Visualizando a formação de babados de membrana usando microscopia eletrônica de varredura

Macropinocistose é um processo endocítico responsável por internalizar uma grande quantidade de fluido extracelular e seu conteúdo através da formação de saliências dinâmicas e de membrana plasmática acionadas por atolética chamadas babados^{de membrana 1}. Muitos desses babados de membrana formam copos que se aproximam e se fundem de volta à célula e se separam da membrana plasmática como endosários intracelulares grandes e heterogêneos também conhecidos como macropinossomos¹. Embora a macropinocitose seja induzida por fatores de crescimento como fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF) e fator de crescimento epidérmico (EGF) em uma ampla gama de tipos celulares, um processo adicional único, dependente de cálcio conhecido como macropinocose constitutiva também foi observado em imunes inatas ^{2,3,4, 5}, 6, ^7,8.

A capacidade das células de internalizar material extracelular via macropinocise tem mostrado desempenhar um papel importante em uma variedade de processos fisiológicos que vão desde a captação de nutrientes até a captura de patógenos e apresentação de antígenos ^9,10,11. No entanto, como esse processo não é seletivo e induível, também foi implicado em uma série de condições patológicas. De fato, estudos anteriores sugeriram que a macropinocitose desempenha um papel importante na doença de Alzheimer, doença de Parkinson, câncer, nefriese e aterosclerose 12,13,14,15,16. Além disso, certas bactérias e vírus têm mostrado utilizar a macropinocitose para obter entrada em células hospedeiras e induzir a infecção^17,18. Curiosamente, a estimulação da macropinocitose também pode ser explorada para a entrega direcionada de agentes terapêuticos em diversas condições da doença^19,20.

Estudos anteriores exploraram a macropinocitose quantificando marcadores internalizados de fase fluida com marcação fluorescente na ausência e presença de agentes farmacológicos que inibem a macropinocitose usando citometria de fluxo e imagem confocal^21,22. Atualmente, as ferramentas farmacológicas disponíveis que inibem a macropinocistose estão limitadas e compreendem 1) inibidores de polimerização de actina (citochalasina D e latrunculinas), 2) bloqueadores pi3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibidores de trocadores de hidrogênio de sódio (NHE) (amiloride e EIPA)5,14,15,23,24,25 . No entanto, como esses inibidores têm efeitos independentes da endocitose, é difícil determinar seletivamente a contribuição da macropinocise para a absorção de solutos e patogênese da doença especialmente in vivo²¹.

A microscopia eletrônica de varredura (SEM) é um tipo de microscópio eletrônico que produz imagens de ultra-alta resolução de células usando um feixe focalizado de elétrons²⁶. Na pesquisa de macropinocistose, a imagem SEM é considerada a técnica padrão-ouro para visualizar características topográficas e morfológicas da membrana plasmática, quantificar a formação de babados de membrana e investigar sua progressão para a internalização macropinosa. Além disso, a varredura da microscopia eletrônica combinada com a quantificação da absorção de soluto, na presença e ausência de bloqueadores de macropinocise, fornece uma estratégia confiável para examinar a internalização do soluto macropinocistótico in vitro. Este artigo fornece um protocolo detalhado sobre como preparar células para SEM, visualizar a superfície celular, quantificar a formação de babados e examinar seu progresso para o fechamento do copo e internalização macropinosa.

NOTA: O seguinte é um protocolo geral usado para quantificar a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264.7 utilizando microscopia SEM. A otimização pode ser necessária para diferentes tipos de células.

1. Linha celular e cultura celular

1. Grow RAW 264,7 macrófagos no DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco (DMEM) complementados com 10% (vol/vol) de bovino fetal inativado térmico (FBS), 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL streptomicina em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% DE CO₂. Substitua a mídia de crescimento a cada dois dias.
2. Quando as células se tornarem 80% confluentes, lave a placa duas vezes usando PBS estéril.
3. Despegar células adicionando 1.000 μL de 0,5% de trippsina-EDTA e incubar a placa de cultura celular por 3-5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C.
4. Examine a placa sob um microscópio leve para confirmar a dissociação celular. Adicione 10 mL de mídia de crescimento contendo 10% de FBS para inativar trippsina.
5. Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente. Resuspend suavemente células no meio completo da cultura celular e determinam a contagem de células e a viabilidade usando a coloração do Trypan Blue (0,4%) .
   NOTA: A viabilidade celular mínima recomendada para este experimento é >90%.
6. Coloque tampas de vidro estéreis em poços de uma placa de 24 poços usando fórceps autoclavados. As células de sementes em deslizamentos de cobertura a uma densidade de 1 x 10⁶ células/mL e incubam a placa durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂.
7. Mude a mídia de cada poço com mídia completa de 500 μL fresca antes do tratamento. Macrófagos pré-tratados com veículo (DMSO ou outros solventes usados para dissolver o EIPA) ou o inibidor de macropinocise 5-(N-ethyl-N-isopropil)-Amiloride (EIPA, 25 μM²¹) por 30 min.
8. Tratar células com veículo e estimuladores de macropinocitose para promover o babado de membrana: phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min²¹) e fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min³).
   NOTA: Inibidores alternativos [por exemplo, latrunculina A (1 μM, 30 min) ou citochalasina D (1 μM, 30 min)] e estimuladores [por exemplo, fator de crescimento epidérmico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) ou fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de macropinocose também pode ser usado para caracterizar macropinocise em macrófagos e outros tipos celulares^{16,27, 28,29}. As células podem exigir fome de soro durante a noite antes do tratamento com estimuladores fisiológicos da macropinocise. É importante notar que as concentrações mais eficazes e os tempos de incubação terão que ser determinados para estimular a macropinocitose em outros tipos de células.

2. Fixação SEM

1. Após o tratamento, aspire a mídia de poços e lave tampas com PBS gelado duas vezes.
2. Fixar células (4% de paraformaldeído e 2% glutaraldeído em 0,1 M de cacodilato de sódio) por 30 min à temperatura ambiente, seguido de incubação durante a noite no fixador a 4 °C.
3. Lave suavemente e incubar tampas com 500 μL de reagentes seguintes sem perturbar a monocamada celular.
   1. Lave uma vez em 0,1 M de cacodilato de sódio e incubar por 15 min.
   2. Lave duas vezes com dH₂O com incubação de 10 minutos em cada lavagem.
   3. Lave duas vezes com 25% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   4. Lave duas vezes com 50% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   5. Lave duas vezes com 75% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   6. Lave duas vezes com 80% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   7. Lave duas vezes com 95% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
   8. Lave duas vezes com 100% de etanol. Realize 10 min de incubação em cada lavagem.
      NOTA: A troca/substituição dos reagentes deve ser feita rapidamente para evitar a secagem do ar das células. As tampas podem ser deixadas em 100% de etanol por vários dias a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, adicione 100% de etanol adicional e cubra poços com parafilm para evitar a secagem do ar da amostra.

3. Secagem de pontos críticos

1. Coloque as tampas em um Secador de Ponto Crítico e cubra com 100% de etanol. Pressione o botão Ligar e abra o tanque de CO₂ .
2. Pressione o botão Esfriar por aproximadamente 30 s até que a temperatura diminua para 0 °C. Pressione o botão Encher até que uma bolha apareça na janela da câmara.
3. Pressione o botão Desatenção até que o cheiro de etanol do escapamento do expurgo desapareça. Pressione novamente o botão Esfriar até que a temperatura diminua para 0 °C.
4. Pressione os botões Encher e Limpar para desligá-los e fechar o tanque de CO₂ . Pressione o botão Esfriar para desligá-lo e pressione o botão Aquecer.
5. Coloque a temperatura em 42 °C e a pressão em 1.200 psi. Uma vez que a pressão e a temperatura estabilizem, pressione o botão Sangrar para permitir que a pressão diminua lentamente.
6. Quando a pressão da câmara atingir 150 psi, pressione o botão Vent e espere até que a pressão diminua para 0 psi. Desligue o secador de ponto crítico e remova as tampas.
7. As tampas de montagem em montagens de alumínio SEM são montadas usando abas adesivas de carbono e sujeitas ao revestimento sputter usando ouro/paládio em um revestimento de sputter.
8. Ligue o botão Ligar e espere até que o vácuo atinja 30 mTorr. Lave a câmara para remover a umidade e o ar desligando o interruptor de gás e girando a válvula de gás fina no sentido anti-horário.
9. Uma vez que o vácuo aumenta para 200 mTorr desligue o interruptor de gás e espere até que o vácuo atinja 30 mTorr. Repita este passo 3 vezes.
10. Pressione o botão Temporizador e ajuste o botão de tensão até que o medidor leia 10 mA. Remova as tampas revestidas da câmara.
    NOTA: Siga as instruções do fabricante para realizar a secagem de pontos críticos e o revestimento da amostra.

4. Imagem e quantificação

1. Inserir manchas de amostra na câmara de um microscópio eletrônico de varredura. Feche a porta e pressione o botão Evac .
2. Abra o software de operação SEM. Coloque a tensão acelerada em 15 kv e a distância de trabalho para 10 mm.
3. Pressione o botão Coordenadas e mova-se ao redor do controlador até que as células apareçam no centro da tela de observação. Defina a ampliação em 3.500x e imagem da amostra clicando no botão Foto.
   NOTA: Use um nível mais elevado de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática em maiores detalhes.
4. Faça imagens de pelo menos 10 locais aleatórios nas tampas, certificando-se de que cada campo microscópico contenha múltiplas células. Salvar imagens como .tif arquivos.
5. A partir das imagens, localize os babados de membrana, definidos como dobras salientes semelhantes a uma manta da membrana plasmática, com um tamanho superior a 500 nm (Figura 1). Conte o número de babados por célula.
   NOTA: Os babados em forma de C foram identificados como saliências de membrana curva que não se fundiram em suas extremidades laterais [(Figura 1 (tratamento M-CSF) e Figura 2B]. Babados de membrana circular fundido, antes de seu fechamento, foram identificados como copos macropinocéticos (Figura 2C).
6. Normalizar o número de babados de membrana para o número total de células no campo microscópico avaliado. Repita esta análise para as amostras de cada grupo.

Aqui, descrevemos os resultados da técnica apresentada. As imagens representativas da SEM mostradas na Figura 1 demonstram a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264,7 após o tratamento com PMA e M-CSF. As imagens foram capturadas pela primeira vez em uma ampliação de 3.500x para fins de quantificação e, em seguida, em níveis mais elevados de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática em maiores detalhes. Pré-tratamento de macrófagos com o inibidor de macropinocitose EIPA atenuada formação de babado de membrana (Figura 1). As atividades de membrana plasmática associada à macropinotose podem ser divididas em cinco etapas consecutivas: 1) iniciação de babando de membrana, 2) circularização, 3) formação de copos, fechamento de copos e 5) internalização do fluido extracelular e seus solutos associados através da formação macropinosa. A Figura 2 mostra imagens representativas dessas atividades de membrana plasmática morfologicamente distintas após a estimulação de M-CSF. Grandes babados em forma de folha (Figura 2A), babados circularizados em forma de C (Figura 2B) e copos macropinocíticos (Figura 2C) foram capturados a uma ampliação de 6.000x a 7.000x. A microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para fornecer imagens de alta resolução da superfície celular, mas não pode ser utilizada para visualizar macropinossos internalizados. A quantificação dos babados de membrana após o tratamento PMA e M-CSF é mostrada na Figura 3. A formação macropinosa pode ser confirmada por técnicas alternativas de imagem, incluindo microscopia confocal, como mostrado na Figura 4. Por fim, a quantificação SEM do babado de membrana deve ser complementada pela quantificação da citometria de fluxo de um marcador fluorescente de fase de fluido (por exemplo, FITC- ou Texas red-dextran) para confirmar a estimulação da macropinocitose (Figura 5).

Figura 1: Escaneando imagens de microscopia eletrônica de macrófagos RAW 264.7. Os macrófagos RAW 264,7 foram pré-tratados com veículo (controle DMSO) ou EIPA (25 μM) por 30 min e incubados com PMA (1 μM, 30 min) ou M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular o babado da membrana. Imagens à direita mostram maior ampliação da superfície celular. Setas vermelhas: babados de membrana. Arqueiro verde: babado em forma de C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estágios morfológicos da macropinotose capturados pela microscopia eletrônica de varredura. Os macrófagos RAW 264,7 foram tratados com M-CSF (100 ng/mL) por 30 min e as células foram processadas para imagem SEM. (A) saliência de membrana em forma de folha, (B) babado de membrana em forma de C e (C) copo macropinocítico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificação da formação de babados de membrana. Os macrófagos RAW 264,7 foram pré-tratados com veículo (controle DMSO) ou EIPA (25 μM) por 30 min e incubados com PMA (1 μM, 30 min) ou M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular o babado da membrana. O gráfico da barra mostra o número de babados de membrana normalizados para o número total da célula (n = 3). Os dados representam a média ± MEI ANOVA unidirecional; *p < 0,05 vs. veículo, #p < 0,05 vs. TRATAMENTO PMA ou M-CSF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Formação macropinosso. As células foram pré-tratadas com PMA por 30 min e incubadas com texas red-dextran (25 μg/mL, vermelho) e FM4-64 (5 μg/mL, verde) por 10 min. As imagens foram realizadas utilizando um microscópio confocal. Setas azuis: babados de membrana, setas amarelas: macropinossomo contendo Texas red-dextran, setas verdes: macropinosomos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Quantificação da macropinocitose. Os macrófagos RAW 264,7 foram pré-tratados com veículo (controle DMSO) ou EIPA (25 μM) por 30 min e incubados com PMA (1 μM) e FITC-dextran (100 μg/mL; 70.000 MW) por 2h. O gráfico da barra mostra a variação média da intensidade da fluorescência (IFA) normalizada para o tratamento do veículo (n = 3, realizada em triplicados). Os dados representam a média ± MEI ANOVA unidirecional; *p < 0,05 vs. veículo, #p < 0,05 vs. PMA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não declaram conflitos de interesse.