Visualizando a formação de babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura

Summary

Macropinocistose é um processo endoctico altamente conservado iniciado pela formação de projeções de membrana semelhantes a folhas f-actin, também conhecidas como babados de membrana. O aumento da taxa de internalização do soluto macropinocético tem sido implicado em várias condições patológicas. Este protocolo apresenta um método para quantificar a formação de babados de membrana in vitro usando microscopia eletrônica de varredura.

Abstract

O babado da membrana é a formação de saliências de membrana plasmática motil contendo uma malha de filamentos de actina recém-polimerizados. Os babados de membrana podem se formar espontaneamente ou em resposta a fatores de crescimento, citocinas inflamatórias e ésteres de phorbol. Algumas das saliências da membrana podem se reorganizar em babados de membrana circular que se fundem em suas margens distais e formam copos que fecham e se separam no citoplasma como vacuoles grandes e heterogêneos chamados macropinossomos. Durante o processo, babados prendem fluido extracelular e solutos que internalizam dentro de macropinossomos. Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (SEM) é uma técnica de imagem comumente usada para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos fechados na superfície celular. O protocolo a seguir descreve as condições de cultura celular, estimulação da formação de babados de membrana in vitro e como corrigir, desidratar e preparar células para imagem usando SEM. Quantificação de babados de membrana, normalização de dados e estimuladores e inibidores da formação de babados de membrana também são descritos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre o papel da macropinocistose nos processos fisiológicos e patológicos, investigar novos alvos que regulam a formação de babados de membrana e identificar estimuladores fisiológicos ainda não característicos, bem como novos inibidores farmacológicos da macropinocise.

Introduction

Macropinocistose é um processo endocítico responsável por internalizar uma grande quantidade de fluido extracelular e seu conteúdo através da formação de saliências dinâmicas e de membrana plasmática acionadas por atolética chamadas babados^{de membrana 1}. Muitos desses babados de membrana formam copos que se aproximam e se fundem de volta à célula e se separam da membrana plasmática como endosários intracelulares grandes e heterogêneos também conhecidos como macropinossomos¹. Embora a macropinocitose seja induzida por fatores de crescimento como fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF) e fator de crescimento epid....

Protocol

NOTA: O seguinte é um protocolo geral usado para quantificar a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264.7 utilizando microscopia SEM. A otimização pode ser necessária para diferentes tipos de células.

1. Linha celular e cultura celular

1. Grow RAW 264,7 macrófagos no DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco (DMEM) complementados com 10% (vol/vol) de bovino fetal inativado térmico (FBS), 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL streptomicina em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% DE CO₂. Substitua a mídia de crescimento a cada dois dias.
2. Quando as células se tornarem 80% confluentes, lave a placa duas ....

Results

Aqui, descrevemos os resultados da técnica apresentada. As imagens representativas da SEM mostradas na Figura 1 demonstram a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264,7 após o tratamento com PMA e M-CSF. As imagens foram capturadas pela primeira vez em uma ampliação de 3.500x para fins de quantificação e, em seguida, em níveis mais elevados de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática em maiores detalhes. Pré-tratamento de macrófagos com o inibidor de macrop.......

Discussion

O presente protocolo de imagem SEM fornece uma ferramenta para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos na superfície celular in vitro. Embora o protocolo atual se concentre em macrófagos, estudos têm demonstrado que a formação de babados de membrana também ocorre em vários outros tipos celulares, incluindo células dendríticas, fibroblastos, neurônios e células cancerosas 11,12,14,21,30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% Tripsina-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	16320
4% Paraformaldeído	Santa Cruz Biotecnologia	281692
5- (N-etil-N-isopropil) -Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Citômetro
de FluxoAdesivo de carbono Tabs	Microscopia Eletrônica Sciences	77825-09
Dimetil Sulfóxido	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i Incubadora de CO2	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Modelo 6.2 Revestidor de pulverização catódica	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR microscópio			eletrônico de varredura
Vidro de Cobertura de Microscópio	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Caneta Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-miristato 13-acetato	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrófago	ATCC	ATCC TIB-71
Humano Recombinante M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Secador de Ponto Crítico	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Montagens de Amostra de Alumínio	Microscopia Eletrônica Ciências	75220
Cacodilato	de Sódio Microscopia Eletrônica Ciências	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Solução Azul de Tripano	Thermo Fisher Scientific	15250061
			confocal Zeiss LSM 780