Este artigo descreve um método para culminar e analisar os crescimentos de células epiteliais parieais glomerulares de glomeruli encapsulado isolados do rim do rato. Este método pode ser usado para estudar caminhos envolvidos na proliferação e migração de células epiteliais parietal.
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Artigo de método
Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A ativação da célula epitelial parietal (PEC) é um dos fatores-chave envolvidos no desenvolvimento e progressão da glomerulosclerose. A inibição de vias envolvidas na ativação de células epiteliais parietal pode, portanto, ser uma ferramenta para atenuar a progressão de doenças glomerulares. Este artigo descreve um método para cultivar e analisar o crescimento das células epiteliais parietal do glomeruli encapsulado isolado do rim do rato. Após dissecar rins isolados de camundongos, o tecido é picado, e glomeruli são isolados por peneira. Glomeruli encapsulado são coletados, e glomeruli único são cultivados por 6 dias para obter crescimento glomerular de células epiteliais parietal. Durante esse período, a proliferação e migração de células epiteliais parietal pode ser analisada determinando o número celular ou a área superficial das células em crescimento. Este ensaio pode, portanto, ser usado como uma ferramenta para estudar os efeitos de uma expressão genética alterada em camundongos transgênicos ou nocautes ou os efeitos das condições culturais nas características e sinalização das células epiteliais parietal. Utilizando este método, podem ser estudadas caminhos importantes envolvidos no processo de ativação de células epiteliais parietal e, consequentemente, na glomerulosclerose.
Introdução
As doenças glomerulares são um importante grupo de distúrbios renais e representam uma das principais causas da doença renal em estágio terminal (ESRD). Infelizmente, as opções específicas de tratamento são limitadas e a progressão para a ESRD é inevitável. As doenças glomerulares são definidas pela presença de lesões glomerulares e podem ser agrupadas em doenças inflamatórias e não inflamatórias. Embora o insulto inicial seja diferente, estudos recentes têm demonstrado que um mecanismo celular comum leva à hiperplasia epitelial glomerular e, em últimainstância,à glomerulosclerose em todas as doenças glomerulares, independentemente da causa básica
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade Radboud Nijmegen.
NOTA: Ratos selvagens não tratados e saudáveis (TC) (n = 4) e camundongos cd44-/- (n = 4) foram sacrificados aos 12-16 semanas. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas. Todos os ratos estavam no fundo C57Bl/6.
1. Dissecção do rim do rato
- Sacrificar camundongos saudáveis ou camundongos geneticamente alterados por luxação cervical.
- Dissecar os rins inteiros do rato diretamente depois de sacrificar os ratos. Para isso, realize uma laparotomia medi....
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Resultados
Um diagrama sistemático do método para realizar o ensaio glomerular de crescimento é mostrado na Figura 1. A Figura 2A-D mostra crescimentos glomerulares de glomeruli encapsulado em diferentes pontos de tempo observados usando microscopia leve. Os crescimentos são mostrados nos dias 2, 4 e 6 (Figura 2B-D) na cultura após o isolamento glomerulus do rim do rato. Para v.......
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Discussão
Usando o protocolo descrito neste artigo, pode-se usar glomeruli encapsulado único para avaliar a proliferação de células epiteliais parietal, que é uma consequência da ativação de células epiteliais parietal. Este modelo ex vivo nos permitirá estudar detalhadamente as vias moleculares, que estão envolvidas na ativação de células epiteliais parietal. O método descrito baseia-se no simples conceito de dissecção renal e peneira para isolar e cultura encapsulada glomeruli e comparar a proliferação e/ou migração de células e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela Dutch Kidney Foundation (grant 14A3D104) e pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (bolsa NWO VIDI: 016.156.363).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de células de 24 poços | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Marcador de células endoteliais (concentração usada 1:200) | |
| anti-rato de galinha Alexa 647 | Thermo Fisher | ( concentração usada 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Meio de montagem contendo DAPI | |
| Microscópio digital de luz invertida | Westburg, EVOS fl microscópio | ||
| burro-anti-cabra Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentração usada 1:200) | |
| burro-anti-coelho Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentração usada 1:200) | |
| Meio de Eagle modificado de Dulbecco | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Kit de cotas simples | Lonza | contendo hidrocortisona, hEGF, GA-1000, FBS e BBE | |
| Soro fetal bovino | Lonza | ||
| Soro fetal de bezerro | Lonza | ||
| Microscópio fluorescente | Leica Microsystems GmbH | ||
| cabra-anti-sinaptopodina | Santa Cruz | Marcador de podócitos (concentração usada 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| placa de Petri | Sarstedt | tamanho 100 | |
| coelho-anti-claudina1 | Abcam | Marcador de células epiteliais parietais (concentração usada 1:100) | |
| coelho-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, EUA | gentilmente fornecido pelo Dr. E. Gelman, Marcador | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Marcador de células epiteliais parietais (concentração usada 1:200) | |
| bisturi | Dahlhausen | tamanho 10 | |
| Peneiras | Endecotts Ltd | tamanho 300 µ m, 75 e micro; m, 53 µ m, | |
| BD Plastipak | tamanho: 20 ml | ||
| Microplacas de Ultra-Baixo Anexo | Placas de 6 poços | Corning Costar |
Referências
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al.
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Reimpressões e permissões
