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Artigo de método

Preparação de grânulos de Gushukang (GSK) para experimentos in vivo e in vitro

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DOI:

10.3791/59171

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9 de maio de 2019

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este artigo fornece um protocolo detalhado para preparar uma solução de trabalho de grânulos de Gushukang para estudos animais e o grânulo de GSK que contem o soro para in vitro experimenta. Este protocolo pode ser aplicado a investigações farmacológicas de fitoterápicos, bem como prescrições para experimentos in vivo e in vitro.

Resumo

A medicina erval chinesa tradicional joga um papel como um método alternativo em tratar muitas doenças, tais como a osteoporose na pós-menopausa (PNF). Os grânulos de gushukang (GSK), uma prescrição comercializada em China, têm efeitos osso-protetores em tratar o PNF. Antes da administração ao corpo, um procedimento padrão da preparação é exigido geralmente, que visa promover a liberação de constituintes ativos das ervas cruas e realçar os efeitos farmacológicos assim como resultados terapêuticos. Este estudo propõe um protocolo detalhado para o uso de grânulos de GSK em ensaios experimentais in vivo e in vitro. Os autores fornecem primeiramente um protocolo detalhado para calcular as dosagens animal-apropriadas dos grânulo para a investigação in vivo: pesando, dissolvendo, armazenamento, e administração. Em segundo lugar, este artigo descreve protocolos para a varredura do Micro-CT e a medida de parâmetros do osso. Foram avaliados a preparação da amostra, protocolos para a execução da máquina de microtomografia computadorizada e quantificação dos parâmetros ósseos. Em terceiro lugar, os grânulos GSK contendo soro são preparados, e o soro contendo medicamentos é extraído para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese. Os grânulos de GSK foram administrados intragástrica duas vezes por o dia aos ratos por três dias consecutivos. O sangue foi então coletado, centrifugado, inativado e filtrado. Finalmente, o soro foi diluído e usado para executar o osteoclastogênese e o osteoblastogenesis. O protocolo descrito aqui pode ser considerado uma referência para investigações farmacológicas de medicamentos de prescrição de ervas, como grânulos.

Introdução

A medicina tradicional chinesa (TCM) é uma das importantes abordagens complementares e alternativas para o tratamento da osteoporose1,2. A decocção de água é a forma básica e mais comumente usada da fórmula3. No entanto, desvantagens também existem: mau gosto, inconveniente para o transporte, vida útil curta e protocolos inconsistentes, limitando os usos, bem como os efeitos curativos. Para evitar as desvantagens acima, bem como para perseguir melhores efeitos, os grânulos foram desenvolvidos e têm sido amplamente utilizados4. Embora muitos estudos tenham explorado os mecanismos farmacológicos de um ou mais componentes efetivos dos grânulos5,6,7, os mecanismos exatos e os processos farmacológicos subjacentes ainda são difícil de identificar. Isto é porque muitos componentes eficazes de um grânulo podem simultaneamente exercer efeitos semelhantes ou opostos4. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo padrão para preparar os grânulos antes de entregar para o corpo não só teria um grande impacto sobre os resultados terapêuticos, mas também é necessária para ambos in vivo e in vitro ensaios.

Além disso, os efeitos curativos dos grânulos na clínica são difíceis de confirmar e identificam exatamente o uso de estudos in vitro ou ex vivo, o que cria um desafio porque os mecanismos farmacológicos são muito complexos. Para resolver isso, a preparação do soro contendo drogas foi proposta pela primeira vez por Tashino na década de 19808. A partir de então, numerosos pesquisadores aplicaram soro contendo medicamentos à fitoterapia,incluindo grânulos9,10,11. Atualmente, a escolha do soro contendo medicamentos para investigações in vitro é considerada como uma estratégia que imita de perto as condições fisiológicas.

Os grânulos de gushukang (GSK) foram desenvolvidos para tratar a osteoporose pós-menopausa (POP) com base na prática clínica à luz da teoria da TCM. Os grânulos de GSK impedem a perda óssea em camundongos ovariectomizados (OVX) in vivo, inibem a reabsorção óssea osteoclástica e estimulam a formação óssea osteoblástica4. Conseqüentemente, Li et al.12 descobriram que os grânulos GSK apresentam efeitos protetores ósseos em camundongos OVX, reforçando as atividades do receptor de cálcio para estimular a formação óssea. Para confirmar os efeitos protetores ósseos, bem como os efeitos farmacológicos de grânulos GSK, os autores aqui fornecem um procedimento detalhado para a preparação de soluções de trabalho e medicamentos (grânulo GSK)-contendo soro. Além disso, este artigo descreve a aplicação de grânulos de GSK em um modelo osteoporóticas OVX-induzido do rato e no soro Granule-contendo de GSK para in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis.

Os grânulos de GSK são compor de diversas ervas13,14 e podem completamente ser dissolvidos no soro fisiológico facilmente. Conseqüentemente, o soro fisiológico serve como o veículo. Camundongos Sham-operados (Sham) e camundongos OVX foram administrados o mesmo volume de soro fisiológico que os camundongos administrados por grânulos. As doses equivalentes de grânulos de GSK para o camundongo foram calculadas com base na equação de meeh-Rubner15. Esta equação não só tem a vantagem de obter dosagens seguras, mas também garante efeitos farmacológicos15. As três dosagens de grânulos de GSK foram geradas como a seguir: (1) GSKL: OVX + baixo-dose GSK grânulos, 2 g/kg/day. (2) GSKM: OVX + médio-dose GSK grânulos, 4 g/kg/dia. (3) GSKH: OVX + alta-dose GSK grânulos, 8 g/kg/dia. Camundongos nos grupos GSKL, GSKM e GSKH foram administrados em grânulos de GSK intragastricamente. O carbonato de cálcio (600 mg/comprimido) com vitamina D3 (125 unidade/comprimido internacional), por exemplo, em um produto maduro e comercializado (por exemplo, Caltrate [CAL]) para o tratamento e prevenção da osteoporose, foi usado como um controle positivo.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Xangai do TCM (SZY201604005).

1. preparação e administração da solução de trabalho da GSK

  1. Calcule as doses equivalentes de grânulos GSK para o mouse.
    1. Calcule a superfície do corpo com base na equação de meeh-Rubner15: superfície corporal = k x (peso corporal2/3)/1000, onde os valores de k são 10,6 para humanos e 9,1 para o mouse. Assumindo um peso corporal humano de 70 kg, então a superfície do corpo humano (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Assumindo um peso corporal de rato de 20 g (0, 2 kg; por exemplo, 1 mês de idade, fêmea, C57/BL6), em seguida, a superfície do corpo do mouse (m2) = 9,1 x (0, 22/3)/1000 = 0, 67 m2.
    2. Com base na superfície do corpo calculado, calcule a relação de transformação do corpo para humanos e mouse. Humano: 70 kg/1,8 m2 = 39. Rato: 0, 2 kg/0.0067 m2 = 3. Grânulo GSK = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Com base em um peso corporal de 20 g por rato, calcule a dosagem equivalente para o rato: 4 g/kg x 0, 2 kg = 0, 8 g.
    4. Calcule três doses equivalentes de grânulos de GSK com base em 20 camundongos por grupo e uma intervenção com duração de 3 meses (90 dias): (1) GSKL (OVX + baixo-dose GSK grânulos [2 g/kg/dia]): 0, 4 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 72 g. (2) GSKM (OVX + médio-dose GSK grânulos [4 g/kg/ dia]): 0, 8 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 144 g. (3) GSKH (OVX + alta-dose GSK grânulos [8 g/kg/dia]): 0,12 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 216 g.
      Nota: Prepare um adicional de 20% de grânulos GSK na prática para compensar a perda.
  2. Calcule o volume de grânulo GSK por rato com base no peso corporal15: por exemplo, volume (V) = 0,24 ml/mouse/dia.
    Nota: o volume para a administração intragástrico para o rato é 0,12 ml/10 g.
  3. Pesar 10-dias ' valor de três doses de GSK grânulos. Pesar 8 g, 16 g, e 24 g de grânulos de GSK e servir como GSKL, GSKM, e GSKH, respectivamente.
  4. Calcule a dose equivalente de carbonato de cálcio com vitamina D3 (CAL) para o rato com base na equação de meeh-Rubner15 como nos passos 1.1.1 e 1.1.2: dosagem de Cal = 2 comprimidos/70 kg x 39/3 = 0,372 comprimido/kg ≈ 0,4 comprimido/kg.
  5. Com base em um peso corporal de 20 g por mouse (por exemplo, 1 mês de idade, feminino, C57/BL6), calcule a dosagem equivalente de CAL para mouse: 0,4 comprimido/kg x 0, 2 kg = 0, 8 comprimido. Em seguida, calcule a dose equivalente de CAL com base em 20 camundongos por grupo e uma intervenção com duração de 3 meses (90 dias): 0, 8 comprimido x 20 x 90 = 14,4 comprimidos. Pesar 10 dias de CAL (1,6 comprimidos).
  6. Dissolução
    1. Colocar 8 g de grânulos GSK num tubo de 50 mL. Adicionar 48 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente.
      Nota: o padrão para a dissolução completa é a ausência de sedimentos. A dissolução completa pode mais ser confirmada se uma agulha do gavagem puder elaborar a solução de trabalho e expeli-la então lisamente.
    2. Repita o passo 1.5.1 com 16 g e 24 g de grânulos GSK.
    3. Coloque 1,6 comprimidos (10 dias de valor) de CAL em um tubo de 50 mL. Adicionar 48 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente.
      Nota: as soluções de trabalho podem ser armazenadas a-4 ° c e preparadas a cada 10 dias.
  7. Administração intragastric
    1. Segure a parte de trás do mouse (1 mês de idade, fêmea, C57/BL6) com o mouse voltado para a frente e certifique-se de que ele permaneça firme nessa posição. Mantenha o rato calmo durante 2 − 3 minutos antes da administração.
      Nota: Certifique-se de que o pesquisador pode ver claramente a frente do mouse. Use luvas para evitar picadas de rato, especialmente para novos pesquisadores.
    2. Coloque a agulha de gavagem (tamanho: #12, 40 mm) na solução de trabalho de grânulos GSK e desenhe 0,24 mL da solução de trabalho.
    3. Põr a agulha do gavagem no rato através de um lado de sua boca até que a agulha do gavagem alcangue o estômago.
      Nota: para confirmar a agulha de gavagem atingiu o estômago: (1) a agulha de gavagem encontra a sensação de resistência. Enquanto isso, o mouse mostra a ação de engolir antes da agulha gavagem passa o estreitamento físico do esôfago. (2) injete aproximadamente 0,5 mL da solução de trabalho no rato e aguarde 1 min. Se não houver nenhuma solução saindo do mouse, isso significa que a agulha de gavagem atingiu o estômago.
    4. Injete a solução de trabalho do grânulo de GSK (0,24 mL/mouse) no estômago e extraia então a agulha do gavagem. Devolva o mouse para a gaiola.
    5. Repita o passo 1.6.4 com a solução CAL e injete 0,24 mL de solução de CAL por rato.
      Nota: o volume de solução CAL é calculado como no passo 1,2.

2. Micro-CT digitalização

  1. T Ibia colheita e preparação
    1. Intraperitoneally anestesiam o rato com 300 mL/100 g de 80 mg/kg de cetamina no dia seguinte à intervenção do dia 90. Use uma pitada de agulha dos dedos do pé para confirmar se o mouse está completamente anestesiado. Nenhuma resposta indica a anestesia bem sucedida. Em seguida, matar o mouse com luxação cervical.
    2. Fixe o rato com os braços e as pernas na espuma com tachas.
    3. Cortar a pele com tesouras (tamanho: 8,5 cm) e pinças (tamanho: 10 cm) das pernas da extremidade proximal para a distal e depois colher Tibias.
    4. Imediatamente colocar o tíbias em 70% álcool etílico e lavar por 3 vezes.
  2. Enrole a tíbia esquerda do mouse com espuma de esponja e colocá-lo em um tubo de amostra (35 mm de diâmetro, 140 mm de comprimento).
    Nota: o eixo longo da amostra deve ser junto com o do tubo de amostragem. Assegure a extremidade proximal dos pontos da tíbia para cima.
  3. Executando o micro-CT 80 Scan Machine
    1. Inicie a máquina de digitalização Micro-CT 80 à temperatura ambiente.
    2. Ajuste o tubo de amostra no micro-CT 80 e comece a varredura da seção transversal com os seguintes parâmetros da exploração: tamanho do pixel 15,6 μm, tensão 55 kV do tubo, corrente 72 μA do tubo, tempo da integração 200 MS, μm da definição espacial 15,6, μm da definição do pixel, e matriz da imagem 2048 x 2048.
      Nota: o osso esponjoso distingue-se do osso cortical através da pré-digitalização. A área de varredura da tíbia é definida como a área óssea esponjoso de 5 mm abaixo do planalto tibial até a extremidade distal.
  4. Quantificação do parâmetro ósseo
    1. Depois de concluir a digitalização de seção transversal, obtenha as imagens das tíbias esquerdas.
    2. Ajuste o limiar de densidade a 245 − 1000. Use o programa de avaliação micro-TC V 6.6 para medir os seguintes parâmetros ósseos: densidades minerais ósseas (DMO), volume ósseo sobre volume total (BV/TV), número ósseo trabecular (TB. N), espessura óssea trabecular (Tb.Th), bem como separação óssea trabecular óssea ( TB. SP).

3. preparação do soro sanguíneo para experimentos in vitro

  1. Cálculo
    1. Baseado em um peso de corpo do rato de 0,2 quilogramas (1 mês velho, fêmea, Sprague-Dawley), calcule a dosagem do grânulo de GSK: dosagem humana/dia x peso corporal do peso humano de x K/Body do rato = 20 g/70 quilogramas/dia x 70 quilogramas x K (K = 0, 18)/0,2 quilogramas = 2 g/kg/day
      Nota: K é o coeficiente de transformação farmacológica entre o humano e o rato15 (k = 0, 18).
    2. Repita a etapa 3.1.1 e calcule as seguintes dosagens.
      1. Calcule a dosagem de GSKL: 10 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/dia.
      2. Calcule a dosagem de GSKM: 20 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/dia.
      3. Calcule a dosagem de GSKL: 40 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/dia.
      4. Calcular dosagem de CAL: 2 comprimidos/70 kg/dia x 70 kg x K/0,2 kg = 0,2 comprimido/kg/dia.
    3. Calcule a dosagem total de grânulo de GSK e CAL.
      1. Calcule a dosagem total para GSKL: 1 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 3,6 g.
      2. Calcule a dosagem total para GSKM: 2 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 7,2 g.
      3. Calcule a dosagem total para GSKH: 4 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 14,4 g.
      4. Calcule a dosagem de CAL = 0,2 comprimido/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 0,72 comprimido.
        Nota: um total de 10 mL de soro contendo Granule GSK é necessário para preparar 100 mL de meio de cultura (20% GSK Granule contendo soro). Espera-se que cada rato (6 ratos/grupo) forneça 1,5 − 2 mL de soro contendo Granule GSK após a centrifugação.
    4. Calcule o volume de grânulos GSK aplicados por rato com base no peso corporal15: por exemplo, volume (V) = 2 ml/Rat/dia.
      Nota: o volume para administração intragástrica para rato é 0,1 mL/10 g.
  2. Pesar 3-days ' valor de três doses de GSK grânulos. Pesar 3,6 g, 7,2 g, e 14,4 g de grânulos de GSK e servir como GSKL, GSKM, e GSKH, respectivamente. Pesar 0,72 comprimido para o grupo CAL.
  3. Colocar 7,2 g de grânulos GSK num tubo de 50 mL. Adicionar 36 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente. Repita isto com 3,6 g e 14,4 g de grânulos de GSK.
  4. Repita a secção 1,6 para administração intragástrica com 2 mL de solução de trabalho GSK.
    Nota: administrar o mesmo volume de solução salina (2 mL por rato) para preparar o soro e serve como um grupo de controle em branco para ensaios in vitro.
  5. Preparação do soro contendo GSK
    1. Intraperitoneally anestesiar os ratos com 300 mL/100 g de 80 mg/kg de cetamina 1 h após a última administração de grânulos de GSK. Use uma pitada de agulha dos dedos do pé para confirmar se o rato está completamente anestesiado. Nenhuma resposta indica a anestesia bem sucedida.
    2. Expor o abdômen para a parte inferior do tórax de ratos usando tesoura de operação reta depois de incisão a pele e peritoneum.
      Nota: o instrumento cirúrgico deve ser esterilizado a altas temperaturas e altas pressões antes do uso. A área cirúrgica deve ser esterilizada com 70% de etanol durante a coleta de sangue.
    3. Retire o tecido conjuntivo da aorta abdominal com papel tissue para expor o vaso claramente.
    4. Extraia o sangue da aorta abdominal usando uma seringa de 10 mL, 22 G. Em seguida, retire a agulha e transfira o sangue para um tubo estéril de 15 mL. Geralmente, 6 − 8 mL de sangue podem ser obtidos de um rato.
      Nota: cada rato deve ser mantido vivendo quando se desenha sangue. Um indicador é que a aorta abdominal pulsa quando o rato está vivo. O rato está morto após a tração do sangue.
    5. Mantenha o tubo ereto à temperatura ambiente durante 30 − 60 min até que o sangue esteja coagulado no tubo. Em seguida, centrifugue o tubo a 500 − 600 x g durante 20 min. Transfira todo o sobrenadante (soro) de um grupo (6 ratos) para 1 50 ml de tubo estéril e agitar para misturar.
    6. Inative o soro incubando em um banho de água de 56 ° c por 30 minutos. Filtre o soro usando um filtro hidrofílico de seringa de polietersulfona de 0,22-μm-pore-size. Armazene em-80 ° c para o uso a longo prazo (menos de 1 ano).
      Nota: o soro filtrado pode ser utilizado para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese.
  6. Aplicativo
    1. Osteoclastogênese in vitro
      1. Diluir as três dosagens do soro contendo GSK (GSKL, GSKM, GSKH) na proporção de 1:4 com o meio de águia mínimo (α-MEM) contendo L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxiribonucleosídeos.
        Nota: Assegure-se de que a concentração final de soro contendo GSK para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese é de 20%.
      2. Adicione o soro contendo GSK diluído (200 μL/poço) da etapa 3.6.1.1 aos macrófagos da medula óssea (BMMs) dos camundongos C57BL/6 velhos de 4 − 6 semanas para a osteoclastogênese e estimule BMMs com fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, 10 ng/mL) e ativador de receptores para o ligante do fator-κB nuclear (RANKL, 100 ng/mL) como descrito previamente2.
    2. Osteoblastogênese in vitro
      1. Repita a etapa 3.6.1.1.
      2. Adicione o soro contendo GSK diluído (2 ml/poço) às pilhas de haste mesenquimais do osso (bmscs) dos ratos C57Bl/6 velhos da semana 4 − 6 para gerar o osteoblástica como descrito previamente16.

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Resultados

Os resultados da varredura do Micro-CT indicaram que os ratos de OVX mostraram a perda óssea significativa comparada aos ratos do controle salino (Figura 1a). A intervenção (90 dias) dos grânulos de GSK aumentou grandemente a DMO, particularmente no grupo GSKM (Figura 1b). Os parâmetros da estrutura óssea, como DMO, BV/TV, TB. N e Tb.Th, foram quantificados. Os tratamentos de grânulos GSK levaram ao aumento da DMO, BV/TV, TB. N e...

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Discussão

Os grânulos de agentes de TCM tornaram-se uma das escolhas comuns para formulações ou prescrições. GSK grânulos são compostos de vários medicamentos fitoterápicos com base em experiências clínicas ou a teoria TCM, e eles exercem melhores efeitos curativos com menos efeitos colaterais4. Comparado com a decocção da água, os grânulo têm estas vantagens: bom gosto, conveniência da entrega, armazenamento a longo prazo, protocolo padrão e efeitos curativos consistentes, assim como uma produtividade mais...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de ciências naturais da China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 e 81330085), o programa de equipe inovadora, Ministério da ciência e tecnologia da China (2015RA4002 para WYJ), o programa para Equipe inovativa, Ministry da instrução de China (IRT1270 a WYJ), centro médico de Shanghai TCM da doença crônica (2017ZZ01010 a WYJ), três anos de ação para acelerar o desenvolvimento do plano tradicional da medicina chinesa (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), e projetos de desenvolvimento de pesquisa-chave nacionais (2018YFC1704302).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
α-MEMHyclone
laboratories		SH30265.018Para cultura de células
β-GlicerofosfatoSigmaG5422Osteoblastogênese
Caltrato (CAL)WyethL96625Intervenção animal
C57BL/6 camundongosSLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		Preparação aleatóriade Ainimal
DexamethsomeSigmaD4902
Dimetil sulfóxido SigmaD2438Ácido
tetraacético de etileno diamina congelado (EDTA)Sangon Biotech60-00-4Amostras treatmnet
Soro bovino fetalGibcoFL-24562Para cultura de células
Gushukang grânuloskangcheng companyin chinaZ20003255Prescrição de ervas
Microscópio de luzOlympus BX50Olympus BX50Imagens para osteoclastogênese
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sequinagneium slat hyclrateSigmaA8960-5GMicroscópio de osteoblastogênese
LeicaDMI300BOsteocast e osteoblasto imagine
M-CSFPeprotechAF-300-25-10Osteoclastogênese
Μ icro-CTScanco
Medical AG&		mu; Microtomógrafo de radiografia CT80Osso Analsyse estrutural
RANKLPeprotech11682-HNCHFOsteoclastogênese
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		Coleta aleatóriasoro sanguíneo
de fosfato ácido resistente ao tartarato (TRAP)Coloração Sigma-Aldrich387A-1KTTRAP
de Kit

Referências

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