Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Resumo

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Resumo

O algodão bollworm, Helicoverpa armigera, é uma das pragas mais destrutivas do mundo. Uma combinação de genética molecular, fisiologia, genômica funcional e estudos comportamentais fez de H. armigera uma espécie modelo em Lepidoptera Noctuidae. Para estudar as funções in vivo e interações entre diferentes genes, agrupadas regularmente repetições palindômicas curtas interespaçadas (CRISPR)/ proteína associada 9 (Cas9) é um método conveniente e eficaz usado para a realização de estudos genômicos funcionais. Neste estudo, fornecemos um método sistemático passo a passo para completar o nocaute genético em H. armigera usando o sistema CRISPR/Cas9. O design e a síntese do guia RNA (gRNA) são descritos em detalhes. Em seguida, são resumidas as etapas subsequentes que consistem no projeto de primer específico de genes para criação de RNA guia (gRNA), coleta de embriões, microinjeção, criação de insetos e detecção de mutantes. Finalmente, conselhos e notas de solução de problemas são fornecidos para melhorar a eficiência da edição de genes. Nosso método servirá como referência para a aplicação da edição de genomas CRISPR/Cas9 em H. armigera , bem como outras mariposas lepidopteranas.

Introdução

A aplicação da tecnologia de edição de genomas fornece uma ferramenta eficiente para alcançar mutantes de genes-alvo em diversas espécies. O surgimento do sistema de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/proteína associada 9 (Cas9) fornece um novo método para manipular ^genomas1. O sistema CRISPR/Cas9 consiste em um RNA guia (gRNA) e o endonuclease ^Cas92,3, enquanto o gRNA pode ser ainda dividido em duas partes, um RNA CRISPR complementar de destino (crRNA) e um crRNA trans-ativante (tracrRNA). O gRNA se integra com a endonuclease Cas9 e forma uma ribonucleo....

Protocolo

1. Projeto de primers específicos de genes e preparação de sgRNA

1. Verifique uma região genômica conservada no gene de interesse através de análises de amplificação e sequenciamento do PCR. Amplificar o gene alvo do DNA do genoma de H. armigera e distinguir os exons e introns.
   NOTA: A especificidade da sequência do site de guias é necessária para evitar a edição de genes fora do alvo. Pesquise possíveis locais-guia nos exons estão próximos do UTR de 5' do gene. Então, é importante ter certeza de que o gene é completamente não funcional. Um resumo do caminho de fluxo para a preparação do sgRNA é ilustrado na Figura 1.

Resultados

Este protocolo fornece etapas detalhadas para a obtenção de linhas de knock-out genéticas de H. armigera usando a tecnologia CRISPR/Cas9. Os resultados representativos obtidos por este protocolo são resumidos para seleção de GDNA, coleta e injeção de embriões, criação de insetos e detecção de mutantes.

Neste estudo, o local alvo do nosso gene de interesse foi localizado em seu segundo exon (Figura 2.......

Discussão

A aplicação do sistema CRISPR/Cas9 forneceu poderoso suporte técnico para a análise da função genética e interação entre vários genes. O protocolo detalhado que apresentamos aqui demonstra a geração de um mutante homozigoto em H. armigera via edição de genomas CRISPR/Cas9. Este procedimento confiável fornece uma maneira simples de mutagênese genética direcionada em H. armigera.

A escolha dos locais-alvo do CRISPR pode afetar a eficiência da ^{mutagênese37}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Escada de DNA de 2kb	TransGen Biotech	BM101
Vidro Capilar	World Precision Instrucments	504949	referido como "vidro capilar" no protocolo
Fita dupla face	Minnesota Mining and Manufacturing Corporation	665
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjetor	Eppendorf Corporate	E5252000021
Micromanipulador Eppendorf InjectMan 4	Eppendorf Corporate	5192000051
Eppendorf Microloader Pipetas Tips Eppendorf	Corporate	G2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Microscópio Slide	Sail Marca	7105
Microscópio Olympus Olympus	Corporation	SZX16
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040	usado para detecção de mutantes
Sutter Micropipette Extrator	Sutter Instrument Company	P-1000
TIANamp Genomic DNA Kit TIANGEN	Corporate	DP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36499