para as células aderentes, bem como as células em suspensão. É útil para testar um grande número de drogas em um sistema de alta taxa de transferência. O método é tecnicamente simples de implementar e cost-effective. Além disso, o uso da citometria de fluxo permite a avaliação da viabilidade celular e, portanto, toxicidade de drogas ao mesmo tempo.

Introdução

Apesar da terapia de antiretroviral eficaz a longo prazo, HIV persiste em estado latente, como um provirus integrado em memória de células T CD4 +¹. A estrutura da cromatina do HIV-1 5' promotor de repetição tempo terminal (LTR) e modificações epigenéticas como metilação de histonas e deacetilação de histona por DNA metiltransferases (DNMT) e histona deacetilases (HDAC) são mecanismos importantes, levando a repressão transcriptional e, assim, a latência de pós-integração^2,3. Uma grande variedade de agentes de inversão de latência (órgãos) foi investigada por sua eficácia induzir a produ....

Protocolo

Nota: Processos de clonagem, transformação e sequenciamento são discutidas em outra parte^18,19. Os protocolos aqui começam o transfeccao dos vetores de expressão de mamíferos (Figura 3).

1. transfecção de células HEK293T com cor dupla repórter construir

1. Cultivar as células HEK293T no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) em uma 5% CO₂ incubadora a 37 ° C. Após o descongelamento, células de HEK293T passage....

Resultados

Resultados representativos são mostrados na Figura 5 para a expressão do HIV-1 unspliced (EGFP) e emendados produtos (DsRed) após o tratamento com inibidor de bromodomain JQ1. Ambos JQ1(+) e Tat aumentaram significativamente a percentagem de células expressando EGFP (2.18 e 4,13 FC sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de transcrições de unspliced. Além disso, o JQ1(+) aumentou significativamente a percentagem de células expressando DsRed (46,6 FC sob.......

Discussão

Dada a dificuldade em medir a reativação do vírus ex vivo, uma vasta gama de em vitro modelos foram desenvolvidos ao longo do tempo, a fim de estudar a latência de HIV incluindo Latentemente infectadas T cell-linhas (J-Lats, ACH2, U1), modelos primários de infecção latente de descansar ( O ' Doherty, Lewin, Greene e Spina modelos) ou pré-activated células T CD4 + (Santos, Marini, Planelles Siliciano, Karn modelos) com a única rodada ou replicação competente repórter vírus²². Para modelar as condiç.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cultura de células
HEK293T células (células renais embrionárias humanas)	ATCC	CRL-3216	Replica vetores que transportam a região de replicação SV40.
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM 1x + GlutaMAX-I)	Gibco	10569-010	+ 4,5 g/L D-Glicose + 110 mg/L Pirovato de Sódio
Soro Fetal Bovino	Gibco	10099-141	Origem Austrália
Penicilina-Estreptomicina	Sigma	P4458
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190-136
Mancha azul de tripano, 0,4%	Gibco	15250
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Gibco	25300054
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-019	Reagente de transfecção lipídica
Opti-MEM I (1x) meio de soro reduzido	Gibco	31985-070	Meio livre de
soro NucleoBond Xtra Maxi	Marcherey-Nagel	740414.50
plasmídeo pEGFP-N1	Clontech (TaKaRa)	6085-1	Expressão de EGFP em células de mamíferos, promotor de CMVIE.
pDsRed-Express-N1	Clontech (TaKaRa)	632429	Expressão de DsRed-Express em células de mamíferos, promotor de CMVIE.
pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed	Addgene	115775
pCMV-RevNL4.3	Addgene	115776
pCMV-Tat101AD8-Flag	Addgene	115777
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Millipore	67-68-5
JQ1(+)	Cayman Chemical	11187	Stock a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 1 μ M
JQ1(-)	Cayman Chemical	11232	Estoque a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 1 μ M
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	16561-29-8	Stock at 100 μ g/mL em DMSO; concentração de trabalho 10 nM
Fitohemaglutinina (PHA)	Remel	HA15/R30852701	Estoque a 1 μ g/μ L em PBS; concentração de trabalho 10 μ g/mL
Vorinostat (VOR)	Cayman Chemical	10009929	Stock a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 0,5 μ M
Panobinostat (PAN)	TRC	P180500	Estoque a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	63581
Venor GeM Classic	Minerva Biolabs	11-1100	Kit de Detecção de Mycoplasma, baseado em PCR
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes de citometria de fluxo
LSR Fortessa	BD Biosciences		Citômetro de fluxo (4 lasers-azul, vermelho, violeta e amarelo)
LSR II	BD Biosciences		Citômetro de fluxo (3 lasers-azul, vermelho e violeta)
VIVO/MORTO Corrigível Near-IR Dead Kit de Coloração Celular	Life Technologies	L34976	Corante de viabilidade: para excitação de 633 ou 635 nm, 400 ensaios. Os componentes A e B são fornecidos no kit.
albumina de soro bovino	Sigma	A2153
EDTA 0,5 M pH8	Gibco	15575-038
37/10 (37%)	Chem-Supply	FA010
BD FACS Diva CS & T Research Beads	BD Biosciences	655050	Grânulos de calibração
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 picos)	BD Biosciences	559123	3,0 - 3,4 mm
Solução de bainha	Chem-Supply	SA046	90 g NaCl em 10 L de água
HAZ-Tabs	Guest Medical	H8801	Comprimidos de liberação de cloro para desinfecção
Decon 90	Decon Laboratories Limited	N/A	Agentes de limpeza concentrados do citômetro de fluxo. Solução de trabalho Decon 90 5%.
Hipoclorito de sódio (solução a 12-13%)	Labco	SODHYPO-5L	Agentes de limpeza concentrados de citômetro de fluxo. Alvejante de solução de trabalho 1%.
7x	MPBio	IM76670	Agentes de limpeza concentrados de citômetro de fluxo. Solução de trabalho 7x 1%.
Nome<	strong>Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais
tecidos (75 cm2, pescoço inclinado, tampa ventilada)	Placas de	430641U
(fundo plano de 96 poços com tampa)	Placas de	3599
(fundo em V de 96 poços sem tampa)	Costar	3896
(10 mL)	SARSTEDT	62.9924.284	100x16 mm
Tubos de centrífuga (50 mL)	CellStar	227261	30x115 mm
Tubos de microcentrífuga (1,5 mL)	Corning Axygen	MCT-150-C
Sorológico Pipeta (25 mL), pipeta sorológica estéril	Corning	CLS4489-200EA
(10 mL),	Corning	CLS4488-200EA
(5 mL),	Corning	CLS4487-200EA
(50 mL),	Corning	CLS4470-200EA
5 mL, com tampa do filtro de célula	Corning	352235	Estilo 12 x 75 mm,
Malha de Nylon	SEFAR	03-100/32	100 mm
Tubos de micro tubos de ensaio, a granel	BIO-RAD	2239391	tubos microfacs Tubo de
ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL, sem tampa	Corning	352008	12x75 mm
para tubos de ensaio de 12x75 mm	Corning	352032
Câmara de contagem, Neubauer melhorou a régua de rede dupla, linha brilhante (Hemocitômetro, LO-Laboroptik)	ProSciTech	SVZ4NIOU	3x3 quadrados grandes de 1 mm2; Profundidade 0,100 mm; volume 0,1 mL; área mínima 0,0025 mm2
Lamínulas (Menzel-Glä ser)	Grale Scientific	HCS2026	Microscópio 20 x 26 mm
	Centrífuga Nikon TMS	310528
5810R refrigerada	Eppendorf	5811000487	com rotor A-4-81 incluindo adaptadores para tubos cônicos de 15/50 mL Leitor
microplacas FLUOstar Omega	BMG Labtech	N/A	Leitor de placas para ensaio de proliferação celular. Filtro 490 nm.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Softwares
FACS Diva	BD Biosciences		Programa de aquisição e análise de dados de citômetros de fluxo, versão 8.0.1
FlowJo	FlowJo	FlowJo 10.4.2	Programa de análise de dados de citômetro de fluxo, FlowJo Engine v3.05481
Omega	BMG Labtech		FLUOstar multiusuário de controle de leitura, versão 5.11
Omega - Análise de dados	BMG Labtech	MARS	FLUOstar data analysis, versão 3.20R2
Microsoft Excel	Microsoft	Excel:mac 2011	version 14.0.0
Prism	GraphPad	Prism 7	version 7.0c

Solução de formaldeído de Frascos de cultura de cultura de tecidos Corning cultura de tecidos Costar Tubos de centrífuga pipeta sorológica estéril reservatórios de reagentes estéreis tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo estéril de de 70 mm Tubo de Titulação de Tampas de pressão estilo de