Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.
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Artigo de método
Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda
Neste artigo
Resumo
Resumo
HIV permanece incurável devido à existência de um reservatório de células que abriga o formulário estável e latente do vírus, que permanece invisível para o sistema imunológico e destina-se não pela atual terapia anti-retroviral (carrinho). Transcrição e emendando foram mostrados para reforçar a latência do HIV-1 em células T CD4 + a descansar. Reversão de latência pelo uso de agentes de reversão de latência (órgãos) na abordagem de "choque e matar" tem sido estudado extensivamente na tentativa de purgar este reservatório, mas até agora não mostrou qualquer sucesso em ensaios clínicos, devido à falta de desenvolvimento de pequenas adequada moléculas que podem eficientemente a perturbar este reservatório. O protocolo apresentado aqui fornece um método para confiável e eficiente avaliação de agentes de reversão de latência (órgãos) na transcrição de HIV e de emenda. Esta abordagem baseia-se na utilização de um repórter de cor dupla LTR-driven que simultaneamente pode medir o efeito de um LRA na transcrição e emenda por citometria de fluxo. O protocolo descrito aqui é adequado para as células aderentes, bem como as células em suspensão. É útil para testar um grande número de drogas em um sistema de alta taxa de transferência. O método é tecnicamente simples de implementar e cost-effective. Além disso, o uso da citometria de fluxo permite a avaliação da viabilidade celular e, portanto, toxicidade de drogas ao mesmo tempo.
Introdução
Apesar da terapia de antiretroviral eficaz a longo prazo, HIV persiste em estado latente, como um provirus integrado em memória de células T CD4 +1. A estrutura da cromatina do HIV-1 5' promotor de repetição tempo terminal (LTR) e modificações epigenéticas como metilação de histonas e deacetilação de histona por DNA metiltransferases (DNMT) e histona deacetilases (HDAC) são mecanismos importantes, levando a repressão transcriptional e, assim, a latência de pós-integração2,3. Uma grande variedade de agentes de inversão de latência (órgãos) foi investigada por sua eficácia induzir a produção de vírus in vitro e in vivo de Latentemente infectadas descanso T CD4 + células4,5,6,7 ,8. Entre os órgãos testados, HDACi (inibidores HDAC) e aposta contem inibidores (BETis) induzem ocorre descondensação da cromatina e lançamento da transcrição positivo alongamento fator b (P-TEFb), respectivamente, levando a subsequente aliviar do transcriptional repressão em 5' LTR e ativação de HIV expressão9,10,11,12,13. No entanto, a magnitude da reativação alcançada por esses órgãos foi limitada apenas um aumento modesto na célula associada unspliced HIV mRNA (RNA nos), indicativo de transcrição viral, observou-se ex vivo14,15. Importante, estes órgãos também conseguiram induzir uma redução da frequência de células Latentemente infectadas.
Expressão de HIV pode ser ainda mais restrito por ineficiente emenda16 , bem como defeitos de exportação nuclear de multiplicar emendados HIV RNA (RNA MS)17. Assim, identificando novas classes de órgãos que são mais potentes e podem afetar aspectos distintos da vírus produção pós integração são necessários. Além disso, o desenvolvimento de novos ensaios que ajudam a definir os compostos ideais para eficientemente reverter a latência é necessário.
Aqui, é apresentado um protocolo, que utiliza uma abordagem de alto rendimento para avaliação funcional do impacto das intervenções na transcrição orientada por HIV LTR e emenda. Em breve, um novo dual LTR-driven cor repórter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) é usado para avaliar a reativação de HIV por citometria de fluxo. Este repórter fluorescente, a expressão do mRNA de HIV unspliced (4kb) leva à expressão da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), enquanto a expressão do mRNA emendados (2KB) levaria a expressão de proteínas fluorescentes de Discosoma SP. vermelho (DsRed). Brevemente, usamos uma proteína fluorescente de fusão Env-EGFP, gp140unc. EGFP, onde a sequência de codificação da EGFP foi colocada no quadro com um formulário truncado e un-entalhado do envelope (Env). As alterações foram introduzidas para ablate o local de clivagem, impedindo a dissociação do Env em gp120 e gp41-EGFP e truncar a proteína gp160 antes do domínio transmembrana criando um análogo solúvel de Env, que facilita o correto dobramento e expressão de EGFP. Sobre a expressão dentro de uma célula, Rev localiza-se no núcleo, onde ele Medeia a exportação nuclear citoplasmática de 4KB env mRNA através da interação com o elemento responsivo rev (RRE). Truncamento de Env não compromete a RRE, que se situa entre gp120 e gp41, A7 3' site da tala. Neste sistema, emendando a HIV-1 splice doador 4 (SD4) e splice aceitador 7 (AE7) resultados na produção de um 2KB mRNA codificação de uma proteína não-funcional de Rev truncada no aminoácido 38 fundido a DsRed proteína fluorescente, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed foi inserido o exon 2nd de Rev no aminoácido 38 por sobreposição extensão18. Para facilitar a exportação nuclear de unspliced mRNA, um vetor de expressão mamíferos codificação Rev (pCMV-RevNL4.3) foi co transfected com construção de repórter fluorescente (Figura 2). Essa construção único repórter descrita aqui é útil na avaliação da elevado-produção de HIV transcrição e emenda, sem a necessidade de usar vetores virais.
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Protocolo
Nota: Processos de clonagem, transformação e sequenciamento são discutidas em outra parte18,19. Os protocolos aqui começam o transfeccao dos vetores de expressão de mamíferos (Figura 3).
1. transfecção de células HEK293T com cor dupla repórter construir
- Cultivar as células HEK293T no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Após o descongelamento, células de HEK293T passagem 2 - 3 vezes antes de usá-los em transfeccao de experiências. Isto dar-lhe-ia o tempo de células para se recuperar do processo de descongelamento.
Atenção: Contaminação de micoplasma de culturas celulares continua a ser um problema sério. Boas práticas de laboratório e testes de rotina de culturas celulares são essenciais para diminuir o risco de contaminação de micoplasma e evitar a difusão de20. - Dividir as células 1:2 um dia antes da semeadura e transferi-los para meio DMEM fresco. Cultivar as células para 24h numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C.
- O dia antes de transfeccao, remover o meio do balão por aspiração e lavar as células com tampão fosfato salino (DPBS) solução de Dulbecco livre de cálcio (Ca2 +) e magnésio (Mg2 +) para remover traços de soro.
- Dispense a 5 mL da solução do trypsin-EDTA (0.05% - 10mm em PBS) para o recipiente de cultura e colocá-lo a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para 2 a 5 min.
- Quando as células são desanexadas, adicione 5 mL de DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS para inibir ainda mais a atividade de tripsina, que pode danificar as células.
- Resuspenda suavemente pipetando a suspensão de células acima e para baixo para separar as touceiras.
- Dilua as células 01:10 em mancha azul de trypan (0,4%).
- Conte as células vivas que não ocupam trypan azuis usando um microscópio (objetivo de x 10) e um haemocytometer.
- Calcular o número de células viáveis por mililitro, tomando a média da contagem de células e multiplicando-o por 10.000 e pelo factor de diluição (01:10) de azul de trypan mancha.
- Placa de 2 x 104 células em 100 μL de meio DMEM suplementado com 10% de FBS sem antibióticos em uma placa de 96 poços de fundo plano para 24h.
- Para cada poço, diluir 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng de pCMV-RevNL4.3 e 100 ng de pCMV-Tat101AD8-bandeira DNA em 50 µ l de meio livre de soro. Misture suavemente. Para experiências sem Tat, use uma correspondência vazia Tat pcDNA3.1 vector (-).
Nota: O uso de DNA livre de endotoxina é altamente recomendado. Por isso, preparem-se livre de endotoxinas DNA usando um kit de purificação de ácidos nucleicos de midi ou maxiprep. Determine a pureza do DNA medindo-se a proporção de OD 260/280, que deve ser entre 1,7 e 1,9. - Misturar o reagente de lipídios suavemente antes do uso e, em seguida, diluir 0.65 μL em 50 µ l de meio livre de soro. Misture delicadamente e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Combine o DNA diluído com o reagente diluído de lipídios.
- Misture delicadamente e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. A solução pode parecer nublada.
Nota: Prossiga para a etapa de 1,15. dentro de 30 min. - Distribuir 100 μL por poço dos complexos reagente-DNA drop-wise em cima das células lipídicas.
- Misture delicadamente agite-a placa e para trás.
-
Incubar a placa por 5h em uma incubadora umidificada 5% CO2 a 37 ° C.
- Cada mix de reação é suficiente para um único poço (96 poços) do transfection. Ajuste a quantidade e volume dos componentes de acordo com o número de drogas e combinação que seria testada e contas para variações de pipetagem. Todas as condições são geralmente testadas em triplica.
- Transfect poços adicionais com 100 ng do CMV-driven EGFP e DsRed-Express DNA do plasmídeo para fins de compensação.
2. tratamento de HEK293T transfectadas células com latência invertendo agentes
Nota: Antes de cada ensaio, determine o estado fisiológico de cada LRA medindo-se a viabilidade das células após a exposição a alta e baixa dose da droga com ensaio de proliferação de células.
- Diluir cada LRA para a concentração de trabalho adequado com meio de cultura (por exemplo,, 1 μM para JQ1(+)).
Atenção: Reconstitua as liofilizado drogas com o solvente apropriado para uma concentração de 10 mM. Armazenar todas as ações de órgãos a-80 ° C em uma alíquota de uso único (5 μL cada) a fim de evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. - Cuidadosamente Aspire transfeccao com um multicanal e coloque 100 μL contendo LRA apropriado (tabela 1). Adicione meio muito suavemente ao lado da parede do poço para evitar desanexando HEK293T células transfectadas, que são conhecidas para soltar facilmente da superfície da placa de cultura.
- Incubar a placa por 48h em uma incubadora umidificada 5% CO2 a 37 ° C.
3. coloração de células transfectadas com viabilidade fixável tintura para análise de citometria de fluxo
Atenção: Remoção de detritos e células mortas é essencial para eliminar falsos positivos e para obter resultados de alta qualidade.
- Separe as células na mídia usando 100 μL de tampão fosfato salino (PBS) por alvéolo e pipetando suavemente inconstante (~ 5 vezes) com um multicanal, evitando a formação de espuma dos meios de comunicação. Se necessário, retire as células da placa usando 35 µ l por poço da solução do trypsin-EDTA (0.05% - 10mm em PBS) e incubar 5 min a 37 ° C, antes de neutralizar com meio contendo soro.
- Transferi as células para uma placa de V-fundo de 96 poços.
- Girar as células durante 5 min à 500 x g a 4 ° C e, em seguida, Aspire cuidadosamente com a médio/PBS sem tocar as células.
- Lave as células pelo menos 1 vez com 200 µ l de PBS livre de proteína/soro.
- Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C, em seguida, descartar o sobrenadante inclinando a placa e removendo o tampão de lavagem sem tocar as células.
- Prepare uma solução de trabalho de viabilidade fixável corante diluindo o corante de viabilidade 1: 1000 em PBS livre de proteína/soro. Prepare-se 50 µ l da mancha diluída por bem.
Nota: Viabilidade de corantes estão disponíveis em uma gama de cores adequadas para uso com laser azul, vermelho e violeta. Prepare uma solução stock de viabilidade fixável tintura resuspending um frasco de corante (componente A) liofilizado com 50 μL de DMSO anidro (componente B). Loja a-20 ° C em uma única utilização de alíquota (1 μL cada), protegido da luz. - Adicionar 50 μL da tintura viabilidade diluídos a cada poço e misturar as células pipetando para cima e para baixo com um multicanal.
- Mancha para 10-15 min a 4 ° C, protegido da luz.
- Lavar 1 - 2 vezes com 150 µ l de tampão de lavagem (PBS com 1% bovina albumina de soro e 2 mM EDTA).
- Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Fixe as células com 100 μL de formaldeído recentemente preparada de 1% em tampão de lavagem para 10-15 min a 4 ° C, no escuro.
Atenção: O formaldeído é muito tóxico. Prepare a solução de formaldeído 1% em uma coifa para evitar a inalação usando luvas e óculos de segurança para proteção. - Lave as células 1 - 2 vezes com 100 μL de tampão de lavagem.
- Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 70 μL de tampão de lavagem.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Fixa as células poderiam ser armazenadas a 4 ° C, no escuro para análise no dia seguinte sobre o citômetro de fluxo.
4. EGFP e DsRed medições por citometria de fluxo e análise de dados
Nota: Analise a transcrição de HIV (% EGFP) e emenda (% DsRed) em um citômetro de fluxo. Filtre a amostra antes da corrida com um célula de 70 μm-filtro ou malha de nylon 100 μm para evitar entupir o bico.
- Iniciar o computador e o citômetro de pelo menos 10 min antes de usar para garantir lasers de aquecer.
- Antes da execução de amostras e a iniciar a aquisição de dados, encha o reservatório de bainha com solução salina 0,9% e certifique-se de que um tablet de hipoclorito de sódio é adicionado para o depósito de dejectos.
- Verifique a pilha de fluxo para as bolhas de ar.
- Verifique se que os detectores e filtros são apropriados para o experimento.
Nota: Para EGFP, uso de laser azul (488 nm) e 530/30 bandpass, enquanto DsRed Express é otimamente detectado usando o laser amarelo (561 nm) e bandpass 610/20. Um laser azul (488 nm) e bandpass 610/20 também pode ser usados para detectar a expressão DsRed. - Verificar o desempenho do citômetro e sensibilidade através de detectores de executando grânulos de calibração.
- Ajustar o avanço (FSC-A) e tensões de dispersão (SSC-A) de lado com inocente amostra para que a população principal é na tela e claramente discerníveis.
Nota: FSC (luz difusa) é uma medida da luz difração em um ângulo de plana, o que depende do volume da célula (tamanho ou área de superfície de célula), enquanto o SSC (lado difusa luz) é uma medida da difração de luz em um ângulo reto, que é proporcional à granularidade de célula e complexidade interna. - Realizar compensação manual ou automática usando as amostras single-manchado, garantindo mínimas repercussões da EGFP + população para o detector de DsRed e vice-versa.
Atenção: Para fins de compensação, use uma amostra de células expressando cada um a proteína fluorescente de cor única, bem como as células individualmente coradas com o corante de viabilidade fixável. Não use contas de compensação FITC e PE para compensações de proteínas fluorescentes EGFP e DsRed devido a diferentes características espectrais. Controles de compensação devem ser brilhantes o suficiente para resolver a população positiva e negativa. - Criar parcelas e definir as portas usando fluorescência menos um controles (FMO).
- Adquirir e registar um mínimo de 10.000 eventos de célula viável, por exemplo. Execute amostras em média ou baixa velocidade para evitar parelhas de passagem a interceptação do laser. Usar o pulso geometria gating tais como SSC-A contra SSC-H para eliminar parelhas. Verificar a estabilidade do run traçando tempo contra SSC-A para ver como até mesmo o fluxo é durante a execução.
- No final da corrida, limpar o fluidics de citometria de fluxo com agentes de limpeza concentradas, em seguida, água por 5 min cada.
- Desligamento do sistema, descarte de resíduos e re-encher o tanque de bainha, após a aquisição.
- Analise os dados usando um software de análise de dados de citometria de fluxo. Excluir os restos celulares e moita (parelhas), baseado na dispersão de frente e lateral e, em seguida, eliminar as células mortas, usando a mancha de tintura de viabilidade (negativo população = células vivas). Identificar as células expressando EGFP e DsRed (Figura 4), bem como a percentagem do produto emendado DsRed /(DsRed + EGFP) (Figura 5).
- Determine o efeito do LRA na transcrição de HIV e emendando comparando células não tratadas e as células expostas ao indivíduo ou uma combinação de órgãos (Figura 5).
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Resultados
Resultados representativos são mostrados na Figura 5 para a expressão do HIV-1 unspliced (EGFP) e emendados produtos (DsRed) após o tratamento com inibidor de bromodomain JQ1. Ambos JQ1(+) e Tat aumentaram significativamente a percentagem de células expressando EGFP (2.18 e 4,13 FC sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de transcrições de unspliced. Além disso, o JQ1(+) aumentou significativamente a percentagem de células expressando DsRed (46,6 FC sob...
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Discussão
Dada a dificuldade em medir a reativação do vírus ex vivo, uma vasta gama de em vitro modelos foram desenvolvidos ao longo do tempo, a fim de estudar a latência de HIV incluindo Latentemente infectadas T cell-linhas (J-Lats, ACH2, U1), modelos primários de infecção latente de descansar ( O ' Doherty, Lewin, Greene e Spina modelos) ou pré-activated células T CD4 + (Santos, Marini, Planelles Siliciano, Karn modelos) com a única rodada ou replicação competente repórter vírus22. Para modelar as condiç...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão do projeto APP1129320 e programa grant APP1052979 do NHMRC da Austrália. Agradecemos o Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson e Michelle Y. Lee para fornecer construções essenciais e conselhos para a conclusão deste trabalho. Agradecemos também a equipe DMI fluxo instalações para seus conselhos e ajuda na manutenção do citômetro de fluxo utilizado neste estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cultura de células | |||
| HEK293T células (células renais embrionárias humanas) | ATCC | CRL-3216 | Replica vetores que transportam a região de replicação SV40. |
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4,5 g/L D-Glicose + 110 mg/L Pirovato de Sódio |
| Soro Fetal Bovino | Gibco | 10099-141 | Origem Austrália |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma | P4458 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), sem cálcio, sem magnésio | Gibco | 14190-136 | |
| Mancha azul de tripano, 0,4% | Gibco | 15250 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Reagente de transfecção lipídica |
| Opti-MEM I (1x) meio de soro reduzido | Gibco | 31985-070 | Meio livre de |
| soro NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| plasmídeo pEGFP-N1 | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expressão de EGFP em células de mamíferos, promotor de CMVIE. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expressão de DsRed-Express em células de mamíferos, promotor de CMVIE. |
| pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 1 μ M |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Estoque a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 1 μ M |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μ g/mL em DMSO; concentração de trabalho 10 nM |
| Fitohemaglutinina (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Estoque a 1 μ g/μ L em PBS; concentração de trabalho 10 μ g/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 0,5 μ M |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Estoque a 10 mM em DMSO; concentração de trabalho 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Kit de Detecção de Mycoplasma, baseado em PCR |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Reagentes de citometria de fluxo | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Citômetro de fluxo (4 lasers-azul, vermelho, violeta e amarelo) | |
| LSR II | BD Biosciences | Citômetro de fluxo (3 lasers-azul, vermelho e violeta) | |
| VIVO/MORTO Corrigível Near-IR Dead Kit de Coloração Celular | Life Technologies | L34976 | Corante de viabilidade: para excitação de 633 ou 635 nm, 400 ensaios. Os componentes A e B são fornecidos no kit. |
| albumina de soro bovino | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0,5 M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS & T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Grânulos de calibração |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 picos) | BD Biosciences | 559123 | 3,0 - 3,4 mm |
| Solução de bainha | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl em 10 L de água |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Comprimidos de liberação de cloro para desinfecção |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Agentes de limpeza concentrados do citômetro de fluxo. Solução de trabalho Decon 90 5%. |
| Hipoclorito de sódio (solução a 12-13%) | Labco | SODHYPO-5L | Agentes de limpeza concentrados de citômetro de fluxo. Alvejante de solução de trabalho 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Agentes de limpeza concentrados de citômetro de fluxo. Solução de trabalho 7x 1%. |
| Nome< | strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Materiais | |||
| tecidos (75 cm2, pescoço inclinado, tampa ventilada) | Placas de | 430641U | |
| (fundo plano de 96 poços com tampa) | Placas de | 3599 | |
| (fundo em V de 96 poços sem tampa) | Costar | 3896 | |
| (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100x16 mm |
| Tubos de centrífuga (50 mL) | CellStar | 227261 | 30x115 mm |
| Tubos de microcentrífuga (1,5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Sorológico Pipeta (25 mL), pipeta sorológica estéril | Corning | CLS4489-200EA | |
| (10 mL), | Corning | CLS4488-200EA | |
| (5 mL), | Corning | CLS4487-200EA | |
| (50 mL), | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL, com tampa do filtro de célula | Corning | 352235 | Estilo 12 x 75 mm, |
| Malha de Nylon | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Tubos de micro tubos de ensaio, a granel | BIO-RAD | 2239391 | tubos microfacs Tubo de |
| ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL, sem tampa | Corning | 352008 | 12x75 mm |
| para tubos de ensaio de 12x75 mm | Corning | 352032 | |
| Câmara de contagem, Neubauer melhorou a régua de rede dupla, linha brilhante (Hemocitômetro, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3x3 quadrados grandes de 1 mm2; Profundidade 0,100 mm; volume 0,1 mL; área mínima 0,0025 mm2 |
| Lamínulas (Menzel-Glä ser) | Grale Scientific | HCS2026 | Microscópio 20 x 26 mm |
| Centrífuga Nikon TMS | 310528 | ||
| 5810R refrigerada | Eppendorf | 5811000487 | com rotor A-4-81 incluindo adaptadores para tubos cônicos de 15/50 mL Leitor |
| microplacas FLUOstar Omega | BMG Labtech | N/A | Leitor de placas para ensaio de proliferação celular. Filtro 490 nm. |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Programa de aquisição e análise de dados de citômetros de fluxo, versão 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Programa de análise de dados de citômetro de fluxo, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multiusuário de controle de leitura, versão 5.11 | |
| Omega - Análise de dados | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, versão 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
Referências
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67(2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
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