Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Resumo

É apresentado aqui um protocolo para enriquecer spermatocytes do paquíteno, espermátides redondos, e espermátides alongando dos testículos adultos do rato usando um inclinação bovino descontínuo da densidade da albumina do soro com equipamento de laboratório padrão.

Resumo

Para caracterizar cada etapa da espermatogênese, os pesquisadores devem separar diferentes subpopulações de células germinativas dos testículos. Entretanto, isolar populações discretas é desafiador, porque o testis adulto contem uma mistura complexa de pilhas de germe de todas as etapas da espermatogênese junto com determinadas populações de pilhas somáticas. Sobre as últimas décadas, as técnicas diferentes tais como o elutriation centrífugo, a classificação fluorescência-ativada da pilha (FACS), e o STA-PUT foram aplicados com sucesso ao isolamento de pilhas de germe. Uma desvantagem é que todos eles exigem dispositivos dedicados e treinamento especializado. Seguindo os princípios subjacentes ao método STA-put, foi desenvolvido um protocolo simples para o isolamento de espermatócitos de paquíteno, espermátides redondos e espermatócitos alongadores de testículos de rato. Após a preparação de uma única célula de suspensão das células testiculares, populações de células específicas são enriquecidas por sedimentação por gravidade através de um gradiente de densidade de albumina sérica bovina (BSA) descontínua. As frações celulares são então coletadas manualmente e analisadas microscopicamente. Este gradiente de densidade modificada para espermátides redondos (MDR) protocolo de sedimentação pode ser amplamente aplicado, porque requer apenas equipamento de laboratório padrão. Além disso, o protocolo requer materiais iniciais mínimos, reduzindo seu custo e uso de animais de laboratório.

Introdução

Muito ainda é desconhecido sobre os eventos moleculares e biológicos que acontecem durante a espermatogênese dos mamíferos, um processo complexo em que as células-tronco espermatogonianas se transformam em espermatozóides altamente especializados^1,2. A espermatogênese ocorre dentro dos túbulos seminíferos do testis. Os túbulos contêm uma mistura de células germinativas de cada etapa de diferenciação, incluindo células-tronco espermatogoniais, mitticamente dividindo a espermatogonia, espermatócitos meióticos e espermatócitos pós-meióticos (que se submetem à diferenciação haploide da rodada espermátides para alongando espermátides, e, finalmente, para amadurecer espermatozóides). As pilhas somáticas do testis incluem as pilhas de Sertoli que são misturadas com as pilhas de germe dentro dos tubules seminíferos, as pilhas myoid peritubular que formam paredes dos tubules, e as pilhas de Leydig deprodução no espaço intersticial entre túbulos.

O estudo de processos moleculares e bioquímicos durante a espermatogênese geralmente requer a separação de populações de células germinativas distintas de uma complexa mistura de células testiculares. Muitas estratégias diferentes foram desenvolvidas para o enriquecimento da pilha. Os métodos mais bem-sucedidos são a sedimentação da velocidade de Sta-Put por^{unidade de gravidade3,4,5,6,}elutriation centrífugo com base na centrifugação de contrarfluxo^7,8, e triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) que separa as células de acordo com o conteúdo de DNA e/ou marcadores específicos. Estes métodos são comumente usados entre os pesquisadores de espermatogênese e permitem o enriquecimento eficiente de tipos específicos de células germinativas. No entanto, uma limitação dessas técnicas é que eles exigem hardware especializado e caro que exigem especialização.

Apresentado aqui é um protocolo simples e barato para isolar populações enriquecidas das três populações de células mais abundantes de testículos de rato: spermatids redondos, espermatócitos de paquíteno, e espermátides alongando. Este protocolo é referido como o Gradient modificado da densidade para espermátides redondos (MDR), porque trabalha particularmente bem para enriquecer espermátides redondos. O método de MDR é baseado nos mesmos princípios que o sedimentation da velocidade de STA-PUT, contudo exige somente o equipamento de laboratório padrão. As células vivas são permitidas para sedimento através de um gradiente de densidade de Albumina bovina (BSA) descontínua preparado manualmente dentro de um tubo padrão de 50 mL o campo gravitacional da terra. Células maiores movem-se mais rapidamente através do gradiente, que separa diferentes populações de células germinativas. Após a sedimentação, as frações enriquecidas dos três tipos de células são coletadas manualmente. A pureza dessas populações de células enriquecidas é comparável àquelas obtidas por STA-PUT e elutriation centrífugo.

Além de cobrir a construção e o uso do gradiente de BSA para a sedimentação da velocidade, o protocolo também descreve um método de digestão para liberar células testiculares de túbulos seminíferos. O protocolo foi modificado a partir do desenvolvido por romrell et al.⁹ e inclui digestões sequenciais com colagenase IV e tripsina. As digestões sequenciais combinadas com o uso de um tampão do bicarbonato (isto é, a solução de Krebs) foram mostradas para realçar extremamente a separação e a viabilidade das pilhas de germe⁹.

Durante o enriquecimento de MDR, as células gastam em torno de 4 h juntas fora do ambiente dos túbulos seminíferos e não são submetidas a forças mecânicas estressantes, o que permite a coleta de frações celulares altamente viáveis para análise a jusante. Além disso, semelhante ao elutriation centrífugo e STA-PUT, o protocolo MDR não requer qualquer tratamento químico ou rotulagem de células, o que também ajuda a manter a sua viabilidade. Importante, tão pouco como dois testes de rato adultos são suficientes para o isolamento de MDR e, portanto, um rato adulto fornece suficiente células enriquecidas para análise de RNA e proteína. O protocolo padrão de STA-PUT recomenda o uso de tanto quanto como 12 ratos adultos para o isolamento⁶da pilha; embora, com base na experiência prévia, sabe-se que o isolamento bem-sucedido pode ser feito de três a quatro camundongos adultos. A menor quantidade de material de partida relatada como suficiente para a elutriação centrífuga é de seis testículos de camundongo (três camundongos)⁸. Conseqüentemente, além de eliminar a necessidade para o equipamento especializado caro, o protocolo de MDR reduz o número de animais do laboratório exigidos.

Protocolo

A manutenção de camundongos laboratoriais e todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. equipamento e conjunto de reagentes

1. Ajuste o banho de água a 37 ° c.
2. Ajuste a incubadora da cultura da pilha a 34 ° c, 5% CO₂, 95% umidade. Põr o rotator do tubo dentro da incubadora.
   Nota: As incubadoras exigem muito tempo para mudar a temperatura interna. Se uma incubadora ajustada constantemente em 34 ° c não está disponível, ajuste um acima de 1 dia antes da experimentação.
3. Prepare e rotule a quantidade apropriada de lâminas de vidro da microscopia. Desenhe um anel de ~ 1 cm de diâmetro com uma caneta de graxa e deixe a graxa secar.
4. Prepare 1x Krebs buffer, pH 7,8 (tabela 1). Coloque dois tubos cônicos com 50 mL de 1x Krebs a 34 ° c a pré-aquecer para as etapas 2.5 − 2.8. Guarde o resto do 1x Krebs a 4 ° c ou no gelo.
5. Prepare soluções de BSA. Prepare primeiramente 25 mL da solução de BSA de 10% (w/v) em Krebs dissolvendo 2,5 g de BSA no amortecedor de 1x Krebs a um volume final de 25 mL. Diluir a solução de 10% BSA com 1x Krebs buffer para obter diferentes concentrações de BSA (tabela 2). Mantenha todas as soluções de BSA a 4 ° c.
   Nota: Prepare as soluções no mesmo dia do procedimento e armazene a 4 ° c até o uso.
6. Prepare as enzimas de digestão pesando a quantidade correta de tripsina e colagenase para 50 mL de tubos cônicos (tabela 3).

2. dissecção animal e preparação da suspensão de células germinativas

Nota: Isso leva aproximadamente 1 h para ser concluído.

1. Sacrifique um rato masculino adulto (envelhecido 7 semanas ou mais velho, testis que pesa 80 − 120 MGS dependendo da tensão e da idade) através da deslocação cervical ou do Asphyxiation do CO₂ .
2. Pulverize o abdômen ventral do rato com 70% de etanol. Abra a cavidade abdominopélvica usando tesouras, fazendo uma abertura em forma de V.
3. Puxando na almofada gorda epididimal com fórceps, localize os testículos e retire-os com tesouras. Evite perturbar a tunica albuginea. Coloque os testículos em um prato de Petri de 6 cm contendo 1x Krebs.
4. Decapsulate os testículos e rejeite o albuginea do Tunica. Dispersar ligeiramente os túbulos seminíferos delicadamente provocando-os distante com fórceps.
5. Use fórceps para transferir os túbulos seminíferos em um tubo cônico de 50 mL contendo 2 mL de solução de colagenase preparada na hora (tabela 3).
6. Incubar os túbulos no banho de água de 37 ° c durante 3 min. agitar suavemente balançando o tubo.
   Nota: Os túbulos de flutuação livremente devem ocorrer dentro de 3 minutos devido à remoção de pilhas intersticiais. A temperatura fisiológica para células testiculares é 34 ° c; Conseqüentemente, os digestões longos são feitos geralmente nesta temperatura. No entanto, a digestão curta de 3 min pode ser conduzida a 37 ° c (temperatura recomendada pelo fabricante). Observe que, se 34 ° c for usado, o tempo de digestão deve ser reotimizado.
7. Adicionar pelo menos 40 mL de quente 1x Krebs e permitir que os túbulos sedimento (~ 1 min) à temperatura ambiente (RT). Retire o sobrenadante e repita 1x.
8. Adicionar 25 mL de solução de tripsina preparada na hora (tabela 3), colocar o tubo no rotor do tubo no interior da incubadora de 34 ° c e incubar durante 15 − 20 min (~ 15 rpm). Esporadicamente verificar o estado dos túbulos. Uma vez que a solução se torne nublado e apenas pequenos pedaços de túbulos permanecem, coloque o tubo no gelo e prossiga imediatamente para o próximo passo.
   Nota: Para evitar a digestão excessiva e a lise celular, mova-se rapidamente para as seguintes etapas de lavagem. Alguns protocolos incluem a desativação da tripsina pelo soro fetal bovino (FBS). Neste protocolo, o tratamento de FBS é omitido, e preferivelmente, o tripsina é removido pela centrifugação imediata e por lava subseqüentes com o frio 1x Krebs.
9. Filtre a solução através de um filtro de células de 40 μm em um novo tubo cônico 50 mL no gelo.
10. Centrifugue 600 x g por 5 min a 4 ° c para pellet as células.
    Nota: A centrifugação com demasiado forte de uma força pode prejudicar as pilhas.
11. Remova o sobrenadante, derramando-o cuidadosamente.
12. Bata a pelota da pilha para Ressuspender as pilhas no restante de 1x Krebs.
13. Adicionar pelo menos 40 mL de frio 1x Krebs para as células ressuscipended.
14. Repita as etapas 2,10 e 2,11.
15. Bata o tubo com a pelota da pilha para Ressuspender as pilhas. Adicionar 1 mL de 0,5% BSA em 1x Krebs e com uma ponta de pipeta de corte ressuscitar as células por pipetagem da solução para cima e para baixo. Evite fazer bolhas.
16. Finalmente, adicione 1 − 3 mL de 0,5% de BSA em 1x Krebs de modo que o volume final seja ~ 3 mL. Filtre a suspensão da célula germinativa através de um filtro de células de 40 μm e prossiga imediatamente para o carregamento das células no gradiente de BSA.

3. separação de células germinativas através do gradiente de BSA descontínuo

Nota: Esta seção demora aproximadamente 2 h para ser concluída. Comece a preparar o gradiente de BSA descontínuo durante as etapas de lavagem (etapas 2.10 − 2.14) para carregar as células assim que o pré-tratamento estiver pronto.

1. Acomode um tubo de 50 mL verticalmente no gelo para que seja possível ver um lado do tubo. Alternativamente, execute o protocolo em uma sala fria a 4 ° c, caso em que nenhum gelo é necessário.
2. Corte a ponta de uma pipeta serológica de 10 mL a cerca de 5 − 10 mm da ponta para obter uma abertura maior (Figura 1a) e monte-a no controlador da pipeta (Figura 1C).
   Nota: Isso diminuirá a velocidade durante a pipetagem, o que facilita o empilhamento das diferentes soluções de BSA. Alternativamente, use uma pipeta mecânica de 1 mL com um pistão liso e corte as pontas da pipeta com uma abertura de aproximadamente 3 milímetros no diâmetro (Figura 1B).
3. Comece por pipetar 5 mL de solução de 5% de BSA para o fundo do tubo de 50 mL.
4. Lentamente Pipet 5 mL de solução de BSA 4% em cima da solução de 5%. Comece por tocar suavemente a superfície da solução de 5% com a ponta de corte da pipeta e camada as duas soluções, mantendo cuidadosamente o contato com a superfície, garantindo a não permitir que a ponta Pipet para se tornar imerso.
   Nota: Uma linha clara deve ser visível entre as duas camadas no final desta etapa.
5. Repita o passo 3,4 com as outras soluções de BSA obter um gradiente descontínuo de 5% até 1% (Figura 1D).
6. Carregue cuidadosamente a suspensão de uma única célula em cima do gradiente sem perturbar. Deixe as células sedimento através do gradiente para 1,5 h a 4 ° c ou no gelo.

4. coleção de frações enriquecidas da célula germinal

Nota: Esta seção demora aproximadamente 30 min para ser concluída.

1. Monte uma ponta de pipeta de 1 mL numa pipeta mecânica de 1 mL e corte a ponta de modo a que a abertura seja de ~ 3 mm de diâmetro (Figura 1B).
2. Colete cuidadosamente ~ 1 frações mL em tubos separados de 1,5 mL, a partir do topo do gradiente BSA, e armazená-los no gelo. Número de tubos na mesma ordem em que as frações serão coletadas.
   Nota: Neste ponto, deve haver uma série de ~ 28 tubos contendo suspensões celulares. Use uma pipeta mecânica de 1 mL com um pistão liso e corte as pontas da pipeta para minimizar o risco de perturbar o inclinação de BSA.
3. Centrifugue as frações da célula germinal em 600 x g por 10 min a 4 ° c.
4. Cuidado para não perturbar a pelota, descartar a maior parte do sobrenadante e ressuscitará o pellet celular por flicking o tubo. Adicione 1 mL de tampão de 1x Krebs gelado a cada tubo e repita a centrifugação.
   Nota: Repita a etapa de lavagem se BSA interferir com a análise a jusante.
5. Descarte a maior parte do sobrenadante, mas deixe ~ 100 μL após a lavagem final. Ressuscitem o pellet celular com cuidado.
   Nota: Suspender as células cuidadosamente assegura que a amostra retirada desta solução represente todas as células da fração dada. Mantenha as suspensões da pilha no gelo ao preparar os slides.

5. análise de frações celulares

Nota: A análise demora 2 h para ser concluída.

1. Um de cada vez, Pipet 20 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) dentro de cada anel de caneta lubrificante em uma lâmina de microscopia numerada.
2. Adicione imediatamente 2 μL da suspensão da célula ressuspendida da fração correspondente. Repita para cada fração.
   Nota: Durante a preparação de slides, mantenha todas as suspensões celulares no gelo.
3. Seque as lâminas na RT durante 1 h até à noite (O/N).
   Nota: Durante esta etapa, após a tomada de uma amostra de cada fração, as células podem ser processadas para análises a jusante ou armazenamento (seção 6).
4. Enxague as lâminas uma vez com 1X PBS e monte com suporte de montagem com 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (tabela de materiais).
5. Analise as lâminas um microscópio de fluorescência para estimar qual tipo de célula germinal particular é enriquecido em cada fração.
   Nota: Os tipos diferentes da pilha podem ser reconhecidos por sua morfologia nuclear característica visualizada pela mancha de DAPI. Figura 2 A mostra frações representativas enriquecidas em espermátides alongando, espermátides redondos e spermatocytes do paquíteno. O núcleo redondo do spermatid é pequeno (μm de 6 − 7 no diâmetro) e redondo (Figura 2A). Os núcleos redondos do spermatid do rato são caracterizados igualmente por uma única, estrutura redonda do heterocromatina chamada o chromocenter. Núcleos de espermátides alongados apresentam forma alongada típica e tamanho nuclear reduzido devido à condensação da cromatina (Figura 2a). Os núcleos de espermatócitos de pachytene são muito maiores (diâmetro superior A 10 μm) e mais irregulares em forma, com áreas de cromatina densamente embalada distribuídas por toda parte (Figura 2A).
6. Se necessário, realize imunocoloração além da coloração DAPI para suportar o reconhecimento dos diferentes tipos de células.
   1. Neste caso, espalhe 2 μL de suspensão celular com 20 μL de uma solução de fixação (4% de PFA e 0,1% de surfactante não iônico em PBS) dentro de um anel de caneta lubrificante. Depois de secar as lâminas, postfix as células com 4% PFA por 10 min em RT.
   2. Enxague com PBS e, em seguida, Permeabilize com 0,1% de surfactante não iônico em PBS por 5 min. Enxague com PBS e desative qualquer PFA remanescente incubando lâminas em 100 mM NH₄CL por 5 min.
   3. Enxaguar com PBS e proceder a um protocolo de imunofluorescência padrão consistindo de bloqueio e incubações com anticorpos primários específicos e anticorpos secundários rotulados com fluorocromo. Monte as corrediças com o lamínula do Antifade com DAPI (tabela dos materiais) e permita que ajuste para 24 h.
      Nota: Exemplos de marcadores úteis para incubações de anticorpos primários incluem a aglutinina de amendoim (PNA; 1:2000 na solução de bloqueio) que mancha o acrossoma em espermátides redondos e alongadores, anticorpo DDX4 (1:200 em solução de bloqueio) que rotula um único grânulo cytoplasmic em spermatids redondos, e anticorpo do anti-γh2ax (1:100 na solução de obstrução) que reconhece corpos do sexo em spermatocytes do paquíteno. Veja os resultados representativos e a Figura 2C, D para exemplos de análise de imunofluorescência das frações.

6. processando as amostras restantes para armazenamento

Nota: A seção 6 demora aproximadamente 20 min para ser concluída.

1. Uma vez que uma amostra de cada fração foi tomada para uma corrediça da microscopia, adicione 1 mL do gelo-frio 1x Krebs a cada fração e Centrifugue as pilhas para baixo em 600 − 13000 x g por 10 minutos em 4 ° c.
   Nota: Uma centrifugação de baixa velocidade resulta em uma pelota solta, o que torna difícil remover completamente 1x Krebs, enquanto uma centrifugação de alta velocidade pode prejudicar as células. Escolha a velocidade da centrifugação de acordo com exigências específicas do protocolo a jusante.
2. Remova e descarte o sobrenadante e continue com a análise preferencial a jusante.
   Nota: Neste ponto, as células podem ser snap-congelados em nitrogênio líquido e armazenados em-70 ° c. Uma vez familiarizado com esta técnica, é possível continuar com o protocolo de preferência a jusante diretamente, mas é sempre aconselhável tomar uma amostra e garantir a pureza de cada fração. O RNA total pode ser extraído, quantificado, e analisado por métodos tais como a reacção em cadeia reversa do polymerase da transcrição (PCR) e o sequenciamento do RNA. Extratos proteicos totais também podem ser preparados a partir dos quais a imunoprecipitação ou a análise de mancha ocidental podem ser realizadas (Figura 3).

Resultados

O enriquecimento suficiente de um tipo de célula germinativa é geralmente considerado acima de 80%⁶. O protocolo MDR funciona particularmente bem para enriquecer spermatids redondos. Um número elevado de espermátides redondos puros de > 90% pode rotineiramente ser obtido usando esta técnica. As frações óptimas de espermatócitos do paquíteno e de espermátides alongando são enriquecidas a ~ 75% e ~ 80%, respectivamente. Espermátides alongando tendem a ficar em cima do gradiente e são recolhidos com a primeira fração. No exemplo mostrado, a fração 1 continha ~ 80% das espermátides alongadas (Figura 2B). A maioria das espermátides alongadas obtidas com esta técnica tem núcleos condensados, enquanto as espermátides alongando-se não condensada precoce são escassas (Figura 2A). As seguintes frações contêm spermatids redondos enriquecidos. No exemplo, o enriquecimento das espermátides redondas foi superior a 90% nas frações 2, 3 e 4, e o enriquecimento acima de 80% foi observado completamente em sete frações (2 − 8) (Figura 2B). Devido a seu tamanho grande, os espermatócitos do paquíteno sedimento mais rapidamente e são recolhidos por último. No exemplo de purificação, o enriquecimento foi de cerca de 75% nas frações 14 e 15 (Figura 2B).

Enquanto a morfologia nuclear, visualizada pela coloração DAPI, geralmente é suficiente para o reconhecimento das células, a análise de imunofluorescência pode ser realizada para suportar a análise. PNA mancha os acrosomas tornando-se de espermátides redondos e alongando, e a aparência acrossômica pode ser explorada para categorizar mais mais espermátides redondos em etapas 1 − 8 da diferenciação¹⁰. Distinguir espermátides alongados e redondos com coloração de PNA depende das diferenças em sua forma nuclear (Figura 2C, painel esquerdo). O anticorpo anti-DDX4 é um marcador útil para as frações redondas do spermatid desde que visualiza um único grânulo perinuclear de DDX4-positive, o corpo cromatoid (CB), no citoplasma de cada spermatid redondo. Esta coloração CB-específica é fácil de distinguir da mancha cytoplasmic mais extensamente distribuída nos espermatócitos (Figura 2C, painel médio). Os espermatócitos de paquíteno podem ser reconhecidos pelo anticorpo anti-γh2ax que rotula o corpo de sexo nuclear que aparece especificamente na fase de paquíteno da primeira divisão meiótica (Figura 2C, painel direito). Nesta purificação, a mancha de PNA revelou que as frações redondas enriquecidas MDR do spermatid continham uma mistura de espermátides redondos em várias etapas da diferenciação, toda contendo sua estrutura da assinatura, o CB DDX4-positive (Figura 2D, Fração RS). O anti-γh2ax validou ainda mais os espermatócitos do paquíteno do enriquecimento na fração 16 (Figura 2D, fração de PSPC).

A contagem da pilha revelou que o número de pilhas no spermatid redondo e em frações do spermatocyte do paquíteno é adequado para várias análises a jusante. Frações spermatid redondas (5 − 8) cada uma continha cerca de 2,5 x 10⁶ células. Portanto, ao agrupar essas frações, é possível obter mais de 10 milhões células. As frações de espermatócitos de pachytene (14 e 15) geralmente continham um pouco menos de células. Neste isolamento, foram contados cerca de 1,5 − 2,0 x 10⁶ células por fração. A primeira fração continha 0,75 x 10⁶ espermátides alongando.

Como mostrado na Figura 3a, aquantidade total de RNA obtida da maioria das frações variou de 0,5 a 2,5 μg, o que é suficiente para análises de RNA a jusante, como PCR de transcrição reversa, sequenciamento de RNA ou RNA de visualização em um gel. A quantidade de proteína Obtida de cada fração normalmente varia de 20 − 140 μg (Figura 3B), o que é suficiente para várias manchas ocidentais. Os lysates inteiros da pilha foram preparados das frações coletadas, e a análise ocidental do borrão foi executada usando os anticorpos que detectam DDX4, PIWIL1, e PIWIL2, que são todos expressados altamente em espermatócitos do paquíteno e em espermátides redondos assim como o ubiquitously gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH).

Neste protocolo, 10% dos lisados protéicos derivados de frações simples foram suficientes para detectar claramente todas essas proteínas em um padrão de mancha ocidental (Figura 3C). A quantidade de proteína em uma fração também mostrou-se suficiente para a imunoprecipitação usando um anticorpo contra PIWIL1, bem como para a detecção de PIWIL2 coimunoprecipitada (Figura 3D). Além disso, este protocolo foi usado com sucesso para obter frações enriquecidas de espermatócitos do paquíteno e de espermátides redondos do controle e de ratos genetically modificados para aplicações a jusante tais como a transcrição reversa quantitativa PCR¹¹ e sequenciamento de RNA de alta taxa de transferência¹².

Figura 1: preparação de um gradiente de BSA descontínuo. (A) uma ponta de pipeta sorológicos de 5 ml para a preparação do inclinação. (B) uma ponta da pipeta de 1 ml para a preparação do inclinação e da coleção das frações da célula germinal após o sedimentation. (C) o equipamento necessário para a preparação do gradiente. (D) vista lateral do gradiente de densidade de BSA descontínuo de 5% (inferior) para a solução de BSA de 1% (superior); as soluções de BSA de 2% e 4% são de cor azul para melhor visualização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: imagens representativas das frações celulares coletadas e análise de enriquecimento. (A) células testiculares manchadas DAPI. A fileira superior mostra as células testiculares no epitélio seminífero intacto de uma seção de testículo de PFA-fixo, parafina-encaixada (esquerda) ou em suspensão (direita). A linha inferior mostra frações de espermátides alongadas enriquecidas (es), espermátides redondas (RS) ou espermatócitos de paquíteno (PSPC). Barras de escala = 20 μm para a linha superior e 10 μm para entradas da linha inferior. (B) quantificação relativa dos diferentes tipos de células germinativas em cada fração. As células foram contadas manualmente usando o software ImageJ e classificadas em RS, ES, PSpc, células de Sertoli e outras células. Os números de fração e respectivas porcentagens de BSA no gradiente são indicados no eixo x. (C) análise de imunofluorescência de células testiculares. Painel esquerdo: o PNA rotulado com rodamina mancha o acrossoma em ambos es (seta amarela) e RS (seta branca). Painel médio: o anticorpo DDX4 mancha um único grânulo perinuclear no RS, que é fácil distinguir do sinal cytoplasmic mais difuso nos espermatócitos (seta azul). Nenhum sinal DDX4 é detectado no ES (seta laranja). Painel direito: o anticorpo γh2ax reconhece o corpo de sexo nuclear característico presente apenas nos espermatócitos de paquíteno (células γh2ax-negativas marcadas por um asterisco branco). Barras de escala = 10 μm. (D) MDR as frações de células enriquecidas foram rotuladas com PNA (fração RS), DDX4 (fração RS) e anti-γH2AX (fração PSPC) para validar ainda mais o enriquecimento celular em cada fração. Barras de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: análise a jusante após enriquecimento de células MDR. (A) o RNA foi extraído de cada fração após um enriquecimento representativo da pilha de MDR e quantificado. Os números de fração e respectivas porcentagens de BSA no gradiente são indicados no eixo x. (B) as proteínas foram extraídas de cada fração por lise a pelota da pilha na reserva do ensaio da radioimunoprecipitação (Ripa) então quantificada. (C) os extratos da proteína da pilha inteira foram preparados e analisados pelo western blotting usando anticorpos de encontro a DDX4, a PIWIL1, a PIWIL2, e a GAPDH. 10% do lisado foi carregado de cada fração indicada. (D) a imunoprecipitação foi realizada a partir de frações indicadas utilizando PIWIL1 seguida de western blotting com anticorpos PIWIL1 e anti-PIWIL2. A amostra de entrada inclui uma mistura de proteínas lisados de diferentes frações, e a imunoprecipitação de controle (IP) usando IgG de coelho também foi realizada a partir de um lisado misto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: representação esquemática do protocolo MDR e tempo necessário para a conclusão de cada etapa. O material de partida é compor de dois testículos de um rato adulto. O número médio de células e a quantidade de RNA e proteína obtidas de uma fração são indicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Buffer	Reagentes	Preparação	Armazenamento
Tampão de Krebs (10x)	3,26 g KH2po4	Levar para 2 L com H2O, filtrar 0,22 μm e autoclave.	Pode ser armazenado a 4 ° c durante vários meses
	139,5 g NaCl
	5,89 g MgSO4 •7h2O
	50 g dextrose
	3,78 g CAcl2•2h2O
	7,12 g KCl
Tampão de Krebs (1x)	4,24 g NaHCO3	Dissolver NaHCO3 a 100 ml de h2o, adicionar 200 ml de 10x Krebs buffer, e trazer para 2 L com h2o.	Para ser preparado fresco
	200 mL 10x Krebs tampão

Tabela 1: preparação do tampão de Krebs.

Concentração de BSA (w/v)	10% de solução de BSA	1x tampão de Krebs
0,50% de	0,5 mL	9,5 mL
1	1 mL de	de 9 mL
2	2 mL de	8 mL de
3	3 mL de	7 mL de
4	4 mL de	6 mL de
5	5 mL de	5 mL de

Tabela 2: preparação de soluções de BSA.

Solução de digestão	Concentração de trabalho	Reagentes	Preparação
Colagenase	1 mg/mL	Collagenase IV	Pesar 2 mg de colagenase IV a um tubo cônico de 50 ml e adicionar 2 ml de tampão quente de 1x Krebs à direita antes da digestão (passo 2,3).
Tripsina	0,6 mg/mL	Tripsina	Pesar 15 mg de tripsina para um tubo cônico 50 mL, e adicionar 25 mL de tampão quente 1x KREBS e 40 μL de DNase I direito antes da digestão (passo 2,6).
	> 3.2 ku/mL	DNase I

Tabela 3: preparação das enzimas de digestão.

Discussão

É apresentado aqui um protocolo simples e barato para isolar populações enriquecidas de espermátides redondos, de spermatocytes do paquíteno, e de espermátides alongando usando o equipamento de laboratório padrão (vista geral do protocolo mostrado em Figura 4). Embora nenhuma perícia ou maquinaria cara seja exigida, há algumas etapas críticas que devem ser consideradas durante a digestão do tecido, a construção do inclinação, e o carregamento da suspensão da pilha no inclinação.

As células germinativas são liberadas de túbulos seminíferos por duas digestões enzimáticas consecutivas. A primeira digestão com colagenase IV separa os túbulos seminíferos removendo as células intersticiais. Tempo de digestão prolongada pode danificar os túbulos e levar à perda de spermatids, como (se liberado dos túbulos durante este passo) eles serão descartados nos seguintes passos. O segundo passo de digestão com tripsina libera células germinais de túbulos seminíferos. Pode haver lise celular ocasional e tipicamente alguns grupos formam devido ao DNA genómico liberado. Exceder a duração sugerida ou a temperatura da digestão não é aconselhável, pois isso pode levar à viabilidade mais pobre, ao aumento da lise celular e à aglomeração. Se a aglomeração leve ocorrer, os grupos podem ser ignorados. No entanto, em casos de aglomeração significativa e perda de células, o tempo de digestão ou concentração de tripsina deve ser reduzido. Também deve ser observado que a atividade enzimática da tripsina pode variar entre lotes e durante períodos prolongados de armazenamento. A quantidade de DNase I durante a digestão de tripsina também pode ser aumentada para remover os aglomerados em excesso, mas isso deve ser considerado uma solução secundária. É importante obter uma suspensão homogénea de uma única célula no final do pré-tratamento, uma vez que as células aglomeradas vão sedimento mais rápido, contaminando as frações e interrompendo o gradiente.

A construção do gradiente pode exigir alguma prática. Se houver desconforto usando uma ponteira de pipeta de 5 mL com um controlador de pipeta, recomenda-se usar uma pipeta mecânica normal de 1 mL com um pistão liso e depois cortar as pontas da pipeta para uma abertura de ~ 3 mm de diâmetro (Figura 1B). Uma abertura mais larga e o carregamento liso das soluções de BSA diminuirão o risco de misturar o inclinação. Quando devidamente preparados, é possível ver os limites entre as soluções de BSA adjacentes devido aos seus diferentes índices de refração. O gradiente deve ser produzido diretamente antes do uso. Também deve ser notado que qualquer pequena agitação ou vibração pode perturbar o gradiente, de modo que o gradiente deve ser definido em um ambiente onde ele não será perturbado.

O carregamento da suspensão celular para o gradiente deve ser feito com muito cuidado. Após o carregamento, a suspensão celular deve permanecer em cima do gradiente, a partir do qual as células vão lentamente começar a sedimento através da primeira camada. Se grandes grupos de células são vistos movendo-se rapidamente através do gradiente, as células provavelmente não foram ressuscitadas com cuidado ou há excesso de aglomeração. Se as células não permanecer na parte superior do gradiente de BSA descontínua após o carregamento, mas imediatamente afundar entre as camadas de BSA de 1% e 2% (etapa 3,6), a suspensão da célula é provavelmente muito densa. Este protocolo foi otimizado usando dois testículos de um rato adulto (80-120 mg/testis) como material de partida; embora, as isolações bem sucedidas usando quantidades reduzidas de material de partida estiveram executadas. Para upscale o protocolo e obter mais enriquecido células germinativas de maior número de testículos, mais 50 mL tubos com o gradiente deve ser introduzido.

O protocolo foi inicialmente desenvolvido e otimizado para enriquecer espermatóides redondos haploides de testículos de ratos adultos, e a pureza das frações espermátides redondas é esperada para ser mais de 90%. Além do que as frações redondas altamente puras do spermatid, os resultados satisfatórios para o enriquecimento de espermatócitos do paquíteno e de espermátides alongando foram obtidos. Deve-se notar que os eritrócitos podem contaminar as frações espermátidas alongadas, e outras medidas para eliminá-las devem ser tomadas se a sua presença for esperada para interferir com as análises a jusante. Nós não pudemos enriquecer outros tipos da pilha tais como pilhas meiótico pilhas ou adiantadas (antes da fase do paquíteno) dos ratos adultos usando o protocolo de MDR.

Adicionalmente, o sedimentação de Sta-Put foi usado com sucesso para obter frações enriquecidas de espermatogônias ou de preleptotene, de leptotene, e de espermatócitos do zygote usando os testículos juvenis coletados em pontos de tempo dados após o nascimento¹³. Essa abordagem aproveita a aparência desses tipos de células durante a primeira onda de espermatogênese. A mesma abordagem pode provavelmente ser aplicada ao enriquecimento de MDR, mas ainda não foi testada na prática. Outro método que é uma boa opção para a purificação de células pré-meioticas e meióticas em estágios específicos de diferenciação é FACS, que tem a vantagem importante de permitir o isolamento de tipos de células específicas com base na presença de marcadores específicos^{14 ,15,16,17}.

Globalmente, a sedimentação da velocidade de MDR serve como um método útil para o enriquecimento de células germinativas. Embora este método não seja superior a outros métodos bem estabelecidos em termos de pureza ou quantidade de células enriquecidas, suas vantagens claras são sua simplicidade e baixos custos de set-up. Isso, juntamente com a baixa quantidade de materiais iniciais exigidos, tornam este protocolo uma ótima opção para pesquisadores no campo da espermatogênese e aqueles em outros campos que não desejam investir em hardware especializado ou grandes grupos de animais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4% Paraformaldeído	Preferência do pesquisador
AlexaFluor488 burro anti-coelho IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
AlexaFluor647 burro anti-rato IgG	Thermo Fisher Scientific	A-31571
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A9647
CaCl2· 2H2O	Preferência do pesquisador
Colagenase IV	Sigma	C5138
Coquetel completo de inibidores de protease	Anticorpo Roche	11836145001
DDX4	Abcam	ab13840
Dextrose	Preferência do pesquisador
DNase I	Worthington	LS006355
GAPDH	HyTest	5G4
IgG anti-rato ligado a HRP GE	Healthcare Life Sciences	NA931
IgG anti-coelho ligado a HRP	GE Healthcare Life Sciences	NA934
KCl	Preferência do pesquisador
KH2PO4	Preferência do pesquisador
MgSO4· 7H2O	Preferência do pesquisador
NaCl	Preferência do pesquisador
NaHCO3	Preferência do pesquisador
NH4Cl	Preferência do pesquisador
Pierce Kit de ensaio de proteína BCA	Life Technologies	23227
	Tecnologia de sinalização celular	G82
PIWIL2, clone 13E-3	Millipore	MABE363
Prolongar Mountant Antidafe de diamante com DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36962	para imunocolorações Alexa Fluor
Neomarcadores	IgG de coelho	NC-100-P
Aglutinina de amendoim marcada com rodamina (PNA)	Vector Laboratories	RL-1072
Tampão			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% NP-40, 0,5% p/v desoxicolato de sódio, 0,05% p/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x coquetel inibidor de protease, 0,2 mM PMSF e 1 mM DTT
TRIsure	Bioline	BIO-38033
Triton X-100	Preferência do pesquisador		surfactante não iônico
Trypsin	Worthington	LS003703
Meio de Montagem Antifade VECTASHIELD com DAPI	Vector Laboratories	H-1200	para análise padrão DAPI de frações celulares
&gama; Anticorpo H2AX	Millipore	05-636
0,22 µ filtro m	Sartorius	Sartolab BT 180C6	ou equivalente
1 mL pipeta mecânica	Preferência do pesquisador
Tubos de 1,5 mL ou 2 mL	Preferência do pesquisador
40 µ peneiras de células m para tubos de 50 mL	Greiner Bio-One	542040	ou filtro de células equivalente
Pipetas sorológicas de 5 mL	Sarstedt	86.1254.001	ou tubos
cônicos equivalentes de 50 mL	Preferência do pesquisador
Placas de Petri de 6 cm	Preferência do pesquisador
Incubadora de cultura de células	Preferência do pesquisador
Centrífuga para tubos de 50 mL	Preferência do pesquisador
Caneta de graxa para lâminas de vidro de microscopia	Preferência do pesquisador
HulaMixer Misturador de amostras	Thermo Fisher Scientific	15920D	ou rotador de células equivalente
Fóruns de microdissecção	Preferência do pesquisador
Tesoura de microdissecção	Preferência do pesquisador
Microscopia lâminas de vidro e lamínulas	Preferência do pesquisador
Nanodrop 1000	Thermo Scientific
Pipetboy Acu 2	Integra	155 000	ou controlador de pipeta equivalente
Centrífuga refrigerada para tubos de 1,5 mL	Preferência do pesquisador
Dicas para pipeta mecânica de 1 mL	Preferência do pesquisador
Banho-maria	Preferência do pesquisador
Microscópio de fluorescência de campo amplo	Preferência do pesquisador