Este protocolo descreve uma abordagem eficaz de hibridização in situ para detectar os níveis de expressão mRNA e padrões espaciais de genes-alvo em fluido coelomico Sipunculus nudus.
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Artigo de método
In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Neste artigo
Resumo
Resumo
In situ hybridization (ISH) é uma técnica muito informativa para apresentar padrões de distribuição celular de genes específicos (por exemplo, mRNA e ncRNA) em tecidos. O verme sipunculid Sipunculus nudus é um recurso crucial da pesca, pois possui altos valores nutricionais e medicinais. Atualmente, a pesquisa sobre a biologia molecular do Sipunculus nudus ainda está em sua infância. O objetivo deste artigo é desenvolver um método sensível para localizar mRNA específico em fluido coelomico Sipunculus nudus. O protocolo inclui etapas detalhadas do ISH, incluindo tratamento antisense e sense riboprobe com rótulo de digoxigenina, coleta de fluidos coelómicos e preparação de seção, hibridização específica de ribosque, incubação de anticorpos, coloração e tratamentos pós-coloração. Os resultados representativos obtidos a partir de um experimento bem sucedido usando este método são demonstrados. O protocolo deve ser aplicável a outras espécies de Sipuncula também.
Introdução
ISH, usando uma sonda de ácido nucleico rotulado para detectar a seqüência específica de interesse do DNA ou RNA, é um método útil para descrever o padrão de expressão espacial dos genes-alvo em tecidos morfologicamente preservados1,2,3. Normalmente, a seqüência de destino é gerada por reação em cadeia de polimerase (PCR), e então usada como modelo para sintetizar a sonda RNA antisense/sense rotulada com digoxigenina uridina-5'-triphosphate. As amostras são fixas e permeabilizadas antes da incubação com riboprobe. Após a lavagem da sonda em excesso, a hibridização é visualiza....
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Protocolo
O procedimento animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Bem-Estar Animal da Universidade de Huaqiao.
1. Preparação riboprobe
- Design de primer
- Abra o programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copie a seqüência dmrt1 (GenBank: MK182259) na janela de seqüência.
- Definir o comprimento do primer (23-25 bp), a temperatura de fusão (55-60 °C) e o conteúdo G/C (40-60%). Clique em Escolher primers.
NOTA: O tamanho mínimo necessário para a sonda RNA é de aproximadamente 500 bp. As sondas mais longas normalmente têm maior especificidade. - Adicione a seqüênci....
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Resultados
Um resumo das etapas envolvidas no ISH é ilustrado na Figura 1. As ribofs de sentido antisentido e correspondente para dmrt1 foram sintetizadas a partir de produtos PCR amplificados a partir do fluido coelómico cDNAs. A autenticidade dos produtos PCR foi verificada por sequenciamento direto. As ribosques foram sintetizadas usando polimerases De acordo com os protocolos do fabricante e um relatório anterior4 com algumas pequenas modificações. Os sinais represe.......
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Discussão
Estudos anteriores mostraram que o ISH é adequado para detectar múltiplas rnas alvo16,,17,18. Neste protocolo, descrevemos um método ISH de alta resolução para detectar o mRNA em fluido coelómico e enfatizar as condições de hibridização otimizadas em Nudus Sipunculus. Os sinais óbvios de dmrt1 que observamos demonstraram a aplicação bem sucedida deste protocolo na detecção da expressão genética (
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Jovens Cientistas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant nº 31801034), da Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (2016J01161), do Fundo de Pesquisa Científica da Universidade huaqiao (15BS306) e do Fundo Inovador de Pós-Graduação em Pesquisa Científica da Universidade de Huaqiao.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenina-AP Fragmentos Fab | Roche | 11093274910 Kit de | |
| desenvolvimento de cor de fosfatase alcalina BCIP / NBT | Beyotime | C3206 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma | B2064 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5415R | |
| Ácido | cítricoReagente Químico Fornecedor:Sinopharm Co. | 5949-29-1 | |
| reagente químico trissódico | Co. de Sinopharm | 03/04/6132 | |
| Lamínulas | Beyotime | FCGF60 | |
| Formamida deionizada | Amresco | 07/12/1975 | |
| Pirocarbonato de dietila, DEPC | Sigma | D5758 | Substância nociva |
| Digoxigenina (DIG) Mistura de marcação de RNA | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, | Invitrogen | RNase 18047019 | |
| Imagem | |||
| 64-17-5 | |||
| Gyy-6C do instrumento de Omega | |||
| extração | |||
| 56-81-5 | |||
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparina | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Reagente Químico Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Reagent Químico Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| ácido maleico | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Metanol | Sinopharm Reagente Químico Co. | 67-56-1 | substância nociva |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Reagent Chemical Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Reagent Químico Co. | 1310-73-2 | Filme de |
| parafina | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldeído, PFA | Sigma | 158127 | substância nociva |
| PCR Instrumento | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipeta | Eppendorf | plus G | |
| Poli-D-lisina tratada lâminas de microscópio | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | ||
| livre de RNase | SRE0005 HyClone | SH30538. 02 | |
| Inibidor de RNase | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus Soro | |||
| ovelha | Beyotime | C0265 | |
| Frasco de coloração de slides | Beyotime | FG010 | |
| Caixa de armazenamento de slides | Beyotime | FBX011 | |
| Tesoura autoclavada pequena | Shuanglu | sku_8330 | |
| Espectrofotômetros | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polimerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polimerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Banho-maria | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
Referências
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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Reimpressões e permissões
