Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal

As doenças glomerulares são um importante grupo de distúrbios renais e representam uma das principais causas da doença renal em estágio terminal (ESRD). Infelizmente, as opções específicas de tratamento são limitadas e a progressão para a ESRD é inevitável. As doenças glomerulares são definidas pela presença de lesões glomerulares e podem ser agrupadas em doenças inflamatórias e não inflamatórias. Embora o insulto inicial seja diferente, estudos recentes têm demonstrado que um mecanismo celular comum leva à hiperplasia epitelial glomerular e, em última^instância,à glomerulosclerose em todas as doenças glomerulares, independentemente da causa básica^1,,2,,3,⁴.

Especificamente, foi demonstrado que as lesões glomeruloscleróticas são compostas principalmente de células epiteliais parietal ativadas^5,6. Sob condições fisiológicas, as células epiteliais parietal são células epiteliais quiescentes planas que revestem a cápsula do Bowman do glomerulus. No entanto, qualquer lesão glomerular devido a mutações genéticas (por exemplo, citopatias específicas podocyte ou mitocondrial), inflamação ou hiperfiltração (por exemplo, causada pela redução da massa renal, hipertensão, obesidade ou mellitus diabético) pode desencadear a ativação de células epiteliais parietal. Células epiteliais parietal ativadas proliferam e depositam matriz extracelular que resulta na formação de crescentes celulares ou lesões escleróticas^5,,7,,8. A progressão desses processos resulta na perda da função renal⁹. Portanto, a ativação de células epiteliais parietal é um fator-chave no desenvolvimento e progressão da glomerulosclerose tanto inflamatória quanto não inflamatória^{glomerular 1,,2,,3,,4,,10}.

Os processos moleculares que mediam a ativação de células epiteliais parietal ainda são amplamente desconhecidos. Estudos recentes mostram que as células epiteliais parietal ativadas de novo expressAM CD44, um receptor que é importante para a ativação de diferentes caminhos envolvidos na proliferação e migração celular. Além disso, a inibição do CD44 mostrou-se inibir a ativação de células epiteliais parietal e atenuar a progressão da formação crescente e glomerulosclerose em modelos animais de doenças inflamatórias e glomerulares não inflamatórias^11,,12.

Como a ativação de células epiteliais parietal é um ator-chave para o desenvolvimento da glomerulosclerose e formação crescente, a inibição dessas células poderia retardar a progressão de doenças glomerulares. A elucidação das vias moleculares que conduzem a ativação epitelial parietal pode levar ao desenvolvimento de intervenções terapêuticas específicas que atenuam a formação das lesões hiperplásticas e glomeruloscleróticas na doença glomerular.

Em modelos animais experimentais, é frequentemente difícil fornecer evidências para um efeito direto de uma expressão genética alterada (modelos de knock-out ou modelos de camundongos transgênicos) ou tratamento medicamentoso nas células epiteliais parietal. Em um camundongo knock-out convencional, as alterações in vivo observadas podem ser explicadas por mudanças diretas nas células epiteliais parietal. No entanto, uma vez que a expressão genética também é alterada em outros tipos de células dentro do mouse, não se pode excluir efeitos indiretos mediados por outros tipos de células. O desenvolvimento de camundongos cre-lox condicional impulsionados por promotores principalmente ativos em células epiteliais parietal forneceu uma solução em alguns casos¹³. No entanto, modelos transgênicos condicionais são complexos e, embora linhas mais condicionais se tornem disponíveis, para muitas das linhas convencionais de camundongos ou transgênicos ainda não há um substituto condicional.

Para estudar os efeitos diretos nas células epiteliais parietal, nosso grupo desenvolveu um ensaio ex vivo usando glomeruli encapsulado único isolado dos rins do rato para medir e analisar a proliferação e migração de células epiteliais parietal. Este método nos permitirá determinar efeitos específicos de células epiteliais parietal e encontrar caminhos responsáveis para a ativação de células epiteliais parietal e testar opções de tratamento para inibir essa ativação.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade Radboud Nijmegen.

NOTA: Ratos selvagens não tratados e saudáveis (TC) (n = 4) e camundongos cd44-/- (n = 4) foram sacrificados aos 12-16 semanas. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas. Todos os ratos estavam no fundo C57Bl/6.

1. Dissecção do rim do rato

1. Sacrificar camundongos saudáveis ou camundongos geneticamente alterados por luxação cervical.
2. Dissecar os rins inteiros do rato diretamente depois de sacrificar os ratos. Para isso, realize uma laparotomia mediana usando tesoura abdominal, cortando a pele e, em seguida, os músculos abdominais. Retire o intestino e coloque-o ao lado do rato.
3. Liberte os rins da conexão do tecido e retire o rim usando fórceps cirúrgicos, cortando a artéria renal, veia renal e ureter com tesoura.
4. Remova as cápsulas renais dos rins segurando o rim com fórceps cirúrgicos e retire a cápsula usando outro par de fórceps.
5. Coloque os rins em uma placa de cultura celular de 6 poços (2 rins/bem) preparado com 2 mL de solução de sal balanceada (HBSS) da Hanks por poço e coloque no gelo.

2. Isolamento de glomeruli do rim de rato

1. Transfira os rins para uma placa de Petri de 100 mm e pique os rins em pequenos pedaços de 1-2 mm usando dois bisturis. Mantenha os pedaços de rim picados molhados usando 1-2 mL de HBSS.
2. Coloque as peças de rim picadas em cima de uma peneira metálica de 300 μm e pressione o rim através da peneira usando um êmbolo de uma seringa de 20 mL. Enxágue repetidamente a peneira com HBSS no meio e colete o fluxo em uma placa de Petri limpa usando um tubo sorológico. Colete também tudo o que resta/gruda na parte inferior da peneira raspando-o com o bisturi e transfira-o para o fluxo coletado (homogeneizar o rim).
3. Enxágüe o rim homogeneizar através de uma peneira de 75 μm com HBSS. Colete o fluxo através e, posteriormente, enxágue este fluxo através de uma peneira de 53 μm. Lave ambas as peneiras usando HBSS para remover todas as estruturas menores.
   NOTA: Nesta etapa, o fluxo-though é apenas enxaguado, mas não pressionado através da peneira de 75 μm e 53 μm. Lavar com HBSS é necessário para remover detritos e estruturas menores nas peneiras. Portanto, normalmente 200-300 mL de HBSS são usados no total.
4. Colete as estruturas/materiais renais que permanecem na peneira de 75 μm e 53 μm lavando a superfície superior das peneiras com o meio de Águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco complementado com soro de bezerro fetal de 20% (SFC) e transfira o material para uma microplaca de apego ultra-baixa de 6 poços.
   NOTA: Para lavar a superfície superior da peneira, enxágue a peneira em posição inclinada (>45°) e colete o material renal na borda da peneira. O material coletado é enriquecido para encapsulamento, bem como glomeruli decapsulado, mostrando apenas alguns fragmentos tubulares. Glomeruli encapsulado são muito pegajosos. Para coletar glomeruli único, por isso é importante evitar que glomeruli adere à superfície de uma placa de Petri ou placa de poço. Para evitar a adesão, use o meio com 20% de FCS e use placas de fixação ultra-baixas para esta etapa.

3. Cultivo de crescimento glomerular

1. Leve a microplacão de fixação ultra-baixa para um microscópio de luz invertida e colete glomeruli encapsulado e/ou decapsulado único com uma pipeta de 20 μL. Evite a tubulação de outras estruturas e detritos. Depois de coletar um único glomerulus na ponta da pipeta, adicione um meio DMEM fresco sem material renal coletado na mesma ponta de pipeta a um volume de 20 μL.
2. Transfira o glomerulus único com o meio DMEM de 20 μL para o centro de um poço de uma placa de cultura celular de 24 poços e incubar por 3h a 37 °C e 5% (v/v) CO₂ para permitir a fixação do glomerulus ao centro do poço. Mova cuidadosamente a placa para evitar flutuar do glomerulus para os pensionistas do poço.
3. Após a incubação de 3h, o glomerulus é anexado ao centro do poço. Adicione cuidadosamente 500 μL de meio basal endotelial (EBM) complementado com um kit de fator de crescimento contendo hidrocortisona, fator de crescimento endotelial humano, extrato cerebral bovino e sulfato-anfotericina de gentamicina B(Tabela de Materiais) e adicional de 5% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicilina/estreptomicina (caneta/estreptomicina) para cada poço.
4. Cultura o glomeruli único por 6 dias a 37 °C, 5% (v/v) CO₂.
   NOTA: Dentro de 6 dias, forma-se o crescimento composto por células epiteliais parietal. Se se pretende testar os efeitos de compostos ou drogas específicas nas células epiteliais parietais, deve ser adicionado ao meio dentro deste período de seis dias.

4. Análise da proliferação de células epiteliais parietal

1. Analise o crescimento glomerular após 6 dias. Pegue imagens microscópicas usando um microscópio de luz invertida digital.
2. Use um software de análise de imagem (por exemplo, ImageJ/FIJI) para determinar a área da superfície e o diâmetro do crescimento glomerular, e o número de células em crescimento ou glomeruli superando.
   1. Para determinar a área superficial do crescimento glomerular, abra o tif. arquivo do crescimento glomerular com barra de escala em ImageJ. Desenhe uma linha reta na barra de escala e determine a distância em pixels clicando em analisar e medir (por exemplo, 1 mm = 460 pixels).
   2. Determine a escala clicando em analisar,definir escala e digitar a distância conhecida em pixel (por exemplo, 460), digitar também a distância conhecida (por exemplo, 1) e a unidade de comprimento (por exemplo, 1 mm). Clique em ok.
   3. Determine quais resultados aparecerão na tabela de resultados clicando em analisar e, em seguida, definir medidas. Para determinar a área de superfície do crescimento glomerular, ative a área de opções e o rótulo do display. Clique em ok.
   4. Para determinar a área superficial do crescimento glomerular, desenhe uma seleção à mão livre em torno do crescimento glomerular. Clique em analisar e, em seguida, meça, uma tabela de resultado aparecerá no ImageJ mostrando a área de superfície de crescimento na escala determinada anteriormente (ver etapa 4.4, por exemplo, mm²).

5. Caracterização do crescimento da célula glomerular

NOTA: Para avaliar a composição celular do crescimento, a coloração da imunofluorescência para marcadores específicos de células é realizada nos crescimentos glomerulares em t = 6 dias.

1. Remova cuidadosamente o meio e lave suavemente o glomeruli duas vezes usando soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
2. Fixar por 10 minutos à temperatura ambiente usando 2% (p/v) paraformaldeído (PFA) suplementado com 4% (w/v) sacarose em PBS e lavar cuidadosamente 2x usando PBS.
3. Incubar com o anticorpo primário com concentração adequada(Tabela de Materiais) diluído em pbs-ovine serum albumin (BSA) 1% (v/v) para 1 h em temperatura ambiente.
4. Remova a solução de anticorpos e lave cuidadosamente 3x com PBS.
5. Incubar com anticorpo secundário(Tabela de Materiais) diluído em PBS-BSA 1% (v/v) no escuro por 45 min a temperatura ambiente.
6. Lave cuidadosamente 3x com PBS e monte usando 1-2 gotas de meio de montagem aquosa com 4′,6-diamidino-2-fenilômado (DAPI) para visualizar núcleos e cobrir o poço com um deslizamento de cobertura redonda.
7. Pegue imagens microscópicas usando um microscópio fluorescente.

Um diagrama sistemático do método para realizar o ensaio glomerular de crescimento é mostrado na Figura 1. A Figura 2A-D mostra crescimentos glomerulares de glomeruli encapsulado em diferentes pontos de tempo observados usando microscopia leve. Os crescimentos são mostrados nos dias 2, 4 e 6 (Figura 2B-D) na cultura após o isolamento glomerulus do rim do rato. Para validar que as células de crescimento são células epiteliais parietal, glomeruli descapsulado também foram isolados e cultivados por 6 dias, como mostrado na Figura 2E,F. Glomeruli decapsulado não apresentou crescimento celular durante o período de incubação dentro de 6 dias. Na Figura 3,foi realizada a coloração da imunofluorescência para diferentes marcadores de células epiteliais parietal, marcadores específicos de podocyte, bem como marcadores celulares endoteliais. Os resultados validam que as células que saem de fato são células epiteliais parietal. A Figura 4 mostra o crescimento de glomeruli encapsulado isolado de camundongos cd44-/- vs WT após 6 dias na cultura. Glomeruli isolado do cd44-/- camundongos apresentaram um número reduzido de células em crescimento, bem como uma diminuição da área superficial de crescimento glomerular em comparação com o glomeruli isolado dos camundongos WT, sugerindo um papel importante para o CD44 na ativação de células epiteliais parietal, conforme publicado anteriormente11. Na Figura 5, é dado um exemplo, no qual a área superficial das células epiteliais parietal superagrosas é determinada por meio do ImageJ.

Figura 1: Visão geral esquemática do método para realizar um ensaio glomerular de crescimento para analisar a proliferação de células epiteliais parietal. (1) Os rins são dissecados de camundongos sacrificados e picados em pequenos pedaços. (2) O tecido renal é prensado através da peneira de 300 μm e enxaguado através das peneiras de 75 μm e 53 μm. (3) Glomeruli que permanecem em cima das peneiras são coletados usando FCS médio + 20% (v/v) e são transferidos para uma placa de fixação ultra-baixa. (4) Glomeruli único são coletados usando um microscópio de luz invertida e são transferidos para placas de cultura de 24 poços. (5) Após a incubação a 37 °C, 5% (v/v) CO2 por 6 dias, o crescimento glomerular pode ser analisado usando um microscópio de luz invertida digital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Crescimento glomerular de glomeruli encapsulado isolado de rins dissecados de camundongos WT. O crescimento do glomeruli encapsulado incubado a 37 °C é mostrado em diferentes pontos de tempo: (A) 0 dias,(B) 2 dias,(C) 4 dias e (D) 6 dias. Glomeruli decapsulado também foram isolados e cultivados a 37 °C e imagens microscópicas foram tiradas no(E) dia 0 e(F) dia 6 não mostrando células que superam. Barras de escala: (A,E,F) 200 μm, (B) 400 μm, (C,D) 1000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Células glomerulares superagrosas mostram expressão de marcador de célula epitelial parietal. A coloração da imunofluorescência foi realizada no dia 6 após o isolamento de glomeruli encapsulado único para caracterizar as células epiteliais que se estendem. Células de crescimento manchadas positivas para marcadores de células epiteliais parietal: (A) CD44, (B) SSeCKS, e(C) claudin-1, mas não mostraram expressão de (D) o marcador específico de podocyte ou (E) o marcador específico de células endoteliais CD31, que foram exclusivamente localizados dentro do glomerulus. Barras de escala: (A, B,D,E) 100μm, (C) 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O crescimento glomerular é prejudicado em glomeruli isolado de camundongos cd44 nocauteados. Glomeruli encapsulado foram isolados de rins dissecados de(A) camundongos WT e(B) cd44-/- camundongos. Fotos microscópicas foram tiradas após 6 dias na cultura usando um microscópio de luz invertido digital. O número de células epiteliais pariolais superdimensionantes, bem como a área superficial de crescimento foi aumentado no glomeruli de camundongos WT em comparação com camundongos cd44-/- sugerindo um papel importante para CD44 na ativação de células epiteliais parietal. Barras de escala: 1000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Um exemplo da análise da área superficial do crescimento glomerular como um marcador para a proliferação de células epiteliais parietal usando ImageJ (FIJI). (A) Crescimento glomerular de um glomerulus encapsulado de um rato WT após 6 dias em cultura a 37 °C. (B) Primeiro, a escala é determinada para analisar a área da superfície em mm2. Aqui: 1 mm = 460 pixels. (C) Após a definição da escala, uma linha de seleção é desenhada ao redor da área de crescimento glomerular. (D) Esta área selecionada pode então ser medida (área de superfície neste exemplo = 2.235 mm2). Barras de escala: 1000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.