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Artigo de método

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

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DOI:

10.3791/60182

⸱

27 de setembro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Neste artigo

Resumo

Este método descreve a preparação da amostra de células cultivadas e tecidos animais, extração e derivatização da coenzima A nas amostras, seguida de cromatografia líquida de alta pressão para purificação e quantificação da coenzima a derivatizada por absorvância ou detecção de fluorescência.

Resumo

A pesquisa emergente revelou que a fonte celular da coenzima A (CoA) pode tornar-se limitando com um impacto prejudicial no crescimento, no metabolismo e na sobrevivência. A medida do COA celular é um desafio devido a sua abundância relativamente baixa e à conversão dinâmica de COA livre aos tioésteres de COA que, por sua vez, participam em reações metabólicas numerosas. Um método é descrito que navega através das armadilhas potenciais durante a preparação da amostra para render um ensaio com uma escala linear larga da deteção que seja apropriada para o uso em muitos laboratórios biomédicos.

Introdução

Coenzima A (COA) é um cofator essencial em todos os organismos vivos e é sintetizada a partir de ácido pantotênico, também chamado pantotenato (o sal do ácido pantotênico) ou vitamina B5. O CoA é o principal portador intracelular de ácidos orgânicos, incluindo ácidos de cadeia curta, como acetato e succinato, ácidos de cadeia ramificada, como propionato e metilmalonato, ácidos graxos de cadeia longa, como palmitato e oleato, ácidos graxos de cadeia muito longa, como ácidos graxos poliinsaturados e xenobióticos, como o ácido valproico. O ácido orgânico dá forma a um enlace do Tioéster enzymaticamente com o COA para permitir seu uso como um substrato em mais de 100 reações no metabolismo intermediário1. Os tioésteres de COA são também reguladores alostérico e activators transcricional. É apreciado agora2 que a fonte total celular do COA é regulada3,4; assim, a disponibilidade de CoA pode ser limitante, e que as deficiências de CoA podem ser catastróficas, como exemplificada por desordens genéticas herdadas que impactam o biossynthesis5do COA. A quinase de pantothenate catalisa a primeira etapa na biossíntese de CoA (Figura 1) e a neurodegeneração associada Pantothenate da quinase, chamada pkan, é causada por mutações no gene PANK2 6. A enzima CoA sintase, codificada pelo gene Coasyn , catalisa os dois últimos passos na biossíntese de COA (Figura 1) e a neurodegeneração associada à proteína Coasy, denominada Copan, é causada por uma mutação no gene da coasyn 7. Ambos pkan e Copan são doenças neurodegenerativas herdadas associadas com a acumulação do ferro nas deficiências do cérebro e do COA Underly as patologias da doença.

Os níveis celulares do CoA total variam entre os tecidos8 e o COA total pode aumentar ou diminuir uma variedade de Estados fisiológicos, patológicos e farmacológicos. O CoA do fígado aumenta durante o switching do combustível do FED ao estado jejuado9, e os níveis do COA do fígado são anormalmente elevados em ratos obesos leptin-deficientes10. O CoA do fígado diminui em resposta à ingestão crônica do etanol11. Os níveis do CoA do cérebro no modelo do rato do Knockout Pank2 são deprimidos durante o período perinatal, mas mais tarde no índice adulto do COA do cérebro do estágio são equivalentes aos níveis do selvagem-tipo, indicando uma resposta adaptativa do COA durante o desenvolvimento12. A manipulação do conteúdo de COA tecidual por métodos de transgênese ou de entrega gênica impacta as funções metabólicas e neurais13,14,15. O desenvolvimento pré-clínico de terapias potenciais para pkan ou Copan inclui medidas da célula ou do tecido COA como indicadores da eficácia16,17,18,19,20 . A avaliação de todas estas condições e suas conseqüências metabólicas ou funcionais exige um método quantitativo para a medida do CoA total.

Um ensaio preciso e fiável para a medição de CoA em amostras biológicas é um desafio técnico em muitos laboratórios. Infelizmente, não há sondas disponíveis para avaliar ou quantificar tioésteres de COA ou CoA em células intactas, embora os análogos de tioésteres de CoA natural tenham sido amplamente utilizados como sondas mecanísticas em estudos de éster CoA utilizando enzimas21. A conversão do COA, com uma fração livre do sulfidrila (-SH), a um Tioéster de COA (ou reciprocamente) é rápida nas pilhas ou nos tecidos animais durante a transferência a um ambiente diferente e durante o lysis da pilha. Numerosas sinthetases de acilo-CoA e tioesterases de acilo-CoA nas células mediam as interconversões dentro da piscina CoA, e enzimas adicionais que utilizam tioésteres de CoA como substratos permanecem ativas em amostras biológicas até serem extinto por substâncias químicas ou físicas Significa. O off-loading de Acyl-grupos do COA à carnitina por Acyl-transferases é um exemplo dentro da rede das reações que podem alterar a distribuição do Tioéster de COA/COA. Os traçadores radioativos podem ser usados para medir as taxas de síntese de CoA nas células. Os métodos atuais para a medição de derivados de CoA e CoA em amostras biológicas foram revisados22 e incluem ensaios espectrofotométricos enzimáticos acoplados, cromatografia líquida de alta pressão e procedimentos baseados em espectrometria de massas. Entretanto, estes métodos são centrados frequentemente em espécies moleculars específicas do CoA e são cegos à variação da associação total do CoA. Os ensaios enzimáticos acoplados geralmente exigem maiores quantidades de material de entrada devido a baixas sensibilidades de detecção e têm uma faixa limitada de linearidade.

Nosso laboratório desenvolveu um procedimento de confiança para a quantificação do CoA total em pilhas cultivadas e em tecidos animais. A estratégia inclui a hidrólise de todos os tioésteres de COA para render somente o COA livre durante a preparação da amostra, um pouco do que fazendo esforços para manter e analisar o espectro inteiro de espécies de COA. O procedimento é uma compilação de métodos publicados individuais para a preparação da amostra, a derivação do COA, a purificação e a identificação depois da cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), e a quantificação do COA derivatizado pela absorvência ou detecção de fluorescência23,24,25. As determinações do CoA obtidas usando este procedimento permitiram nossa compreensão da regulação do CoA e o desenvolvimento de uma aproximação terapêutica para o tratamento de deficiências de CoA.

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Protocolo

O procedimento animal referido neste protocolo foi realizado de acordo com os protocolos 323 e 556 e especificamente aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais do hospital de pesquisa infantil St. Jude.

1. preparação de soluções

Nota: Use água ultrapura para todas as soluções e quando indicado nos procedimentos.

  1. Prepare 1 mM de hidróxido de potássio (KOH) em água.
  2. Prepare 0,25 M KOH na água.
  3. Prepare 1 M de Trizma-HCl em água e ajuste para pH 8,0.
  4. Prepare 100 mM monobromobimane (mBBr) em acetonitrila (optima grade). As soluções conservadas em estoque de mbbr são estáveis em-20 ° c por muitos meses contanto que são mantidas no escuro como a exposição à luz pode photolyze o monobromobimane ao moiraghi26.
  5. Prepare o tampão de lavagem para a coluna de extração em fase sólida (SPE): 50% metanol (optima grade) + 2% de ácido acético.
  6. Prepare o tampão de eluição para a coluna SPE: 95% etanol (HPLC grau) contendo 50 mM de amônio formate.

2. preparação do padrão de CoA-bimane

  1. Adquira um padrão CoA de alta qualidade de uma fonte respeitável (por exemplo, Avanti polar lipídios, Inc.).
  2. Prepare uma solução de estoque de alta concentração de CoA em 20 mM Tris, pH 8. A quantidade de CoA no estoque de alta concentração é determinada ou confirmada por absorbância espectrofotométrica a λ 260 nm (ɛ = 16.800 M-1∙ cm-1). Adicionar 4 vezes o excesso molar de mBBr; vórtice no alto para 10 s. Por exemplo, para 10 mM CoA em buffer, adicione 40 mM mBBr. O mBBr é adicionado no excesso para assegurar-se de que todo o CoA esteja derivatized.
  3. Incubar à temperatura ambiente durante 4 h no escuro sem agitar para derivatizar o CoA com mBBr. o mBBr reage com o grupo do tiol do CoA, e é pH e dependente da temperatura27. A adição do mBBr converte CoA a um fluorescente solúvel em água (ou absorsor ultravioleta) CoA-bimane (CoA-bimane; Figura 2).
  4. Adicionar 100 μL de ácido acético e vórtice em altura por 10 s para parar a reacção.
  5. Centrifugue a 2.000 x g durante 15 minutos para remover qualquer precipitante.
  6. Limpe o sobrenadante usando uma coluna SPE para remover o mBBr não reagido (descrito abaixo). A filtração e a centrifugação do eluato não são necessárias após a limpeza da coluna SPE (secção 5,8).
  7. Colete o eluato da coluna SPE contendo o CoA-bimane em um tubo pré-pesado, seque gás nitrogenado, pese e construa uma curva de calibração padrão com quantidades conhecidas de CoA-bimane.
    1. Verifique a norma CoA-bimana para a pureza por HPLC (ver abaixo) com detecção de absorvência em ambos λ 260 (fração de adenina) e λ 393 (fração bimana) e coincidência de ambos os picos no cromatograma.
    2. Confirme a quantidade do padrão CoA-bimane no estoque de alta concentração usando λ 260 nm (ɛ = 16.800 M-1∙ cm-1).
  8. Registre o tempo de retenção da HPLC para a identificação de CoA-bimane em amostras experimentais usando o padrão de CoA-bimane.
  9. Alíquotas da loja do estoque elevado da concentração do padrão de COA-bimane protegido da luz e armazenado em-20 ° c por até 2 anos. Evite o descongelamento repetido e a re-congelação.

3. extração e derivatização de CoA em células cultivadas

  1. Colha células aderentes na cultura quando se aproxima densidades subconfluentes tardias. Por exemplo, as células humanas HepG2/C3A são cultivadas para uma densidade de 6-8 x 106, ou as células HEK 293T são cultivadas para uma densidade de ~ 1,3 x 107 por 100 mm prato.
    1. Use culturas duplicadas ou triplicatas rotineiramente para determinações de CoA. Incubar pratos de cultura separados em paralelo com as culturas de células de amostra para determinar o número de células viáveis. Calcule a quantidade de CoA por 106-107 pilhas após a purificação da HPLC.
  2. Aspirar meio de cultura fora do prato. Lave rapidamente as células no prato com soro fisiológico com tampão de fosfato gelado (PBS) para remover qualquer meio residual e aspirar o PBS fora do prato. Lave rapidamente as células com água gelada para remover a PBS residual e aspirar a água para fora do prato rapidamente. Evite perturbar as células aderentes ao adicionar o PBS ou água.
  3. Adicione 1 mL de água gelada ao prato de cultura. Raspar as células na água fria no prato e transferir a suspensão celular para um tubo de ensaio de vidro contendo 400 μL de 0,25 M KOH e 1,5 mL de água.
    1. Misture a suspensão vigorosamente pelo vórtice no alto por 10 s. Em seguida, cubra firmemente com película de parafina e incubar a 55 ° c por 1 h sem tremer num banho de água. O pH da amostra deve ser ≥ 12. O pH elevado é importante para hidrolisar os tioésteres de COA e pode ser ajustado com alíquotas adicionais do Koh se necessário.
  4. Colher células cultivadas crescendo em suspensão por centrifugação a baixa velocidade: 136 x g por 6 min a 4 ° c. Lave uma vez com PBS gelado, depois lave brevemente novamente com água fria e, finalmente, ressuscite em 2,5 mL de água fria mais 400 μL 0,25 M KOH. Misture vigorosamente e incubar a 55 ° c como descrito acima.
  5. Adicionar 160 μL de 1 M de Trizma-HCl e 10 μL de 100 mM de mBBr e misturar por vórtice no alto por 10 s. Isto traz o pH a aproximadamente 8 para suportar a reação de mBBr com CoA livre. Cubra e incubar amostras à temperatura ambiente durante 2 h no escuro para que o mBBr reaja com o tiol do CoA.
  6. Adicionar 100 μL de ácido acético e misturar por vórtice no alto por 10 s para parar a reacção
  7. Centrifugue a 2.000 x g durante 15 min para remover detritos de células precipitadas.
  8. Retire e guarde o sobrenadante num tubo de ensaio de vidro para a limpeza da coluna SPE descrita abaixo.

4. extração e derivatização de CoA nos tecidos

  1. Peças de tecido animal Dissect, cerca de 0,5 cm de diâmetro ou menor, e blot brevemente (1-2 s) em papel absorvente e, em seguida, Flash congelar em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° c até o processamento. O COA nos tecidos é hidrolisado ou convertido a um Tioéster se não o flash congelado. Esta etapa é importante para obter o rendimento máximo de CoA nos tecidos.
  2. Pesar pedaços de tecido congelado (5 – 60 mg) rapidamente antes de iniciar a análise, e registrar o peso para cada amostra. Esta determinação de peso molhado é usada para o cálculo do conteúdo CoA após a purificação de HPLC. Evite o descongelamento completo das peças do tecido.
  3. Adicione 2 mL de KOH de 1 mM a um tubo de ensaio de vidro (por exemplo, 13 mm x 100 mm descartável) destinado à inserção de uma sonda e ruptura tecidual com um homogeneizador de estator de rotor. Mantenha o tubo no gelo até o uso. Isto é feito para assegurar-se de que as amostras estejam homogeneizadas em uma temperatura fria e o CoA não esteja destruído devido ao calor gerado durante a homogeneização.
  4. Transfira e Homogeneize o tecido (30 – 40 MGS) no tubo de ensaio de vidro (que contem o frio 1 milímetro KOH) para 30 s. Evite o descongelar completo do tecido.
  5. Adicionar 500 μL de KOH de 0,25 M; vórtice em alta por 10 s e manter no gelo até que todas as amostras são homogeneizadas. Isto trará o pH da amostra acima de 12 para hidrolisar os tioésteres do COA para render o COA total (COA livre + tioésteres hidrolisado de COA).
  6. Incubar amostras a 55 ° c durante 2 h num banho de água sem agitação para suportar a hidrólise.
  7. Adicionar 150 μL de 1 M de Trizma-HCl e 10 μL de 100 mM mBBr; vórtice no alto por 10 segundos. Isto traz o pH a aproximadamente 8 para suportar a reação de mBBr com CoA livre.
  8. Incubar amostras à temperatura ambiente durante 2 h no escuro para garantir que todo o CoA é derivatizado com mBBr.
  9. Adicionar 100 μL de ácido acético e vórtice no alto por 10 s para parar a reacção.
  10. Centrifugador em 2.000 x g por 15 minutos aos restos precipitados da pilha da pelota.
  11. Retire e guarde o sobrenadante num tubo de ensaio de vidro para a limpeza da coluna SPE (descrita abaixo).

5. amostra de limpeza com coluna de extração de fase sólida (SPE)

  1. À temperatura ambiente, equilibrar cada coluna descartável 2-(2-piridíl)-gel de sílica etil (1 mL de tamanho) com 1 mL de tampão de lavagem para garantir que o grupo funcional piridíl é protonado e funcionará como um permutador de ânions. 2-(2-pyridyl)-o gel de silicone do Ethyl é um cambista fraco do Anion que seja ideal para CoA-bimane em um pH básico. 2-(2-pyridyl)-o gel de silicone do Ethyl tem um pKa de 6 e a eluição é feita pH ≥ 7.
  2. Adicione o sobrenadante da amostra (etapa 4,11) à coluna e colete o eluate.
  3. Lave a coluna duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem para remover qualquer espécie não retida.
  4. Lave a coluna uma vez com 1 mL de água.
  5. Lave a coluna duas vezes com 1 mL de tampão de eluição num tubo de ensaio de vidro separado (12 mm x 75 mm) para recolher o CoA-bimane.
  6. Amostra seca do CoA-bimane no tubo o gás do nitrogênio à secura. A amostra seca é estável na temperatura ambiente até o uso mais adicional. Sele e cubra completamente o tubo e armazene-o.
  7. Quando pronto para a análise de HPLC, reressuscite a amostra em 300 μL de água e misture vigorosamente pelo Vortex na elevação por 10 s.
  8. Transfira a amostra ressuscipended a um filtro do tubo de centrifugação (acetato de celulose de 0,22 μm, tamanho de 2 mL) e Centrifugue em 5.000 x g por 10 minutos para remover todo o precipitant.
  9. Transfira a amostra filtrada para um frasco de vidro adequado para injeção de HPLC.

6. purificação de HPLC e medição de CoA-bimane

  1. Prepare buffers. Tampão A: 50 mM KH2po4, pH 4,6; Tampão B: acetonitrila (grau optima).
  2. Ligue o sistema de HPLC.
    Nota: o sistema HPLC em nosso laboratório é um módulo de separações Waters e2695 equipado com um detector de absorvância ultravioleta-visível (UV-VIS) 2489 e um detector de fluorescência 2475 controlado com o software Empower 3. O sistema igualmente tem um injector automatizado da amostra.
  3. Injetar cada amostra (por exemplo, 20 μL) para a separação em um Gemini C18, 3 μm 100 Å, 4,6 mm x 150 mm coluna usando o programa na tabela 1 com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A temperatura da coluna é de 25 ° c. Meça a absorvância do detector UV/visível a λ 393 nm e a detecção fluorescente em λex = 393 nm, λem = 470 nm. O tempo de retenção é determinado executando uma curva padrão CoA-bimane antes de cada conjunto de amostras.
  4. Registre a área o pico de CoA-bimane para cada amostra e compare com a curva padrão para calcular o pmol do CoA-bimane injetado na coluna da HPLC. A curva padrão da absorvência de CoA-bimane é usada para amostras do tecido, e a curva padrão da fluorescência de CoA-bimane é usada para amostras da cultura do tecido.
  5. Como os valores de CoA-bimana representam CoA total para cada amostra, normalizam para o número de células viáveis para amostras de cultura, ou mg de peso molhado para amostras de tecido (Figura 6). Alternativamente, calcule os valores totais do CoA que seguem a normalização ao índice do ADN ou da proteína para cada amostra. O conteúdo de DNA ou proteína pode ser determinado separadamente usando alíquotas de amostra que são removidas durante a preparação da amostra antes da adição de KOH.

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Resultados

Um método relativamente rápido e de confiança para a deteção do COA total em pilhas e em tecidos cultivados foi desenvolvido derivatização o tiol do COA a um agente fluorescente usando o mbbr, e então purificante o COA-bimane derivatizado usando a HPLC da fase reversa. Uma curva padrão é gerada pela primeira vez, onde as quantidades conhecidas e crescentes da norma CoA-bimana são injetadas individualmente e as áreas os picos dos cromatogramas CoA-bimane são plotadas em função da entrada CoA-bimana (F...

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Discussão

Aqui nós demonstramos um procedimento de confiança, passo a passo para quantificar o CoA total nas pilhas e nos tecidos animais com uma escala larga da deteção linear que seja acessível em muitos laboratórios que têm um HPLC com uma absorvência ou um detector da saída da fluorescência. Alternativamente, a espectrometria de massas é uma técnica comum para a avaliação de tioésteres de CoA e CoA, mas não está amplamente disponível devido ao custo da instrumentação e ao conhecimento especializado exigido para o desenvolvimen...

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Divulgações

MWF, CS e SJ escreveram o artigo, MWF e CS forneceram os dados e figuras, o COR projetou os experimentos e revisou criticamente o manuscrito. SJ e cor são inventores em um pedido de patente pendente (PCT/US17/39037) "moduladores de pequenas moléculas de pantotenato kinases" detidos por St. Jude Children ' s Research hospital que abrange o composto PZ-2891 referenciado neste artigo.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o financiamento para a pesquisa patrocinada fornecida pela CoA Therapeutics, Inc., uma subsidiária da BridgeBio LLC, a concessão nacional dos institutos de saúde GM34496, e as instituições de caridade associadas sírias americanas libanesas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Coluna SPE de gel de sílica 2-(2-piridil) -etilMillipore-Sigma54127-U
coenzima AAvanti Polar Lipids870700
Gemini C18 3 μ m 100 & Aring; Coluna para HPLCPhenomenex00F-4439-E0
monobromobimaneThermoFisher ScientificM-1378
Omni-Tip sonda disruptor tecidualOmni International32750H
Parafilm FisherS37440
PowerGen 125 rotor motorizado homogeneizador de estatorThermoFisher ScientificNC0530997
Spin-X filtro de tubo de centrífugaCoStar8161
Trizma-HClFisherT395-1
Waters 2475 detector de fluorescênciaWaters2475
Waters 2489 detector UV-VisWaters2489
Waters e2695 módulo de separações Waters e2695

Referências

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