Preparação de grânulos de Gushukang (GSK) para experimentos in vivo e in vitro

A medicina tradicional chinesa (TCM) é uma das importantes abordagens complementares e alternativas para o tratamento da osteoporose^1,2. A decocção de água é a forma básica e mais comumente usada da fórmula³. No entanto, desvantagens também existem: mau gosto, inconveniente para o transporte, vida útil curta e protocolos inconsistentes, limitando os usos, bem como os efeitos curativos. Para evitar as desvantagens acima, bem como para perseguir melhores efeitos, os grânulos foram desenvolvidos e têm sido amplamente utilizados⁴. Embora muitos estudos tenham explorado os mecanismos farmacológicos de um ou mais componentes efetivos dos grânulos^5,6,7, os mecanismos exatos e os processos farmacológicos subjacentes ainda são difícil de identificar. Isto é porque muitos componentes eficazes de um grânulo podem simultaneamente exercer efeitos semelhantes ou opostos⁴. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo padrão para preparar os grânulos antes de entregar para o corpo não só teria um grande impacto sobre os resultados terapêuticos, mas também é necessária para ambos in vivo e in vitro ensaios.

Além disso, os efeitos curativos dos grânulos na clínica são difíceis de confirmar e identificam exatamente o uso de estudos in vitro ou ex vivo, o que cria um desafio porque os mecanismos farmacológicos são muito complexos. Para resolver isso, a preparação do soro contendo drogas foi proposta pela primeira vez por Tashino na década de 1980⁸. A partir de então, numerosos pesquisadores aplicaram soro contendo medicamentos à fitoterapia,incluindo grânulos^9,10,11. Atualmente, a escolha do soro contendo medicamentos para investigações in vitro é considerada como uma estratégia que imita de perto as condições fisiológicas.

Os grânulos de gushukang (GSK) foram desenvolvidos para tratar a osteoporose pós-menopausa (POP) com base na prática clínica à luz da teoria da TCM. Os grânulos de GSK impedem a perda óssea em camundongos ovariectomizados (OVX) in vivo, inibem a reabsorção óssea osteoclástica e estimulam a formação óssea osteoblástica⁴. Conseqüentemente, Li et al.¹² descobriram que os grânulos GSK apresentam efeitos protetores ósseos em camundongos OVX, reforçando as atividades do receptor de cálcio para estimular a formação óssea. Para confirmar os efeitos protetores ósseos, bem como os efeitos farmacológicos de grânulos GSK, os autores aqui fornecem um procedimento detalhado para a preparação de soluções de trabalho e medicamentos (grânulo GSK)-contendo soro. Além disso, este artigo descreve a aplicação de grânulos de GSK em um modelo osteoporóticas OVX-induzido do rato e no soro Granule-contendo de GSK para in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis.

Os grânulos de GSK são compor de diversas ervas^13,14 e podem completamente ser dissolvidos no soro fisiológico facilmente. Conseqüentemente, o soro fisiológico serve como o veículo. Camundongos Sham-operados (Sham) e camundongos OVX foram administrados o mesmo volume de soro fisiológico que os camundongos administrados por grânulos. As doses equivalentes de grânulos de GSK para o camundongo foram calculadas com base na equação de meeh-Rubner¹⁵. Esta equação não só tem a vantagem de obter dosagens seguras, mas também garante efeitos farmacológicos¹⁵. As três dosagens de grânulos de GSK foram geradas como a seguir: (1) GSKL: OVX + baixo-dose GSK grânulos, 2 g/kg/day. (2) GSKM: OVX + médio-dose GSK grânulos, 4 g/kg/dia. (3) GSKH: OVX + alta-dose GSK grânulos, 8 g/kg/dia. Camundongos nos grupos GSKL, GSKM e GSKH foram administrados em grânulos de GSK intragastricamente. O carbonato de cálcio (600 mg/comprimido) com vitamina D3 (125 unidade/comprimido internacional), por exemplo, em um produto maduro e comercializado (por exemplo, Caltrate [CAL]) para o tratamento e prevenção da osteoporose, foi usado como um controle positivo.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Xangai do TCM (SZY201604005).

1. preparação e administração da solução de trabalho da GSK

1. Calcule as doses equivalentes de grânulos GSK para o mouse.
   1. Calcule a superfície do corpo com base na equação de meeh-Rubner¹⁵: superfície corporal = k x (peso corporal^2/3)/1000, onde os valores de k são 10,6 para humanos e 9,1 para o mouse. Assumindo um peso corporal humano de 70 kg, então a superfície do corpo humano (m²) = 10,6 x (70^2/3)/1000 = 1,8 m². Assumindo um peso corporal de rato de 20 g (0, 2 kg; por exemplo, 1 mês de idade, fêmea, C57/BL6), em seguida, a superfície do corpo do mouse (m²) = 9,1 x (0, 2^2/3)/1000 = 0, 67 m².
   2. Com base na superfície do corpo calculado, calcule a relação de transformação do corpo para humanos e mouse. Humano: 70 kg/1,8 m² = 39. Rato: 0, 2 kg/0.0067 m² = 3. Grânulo GSK = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
   3. Com base em um peso corporal de 20 g por rato, calcule a dosagem equivalente para o rato: 4 g/kg x 0, 2 kg = 0, 8 g.
   4. Calcule três doses equivalentes de grânulos de GSK com base em 20 camundongos por grupo e uma intervenção com duração de 3 meses (90 dias): (1) GSKL (OVX + baixo-dose GSK grânulos [2 g/kg/dia]): 0, 4 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 72 g. (2) GSKM (OVX + médio-dose GSK grânulos [4 g/kg/ dia]): 0, 8 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 144 g. (3) GSKH (OVX + alta-dose GSK grânulos [8 g/kg/dia]): 0,12 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 216 g.
      Nota: Prepare um adicional de 20% de grânulos GSK na prática para compensar a perda.
2. Calcule o volume de grânulo GSK por rato com base no peso corporal¹⁵: por exemplo, volume (V) = 0,24 ml/mouse/dia.
   Nota: o volume para a administração intragástrico para o rato é 0,12 ml/10 g.
3. Pesar 10-dias ' valor de três doses de GSK grânulos. Pesar 8 g, 16 g, e 24 g de grânulos de GSK e servir como GSKL, GSKM, e GSKH, respectivamente.
4. Calcule a dose equivalente de carbonato de cálcio com vitamina D3 (CAL) para o rato com base na equação de meeh-Rubner¹⁵ como nos passos 1.1.1 e 1.1.2: dosagem de Cal = 2 comprimidos/70 kg x 39/3 = 0,372 comprimido/kg ≈ 0,4 comprimido/kg.
5. Com base em um peso corporal de 20 g por mouse (por exemplo, 1 mês de idade, feminino, C57/BL6), calcule a dosagem equivalente de CAL para mouse: 0,4 comprimido/kg x 0, 2 kg = 0, 8 comprimido. Em seguida, calcule a dose equivalente de CAL com base em 20 camundongos por grupo e uma intervenção com duração de 3 meses (90 dias): 0, 8 comprimido x 20 x 90 = 14,4 comprimidos. Pesar 10 dias de CAL (1,6 comprimidos).
6. Dissolução
   1. Colocar 8 g de grânulos GSK num tubo de 50 mL. Adicionar 48 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente.
      Nota: o padrão para a dissolução completa é a ausência de sedimentos. A dissolução completa pode mais ser confirmada se uma agulha do gavagem puder elaborar a solução de trabalho e expeli-la então lisamente.
   2. Repita o passo 1.5.1 com 16 g e 24 g de grânulos GSK.
   3. Coloque 1,6 comprimidos (10 dias de valor) de CAL em um tubo de 50 mL. Adicionar 48 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente.
      Nota: as soluções de trabalho podem ser armazenadas a-4 ° c e preparadas a cada 10 dias.
7. Administração intragastric
   1. Segure a parte de trás do mouse (1 mês de idade, fêmea, C57/BL6) com o mouse voltado para a frente e certifique-se de que ele permaneça firme nessa posição. Mantenha o rato calmo durante 2 − 3 minutos antes da administração.
      Nota: Certifique-se de que o pesquisador pode ver claramente a frente do mouse. Use luvas para evitar picadas de rato, especialmente para novos pesquisadores.
   2. Coloque a agulha de gavagem (tamanho: #12, 40 mm) na solução de trabalho de grânulos GSK e desenhe 0,24 mL da solução de trabalho.
   3. Põr a agulha do gavagem no rato através de um lado de sua boca até que a agulha do gavagem alcangue o estômago.
      Nota: para confirmar a agulha de gavagem atingiu o estômago: (1) a agulha de gavagem encontra a sensação de resistência. Enquanto isso, o mouse mostra a ação de engolir antes da agulha gavagem passa o estreitamento físico do esôfago. (2) injete aproximadamente 0,5 mL da solução de trabalho no rato e aguarde 1 min. Se não houver nenhuma solução saindo do mouse, isso significa que a agulha de gavagem atingiu o estômago.
   4. Injete a solução de trabalho do grânulo de GSK (0,24 mL/mouse) no estômago e extraia então a agulha do gavagem. Devolva o mouse para a gaiola.
   5. Repita o passo 1.6.4 com a solução CAL e injete 0,24 mL de solução de CAL por rato.
      Nota: o volume de solução CAL é calculado como no passo 1,2.

2. Micro-CT digitalização

1. T Ibia colheita e preparação
   1. Intraperitoneally anestesiam o rato com 300 mL/100 g de 80 mg/kg de cetamina no dia seguinte à intervenção do dia 90. Use uma pitada de agulha dos dedos do pé para confirmar se o mouse está completamente anestesiado. Nenhuma resposta indica a anestesia bem sucedida. Em seguida, matar o mouse com luxação cervical.
   2. Fixe o rato com os braços e as pernas na espuma com tachas.
   3. Cortar a pele com tesouras (tamanho: 8,5 cm) e pinças (tamanho: 10 cm) das pernas da extremidade proximal para a distal e depois colher Tibias.
   4. Imediatamente colocar o tíbias em 70% álcool etílico e lavar por 3 vezes.
2. Enrole a tíbia esquerda do mouse com espuma de esponja e colocá-lo em um tubo de amostra (35 mm de diâmetro, 140 mm de comprimento).
   Nota: o eixo longo da amostra deve ser junto com o do tubo de amostragem. Assegure a extremidade proximal dos pontos da tíbia para cima.
3. Executando o micro-CT 80 Scan Machine
   1. Inicie a máquina de digitalização Micro-CT 80 à temperatura ambiente.
   2. Ajuste o tubo de amostra no micro-CT 80 e comece a varredura da seção transversal com os seguintes parâmetros da exploração: tamanho do pixel 15,6 μm, tensão 55 kV do tubo, corrente 72 μA do tubo, tempo da integração 200 MS, μm da definição espacial 15,6, μm da definição do pixel, e matriz da imagem 2048 x 2048.
      Nota: o osso esponjoso distingue-se do osso cortical através da pré-digitalização. A área de varredura da tíbia é definida como a área óssea esponjoso de 5 mm abaixo do planalto tibial até a extremidade distal.
4. Quantificação do parâmetro ósseo
   1. Depois de concluir a digitalização de seção transversal, obtenha as imagens das tíbias esquerdas.
   2. Ajuste o limiar de densidade a 245 − 1000. Use o programa de avaliação micro-TC V 6.6 para medir os seguintes parâmetros ósseos: densidades minerais ósseas (DMO), volume ósseo sobre volume total (BV/TV), número ósseo trabecular (TB. N), espessura óssea trabecular (Tb.Th), bem como separação óssea trabecular óssea ( TB. SP).

3. preparação do soro sanguíneo para experimentos in vitro

1. Cálculo
   1. Baseado em um peso de corpo do rato de 0,2 quilogramas (1 mês velho, fêmea, Sprague-Dawley), calcule a dosagem do grânulo de GSK: dosagem humana/dia x peso corporal do peso humano de x K/Body do rato = 20 g/70 quilogramas/dia x 70 quilogramas x K (K = 0, 18)/0,2 quilogramas = 2 g/kg/day
      Nota: K é o coeficiente de transformação farmacológica entre o humano e o rato¹⁵ (k = 0, 18).
   2. Repita a etapa 3.1.1 e calcule as seguintes dosagens.
      1. Calcule a dosagem de GSKL: 10 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/dia.
      2. Calcule a dosagem de GSKM: 20 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/dia.
      3. Calcule a dosagem de GSKL: 40 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/dia.
      4. Calcular dosagem de CAL: 2 comprimidos/70 kg/dia x 70 kg x K/0,2 kg = 0,2 comprimido/kg/dia.
   3. Calcule a dosagem total de grânulo de GSK e CAL.
      1. Calcule a dosagem total para GSKL: 1 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 3,6 g.
      2. Calcule a dosagem total para GSKM: 2 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 7,2 g.
      3. Calcule a dosagem total para GSKH: 4 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 14,4 g.
      4. Calcule a dosagem de CAL = 0,2 comprimido/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 0,72 comprimido.
         Nota: um total de 10 mL de soro contendo Granule GSK é necessário para preparar 100 mL de meio de cultura (20% GSK Granule contendo soro). Espera-se que cada rato (6 ratos/grupo) forneça 1,5 − 2 mL de soro contendo Granule GSK após a centrifugação.
   4. Calcule o volume de grânulos GSK aplicados por rato com base no peso corporal¹⁵: por exemplo, volume (V) = 2 ml/Rat/dia.
      Nota: o volume para administração intragástrica para rato é 0,1 mL/10 g.
2. Pesar 3-days ' valor de três doses de GSK grânulos. Pesar 3,6 g, 7,2 g, e 14,4 g de grânulos de GSK e servir como GSKL, GSKM, e GSKH, respectivamente. Pesar 0,72 comprimido para o grupo CAL.
3. Colocar 7,2 g de grânulos GSK num tubo de 50 mL. Adicionar 36 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente. Repita isto com 3,6 g e 14,4 g de grânulos de GSK.
4. Repita a secção 1,6 para administração intragástrica com 2 mL de solução de trabalho GSK.
   Nota: administrar o mesmo volume de solução salina (2 mL por rato) para preparar o soro e serve como um grupo de controle em branco para ensaios in vitro.
5. Preparação do soro contendo GSK
   1. Intraperitoneally anestesiar os ratos com 300 mL/100 g de 80 mg/kg de cetamina 1 h após a última administração de grânulos de GSK. Use uma pitada de agulha dos dedos do pé para confirmar se o rato está completamente anestesiado. Nenhuma resposta indica a anestesia bem sucedida.
   2. Expor o abdômen para a parte inferior do tórax de ratos usando tesoura de operação reta depois de incisão a pele e peritoneum.
      Nota: o instrumento cirúrgico deve ser esterilizado a altas temperaturas e altas pressões antes do uso. A área cirúrgica deve ser esterilizada com 70% de etanol durante a coleta de sangue.
   3. Retire o tecido conjuntivo da aorta abdominal com papel tissue para expor o vaso claramente.
   4. Extraia o sangue da aorta abdominal usando uma seringa de 10 mL, 22 G. Em seguida, retire a agulha e transfira o sangue para um tubo estéril de 15 mL. Geralmente, 6 − 8 mL de sangue podem ser obtidos de um rato.
      Nota: cada rato deve ser mantido vivendo quando se desenha sangue. Um indicador é que a aorta abdominal pulsa quando o rato está vivo. O rato está morto após a tração do sangue.
   5. Mantenha o tubo ereto à temperatura ambiente durante 30 − 60 min até que o sangue esteja coagulado no tubo. Em seguida, centrifugue o tubo a 500 − 600 x g durante 20 min. Transfira todo o sobrenadante (soro) de um grupo (6 ratos) para 1 50 ml de tubo estéril e agitar para misturar.
   6. Inative o soro incubando em um banho de água de 56 ° c por 30 minutos. Filtre o soro usando um filtro hidrofílico de seringa de polietersulfona de 0,22-μm-pore-size. Armazene em-80 ° c para o uso a longo prazo (menos de 1 ano).
      Nota: o soro filtrado pode ser utilizado para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese.
6. Aplicativo
   1. Osteoclastogênese in vitro
      1. Diluir as três dosagens do soro contendo GSK (GSKL, GSKM, GSKH) na proporção de 1:4 com o meio de águia mínimo (α-MEM) contendo L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxiribonucleosídeos.
         Nota: Assegure-se de que a concentração final de soro contendo GSK para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese é de 20%.
      2. Adicione o soro contendo GSK diluído (200 μL/poço) da etapa 3.6.1.1 aos macrófagos da medula óssea (BMMs) dos camundongos C57BL/6 velhos de 4 − 6 semanas para a osteoclastogênese e estimule BMMs com fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, 10 ng/mL) e ativador de receptores para o ligante do fator-κB nuclear (RANKL, 100 ng/mL) como descrito previamente².
   2. Osteoblastogênese in vitro
      1. Repita a etapa 3.6.1.1.
      2. Adicione o soro contendo GSK diluído (2 ml/poço) às pilhas de haste mesenquimais do osso (bmscs) dos ratos C57Bl/6 velhos da semana 4 − 6 para gerar o osteoblástica como descrito previamente¹⁶.

Os resultados da varredura do Micro-CT indicaram que os ratos de OVX mostraram a perda óssea significativa comparada aos ratos do controle salino (Figura 1a). A intervenção (90 dias) dos grânulos de GSK aumentou grandemente a DMO, particularmente no grupo GSKM (Figura 1b). Os parâmetros da estrutura óssea, como DMO, BV/TV, TB. N e Tb.Th, foram quantificados. Os tratamentos de grânulos GSK levaram ao aumento da DMO, BV/TV, TB. N e Tb.Th, mas diminuíram TB. SP (Figura 1C).

A coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) mostrou um aumento no número de osteoclastos em camundongos OVX comparados aos camundongos controle (Figura 2a). Os tratamentos do grânulo de GSK diminuíram osteoclastos armadilha-positivos comparados ao grupo de OVX. Estes resultados foram confirmados calculando a relação da área armadilha-positiva à superfície trabecular do osso (OCs/BS%) e a razão entre o número de osteoclast e a área óssea (OCs/mm2). Esses resultados quantitativos mostraram uma diminuição significativa do número de osteoclastos em grupos GSK em relação ao grupo OVX (Figura 2b, C).

O soro que contem o grânulo de GSK foi administrado aos macrófagos da medula óssea (BMMs) dos ratos C57BL/6 velhos da semana 4 − 6 para gerar o osteoclast e o número de osteoclastos foi analisado pela mancha da armadilha. Os resultados mostraram que o soro contendo Granule GSK diminuiu o número de osteoclastos TRAP-positivos em grupos de GSK comparados ao grupo controle (Figura 3a, B).

A mancha da fosfatase alcalina (ALP) mostrou que o soro Granule-Medicated GSK exerceu efeitos estimulatórios no osteoblastogenesis com MSCs de C57BL/6 ratos. A coloração de ALP mostrou que todos os três grupos do soro do grânulo-Medicated de GSK tinham aumentado a atividade de ALP (figura 4a, B) comparado ao grupo de controle.

Figura 1: O grânulo de GSK impede a perda do osso em ratos OVX-induzidos. (A) os camundongos foram tratados com grânulos de GSK por 3 meses e os tíbias esquerdos foram colhidos para realizar a análise do Micro-CT. As imagens tridimensionais representativas da reconstrução (3D) do osso trabecular de tíbias esquerdos foram mostradas. Barra de escala = 0,5 mm. (B) a densidade mineral óssea (DMO) foi mensurada e quantificada. (C) parâmetros ósseos de tíbias esquerdas, como o número de osso trabecular (TB. N), volume ósseo sobre volume total (BV/TV), espessura óssea trabecular (TB.th) e separação trabecular óssea (TB. SP), relacionados à estrutura óssea trabecular em todos os grupos foram mostrados. Os grupos GSKL, GSKM e GSKH foram comparados com o controle (con; Sham + Saline) e o grupo OVX (n = 6, *p < 0, 5, versus controle; *p < 0, 5, versus OVX). CAL: carbonato de cálcio com vitamina D3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: os grânulos de GSK suprimem o número de osteoclastos em camundongos OVX. (A) a mancha da armadilha foi executada na vértebra lombar 3 (L3) depois que os ratos GSK-tratados foram colhidos. Os resultados da armadilha do controle (Sham + Saline), OVX (OVX + soro fisiológico), o CAL (OVX + Caltrate), GSKL (OVX + dose baixa GSK, 2 g/kg/day), GSKM (OVX + dose média GSK, 4 g/kg/day), e GSKH (OVX + dose elevada GSK, 8 g/kg/day) foram medidos e analisados. Barra de escala = 100 μm (imagens superiores) ou 50 μm (imagens inferiores). (B) quantificação da superfície coberta por osteoclast sobre a superfície óssea. (C) número de osteoclast. Os valores foram expressos em média ± erro padrão da média (MEV). *P < 0, 5, OVX versus controle (con); *P < 0, 5, os grupos de cal ou GSKL/gskm/GSKH versus o grupo OVX. Todos os ensaios foram repetidos com pelo menos 3 camundongos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: o grânulo de GSK Medicated-o soro diminui o osteoclastogênese dos macrófagos da medula óssea (bmms). (A) bmms de C57Bl/6 camundongos (4 − 6 semanas de idade) foram colhidos, e cultivados com m-CSF (10 ng/ml) e RANKL (100 ng/ml) (controle), M-CSF e RANKL mais GSK, ou cal medicado serums. O osteoclastogenesis foi avaliado no dia 4 − 6 pela mancha da armadilha. Barra de escala = 100 μm. (B) quantificou-se o número de osteoclastos. *P < 0, 5, os grupos de GSKL/gskm/GSKH versus controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: o soro do grânulo-Medicated de GSK promove o osteoblastogenesis. (A) células-tronco mesenquimais ósseas (MSCS) de camundongos C57Bl/6 (4 − 6 semanas de idade) foram isoladas e tratadas com soro medicado com GSK ou Cal. A coloração ALP foi realizada no 7º dia para avaliar a osteoblastogênese. Barra de escala = 100 μm. (B) quantificou-se o número de osteoblastos. *P < 0, 5, os grupos de cal ou GSKL/gskm/GSKH versus controle. Todos os ensaios foram repetidos com pelo menos 3 camundongos ou 3 vezes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.