Este protocolo descreve uma abordagem eficaz de hibridização in situ para detectar os níveis de expressão mRNA e padrões espaciais de genes-alvo em fluido coelomico Sipunculus nudus.
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Artigo de método
In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Neste artigo
Resumo
Resumo
In situ hybridization (ISH) é uma técnica muito informativa para apresentar padrões de distribuição celular de genes específicos (por exemplo, mRNA e ncRNA) em tecidos. O verme sipunculid Sipunculus nudus é um recurso crucial da pesca, pois possui altos valores nutricionais e medicinais. Atualmente, a pesquisa sobre a biologia molecular do Sipunculus nudus ainda está em sua infância. O objetivo deste artigo é desenvolver um método sensível para localizar mRNA específico em fluido coelomico Sipunculus nudus. O protocolo inclui etapas detalhadas do ISH, incluindo tratamento antisense e sense riboprobe com rótulo de digoxigenina, coleta de fluidos coelómicos e preparação de seção, hibridização específica de ribosque, incubação de anticorpos, coloração e tratamentos pós-coloração. Os resultados representativos obtidos a partir de um experimento bem sucedido usando este método são demonstrados. O protocolo deve ser aplicável a outras espécies de Sipuncula também.
Introdução
ISH, usando uma sonda de ácido nucleico rotulado para detectar a seqüência específica de interesse do DNA ou RNA, é um método útil para descrever o padrão de expressão espacial dos genes-alvo em tecidos morfologicamente preservados1,2,3. Normalmente, a seqüência de destino é gerada por reação em cadeia de polimerase (PCR), e então usada como modelo para sintetizar a sonda RNA antisense/sense rotulada com digoxigenina uridina-5'-triphosphate. As amostras são fixas e permeabilizadas antes da incubação com riboprobe. Após a lavagem da sonda em excesso, a hibridização é visualizada pela imunohistoquímica usando um anticorpo anti-digoxygenin, que é alcalino fosphatase conjugado3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordem Sipunculida: Sipunculidae) é um verme marinho não segmentado, coelomato e bilateralmente simétrico7,8. Sipunculus nudus é uma espécie cosmopolita amplamente distribuída em águas costeiras tropicais e temperadas. É também um importante recurso de pesca marinha no sul da China devido aos seus altos valores nutricionais e medicinais9,10. No entanto, sipunculus nudus em biologia molecular ainda está em sua infância. Para entender completamente o papel biológico dos genes, a investigação de padrões de expressão de genes em uma resolução celular é de grande interesse. No organismo não modelo Sipunculus nudus, o método ISH, que é um método ideal para detectar os padrões de expressão dos genes, ainda não foi estabelecido. Seu fluido coelómico contém vários tipos de células, incluindo granulócitos, células de urna, células vesiculares, células germinativas, eritrócitos,etc. O fator de transcrição relacionado ao sexo duplo/mab-3 -1 (dmrt1), usado como gene representativo neste método, é um regulador transcricional altamente conservado de determinação e diferenciação sexual na maioria das espécies que variam de invertebrados a mamíferos12,13. Em uma variedade de espécies (ou seja, porgy preto, etc.) 14, dmrt1 foi expresso nas células sertoli, em torno das células germinais, cuja função é semelhante às células trophoblastas de Sipunculus nudus. Portanto, nós imaginamos que dmrt1 de Sipunculus nudus é expresso em células trophoblast as espermatozeugmata, e o resultado do método ISH confirmou claramente a hipótese.
Este protocolo pela primeira vez descreve ish, com sondas antisense/sense mRNA rotuladas de digoxigenina, para determinar padrões de expressão mRNA em sua mancha de fluido coelómico. As condições de reação ideais são fornecidas, que permitem uma visualização muito sensível da expressão mRNA em alta resolução. O método ISH desenvolvido poderia ser potencialmente aplicado em mais espécies sipunculida além de Sipunculus nudus.
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Protocolo
O procedimento animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Bem-Estar Animal da Universidade de Huaqiao.
1. Preparação riboprobe
- Design de primer
- Abra o programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copie a seqüência dmrt1 (GenBank: MK182259) na janela de seqüência.
- Definir o comprimento do primer (23-25 bp), a temperatura de fusão (55-60 °C) e o conteúdo G/C (40-60%). Clique em Escolher primers.
NOTA: O tamanho mínimo necessário para a sonda RNA é de aproximadamente 500 bp. As sondas mais longas normalmente têm maior especificidade. - Adicione a seqüência de promotor de polimerase T7 RNA (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) a um dos primers selecionados. As seqüências de primer dmrt1 para ISH são mostradas na Tabela 1.
NOTA: Para sondas de sentido, o promotor de polimerase T7 RNA está localizado na extremidade de 5' dos primers dianteiros. Para sondas antisense, o promotor de polimerase T7 RNA está localizado na extremidade de 5'-end dos primers reversos.
- Amplificação pcr
- Coloque os tubos de microfuge no gelo e prepare a seguinte mistura de reação (para uma reação de 50 μL): 1x mistura de polimerase de DNA Taq, 1 μg de cDNA (que é preparado a partir de 100 μL de fluido coelómico), 1 μM primer dianteiro, primer reverso de 1 μM e água sem nuclease.
- Misture a reação pcr por pipetting e centrífuga brevemente.
- Coloque o tubo de reação em um ciclador térmico e execute o PCR utilizando as seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C por 2 min seguido de 36 ciclos de desnaturação a 95 °C para 30 s, recozimento a 55-60 °C para 30 s, extensão a 72 °C para 30 s e uma extensão final a 72 °C para 7 min.
NOTA: A temperatura de recozimento deve ser otimizada de acordo com os primers.
- Purificação e verificação de produtos PCR
- Carregue a mistura de 50 μL de PCR diretamente em um gel de agarose de 1%. Execute o gel de agarose em 150-180 V por 10 min em 0,5x TBE. Isole os fragmentos específicos de DNA do gel de agarose de 1%.
NOTA: O DNA deve aparecer como uma única banda e não como uma mancha. - Purifique os fragmentos de DNA usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante. Quantifique os produtos purificados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm.
- Verifique a autenticidade dos produtos PCR por seqüenciamento.
NOTA: (Ponto de pausa) Os produtos PCR purificados podem ser armazenados a -20 °C por vários meses.
- Carregue a mistura de 50 μL de PCR diretamente em um gel de agarose de 1%. Execute o gel de agarose em 150-180 V por 10 min em 0,5x TBE. Isole os fragmentos específicos de DNA do gel de agarose de 1%.
- Síntese de ribosque
- Coloque os tubos de microfusão sem RNase no gelo e adicione o seguinte ao tubo de microfuge (para uma reação de 10 μL): 1x Mistura de Rotulagem de RNA digoxygenin, tampão de transcrição 1x, 0,5 μL de inibidores de RNase, 1 μL de polimerases De RNA T7, 1 μg de produto PCR e água livre de RNase. Misture a reação por pipetting e centrífuga brevemente. Incubar por 2h a 37 °C.
- Adicione 2 μL de DNase I. Misture a reação por pipetting e centrífuga brevemente. Incubar por 15 min a 37 °C.
- Adicionar 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8.0). Misture a reação por pipetting e centrífuga brevemente.
- Adicione 2,5 μL de 4 M LiCl e 75 μL de etanol pré-resfriado à reação acima. Misture bem. Deixe por 30 min a -70 °C.
- Centrífuga a 12.000 x g por 10 min a 4 °C. Decante o etanol. Adicione 1 mL de etanol pré-resfriado (v/v) e lave a precipitação misturando suavemente.
- Centrífuga a 12.000 x g por 5 min a 4 °C. Decante os 70% de etanol e seque a precipitação brevemente perto de uma lâmpada de álcool. Dissolva a precipitação adicionando 30 μL de água livre de RNase e misture suavemente.
- Carregue 2 μL de RNA sintetizado em um gel de agarose de 1%. Execute o gel de agarose a 180 V por 5-10 min em 0,5x TBE. Meça a concentração do RNA rotulado usando um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 260 nm.
- Use tubos de microfusão sem RNase e pontas de filtro para evitar a contaminação do RNase.
NOTA: (Ponto de pausa) As sondas com rótulo de digoxygenin podem ser armazenadas a -70 °C por vários meses.
- Use tubos de microfusão sem RNase e pontas de filtro para evitar a contaminação do RNase.
2. Coleta de fluido sélomico
- Fixe o S. nudus na mesa de dissecção com alfinetes. Abra o corpo do S. nudus com uma pequena tesoura autoclaved. Isole o fluido coelómico com uma pipeta.
- Coletar e transferir 1 mL de fluido coelómico com uma pipeta para lâminas de microscópio tratadas com poli-D. Aplique o fluido coelómico uniformemente com uma ponta de pipeta. Seque o ar das lâminas por 1h a 37 °C.
3. Hibridização in situ
- Dia 1º
- Reidrate as lâminas em um frasco de coloração de slides contendo 100 mL de 1x de pirocarbonato de pirocarbonato de 1x tratado de fosfato tamponado (DEPC-PBS). Reidratar 3 vezes com 1x DEPC-PBS, 5 min por lavagem com agitação suave.
- Permeabilizar a mancha de fluido coelómico por digestão com 10 μg/mL proteinase K à temperatura ambiente por 5 min. Incubar as lâminas em 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 min para parar a digestão. Lave os slides em 1x DEPC-PBS com agitação suave por 5 min 3 vezes.
- Adicione 50 μL de mistura de hibridização (HM) contendo a ribofon de sentido/antisentido nos slides e adicione um deslizamento de tampa.
- Adicione o tampão da caixa molhada na caixa molhada. Coloque os slides na caixa molhada e sele bem com filme de parafina. Hibridização durante a noite (pelo menos 16 horas) a 60 °C.
- Dia 2
- Pré-aqueça o tampão de lavagem a 65 °C. Mergulhe o slide no frasco de coloração de slides contendo o tampão de lavagem e deixe-o em pé até que a tampa deslize automaticamente. Leva cerca de 5 min.
- Lave 2 vezes com tampão de lavagem a 65 °C, 30 min por lavagem com agitação suave. Lave 2 vezes com citrato de sódio salino de 0,2x (SSC) a 65 °C, 30 min por lavagem com agitação suave. Lave 2 vezes com tampão de ácido maleico contendo Tween 20 (MABT) à temperatura ambiente, 30 min por lavagem com agitação suave.
- Incubar os slides à temperatura ambiente por 3-4 h no tampão de bloqueio. Incubar os slides em 1 mL anti-digoxigenina-AP Solução fab diluída a 1/5000 com o tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite.
- Dia 3.
- Remova a solução de anticorpos e lave os slides brevemente em MABT. Lave 4 vezes com MABT em temperatura ambiente, 25 min por lavagem com agitação suave.
- Incubar os slides com tampão de fosfatase alcalina à temperatura ambiente 3 vezes, 5 min por lavagem. Remova o tampão de fosfatase alcalina e adicione 1 mL de solução de coloração 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfato (BCIP)/nitro blue tetrazolium (NBT). Mantenha os slides no escuro.
- Observe a reação de cores periodicamente sob um microscópio óptico. Quando a cor estiver totalmente desenvolvida (tempo de reação na faixa de 1-4 h), lave as lâminas 2 vezes com MABT à temperatura ambiente, 5 min por lavagem com agitação suave.
- Lave 2 vezes com solução de parada à temperatura ambiente, 15 min por lavagem com agitação suave. Incubar as lâminas em metanol para remover o excesso de manchas, em temperatura ambiente por 30 min. De acordo com a cor de fundo, a lavagem de metanol pode ser feita 2 ou 3 vezes e o tempo de descoloração pode ser estendido.
- Lave 2 vezes com MABT em temperatura ambiente, 5 min por lavagem com agitação suave. Transfira os slides para um papel filtro fresco. Adicione 50 μL de glicerol. Adicione as tampas e observe microscopicamente.
NOTA: A composição da solução é mostrada na Tabela 2.
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Resultados
Um resumo das etapas envolvidas no ISH é ilustrado na Figura 1. As ribofs de sentido antisentido e correspondente para dmrt1 foram sintetizadas a partir de produtos PCR amplificados a partir do fluido coelómico cDNAs. A autenticidade dos produtos PCR foi verificada por sequenciamento direto. As ribosques foram sintetizadas usando polimerases De acordo com os protocolos do fabricante e um relatório anterior4 com algumas pequenas modificações. Os sinais represe...
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Discussão
Estudos anteriores mostraram que o ISH é adequado para detectar múltiplas rnas alvo16,,17,18. Neste protocolo, descrevemos um método ISH de alta resolução para detectar o mRNA em fluido coelómico e enfatizar as condições de hibridização otimizadas em Nudus Sipunculus. Os sinais óbvios de dmrt1 que observamos demonstraram a aplicação bem sucedida deste protocolo na detecção da expressão genética (
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Jovens Cientistas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant nº 31801034), da Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (2016J01161), do Fundo de Pesquisa Científica da Universidade huaqiao (15BS306) e do Fundo Inovador de Pós-Graduação em Pesquisa Científica da Universidade de Huaqiao.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenina-AP Fragmentos Fab | Roche | 11093274910 Kit de | |
| desenvolvimento de cor de fosfatase alcalina BCIP / NBT | Beyotime | C3206 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma | B2064 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5415R | |
| Ácido | cítricoReagente Químico Fornecedor:Sinopharm Co. | 5949-29-1 | |
| reagente químico trissódico | Co. de Sinopharm | 03/04/6132 | |
| Lamínulas | Beyotime | FCGF60 | |
| Formamida deionizada | Amresco | 07/12/1975 | |
| Pirocarbonato de dietila, DEPC | Sigma | D5758 | Substância nociva |
| Digoxigenina (DIG) Mistura de marcação de RNA | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, | Invitrogen | RNase 18047019 | |
| Imagem | |||
| 64-17-5 | |||
| Gyy-6C do instrumento de Omega | |||
| extração | |||
| 56-81-5 | |||
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparina | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Reagente Químico Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Reagent Químico Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| ácido maleico | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Metanol | Sinopharm Reagente Químico Co. | 67-56-1 | substância nociva |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Reagent Chemical Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Reagent Químico Co. | 1310-73-2 | Filme de |
| parafina | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldeído, PFA | Sigma | 158127 | substância nociva |
| PCR Instrumento | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipeta | Eppendorf | plus G | |
| Poli-D-lisina tratada lâminas de microscópio | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | ||
| livre de RNase | SRE0005 HyClone | SH30538. 02 | |
| Inibidor de RNase | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus Soro | |||
| ovelha | Beyotime | C0265 | |
| Frasco de coloração de slides | Beyotime | FG010 | |
| Caixa de armazenamento de slides | Beyotime | FBX011 | |
| Tesoura autoclavada pequena | Shuanglu | sku_8330 | |
| Espectrofotômetros | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polimerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polimerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Banho-maria | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
Referências
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884(2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41(2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361(1993).
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Reimpressões e permissões
