Fratura transversa do fêmur do rato com pino estabilizador

Fraturas, quebras na continuidade da superfície óssea, ocorrem em todos os segmentos da população. Eles se tornam graves em pessoas que têm ossos frágeis devido ao envelhecimento ou doença, e os custos de cuidados de saúde das fraturas por fragilidade devem ultrapassar US$ 25 bilhões em 5 anos 1,2,3,4,5. Compreender os mecanismos biológicos envolvidos na reparação de fraturas seria um ponto de partida no desenvolvimento de novas terapias visando melhorar o processo de cicatrização. Pesquisas anteriores mostraram que, após a fratura, ocorrem quatro etapas significativas que permitem curar o osso: (1) formação do hematoma; (2) formação de calo fibrocartilagino; (3) mineralização do calo macio para formar osso; e (4) remodelação do osso curado^6,7. Muitos processos biológicos são ativados para curar a fratura com sucesso. Primeiro, uma resposta aguda pró-inflamatória é iniciada imediatamente após uma fratura^{de 6,7}. Em seguida, o periosteum se torna ativado e se expande, e as células periosteais se diferenciam em condrócitos para formar um calo de cartilagem que cresce para preencher a lacuna deixada pelos segmentos ósseos rompidos 6,7,8,9. Células neurais e vasculares invadem o calo recém-formado para fornecer células adicionais e moléculas de sinalização necessárias para facilitar a reparação^{de 6,7,8}, ^9,10. Além de contribuir para a formação do calo, as células periosteais também se diferenciam em osteoblastos que estabelecem osso tecido no calo de ponte. Finalmente, os osteoclartos remodelam o osso recém-formado para retornar à sua forma original e estrutura lamelar 7,8,9,10,11. Muitos grupos desenvolveram modelos de camundongos de reparo de fraturas. Um dos modelos de fratura mais antigos e mais usados em camundongos é a abordagem Einhorn, onde um peso é caído na perna a partir de uma altura específica¹². A falta de controle sobre o ângulo e a força aplicada para induzir a fratura cria muita variabilidade na localização e tamanho da descontinuidade óssea. Posteriormente, resulta em variações na resposta específica de cicatrização da fratura observada. Outras abordagens populares são a intervenção cirúrgica para produzir um defeito monocortical tibial ou fraturas por estresse, procedimentos que induzem respostas de cura relativamente mais brandas^10,13. A variabilidade nesses modelos deve-se principalmente à pessoa que conduz o procedimento¹⁴.

Aqui, um modelo detalhado de lesão do fêmur do camundongo permite o controle sobre a ruptura para fornecer uma lesão reprodutível e permitir uma avaliação quantitativa e qualitativa da reparação da fratura do fêmur. Especificamente, um completo avanço nos fêmures de camundongos adultos é introduzido e estabiliza as extremidades da fratura para explicar o papel do carregamento físico na cicatrização óssea. Os métodos de colheita de tecidos e imagem das diferentes etapas do processo de cura utilizando histologia e tomografia microcomputada (microCT) também são fornecidos em detalhes.

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Área Médica de Harvard. Foram utilizados neste protocolo camundongos C57BL/6J de 12 semanas (machos e fêmeas). Camundongos machos e fêmeas C57BL/6J atingem o pico de massa óssea em torno de 12 semanas de idade com fêmures largos o suficiente para caber em um pino estabilizador, tornando-os uma cepa apropriada para usar para este protocolo¹⁵.

1. Preparação para a cirurgia

1. Autoclave o equipamento cirúrgico, incluindo tesoura cirúrgica, fórceps retos, fórceps curvos, grampos cirúrgicos e roda de corte de diamante (ver Tabela de Materiais) para minimizar o risco de infecção.
2. Coloque uma gaiola de rato limpa em uma almofada de aquecimento para facilitar a recuperação pós-cirúrgica. Coloque a almofada de calor para atingir uma temperatura entre 37-45 °C.
3. Coloque o rato sob anestesia usando uma câmara de isoflurano. Coloque o fluxo de oxigênio por indução em 2 L/min, a indução de isoflurane em 2-4%, o oxigênio do cone do nariz de manutenção a 2 L/min, e o isoflurane de manutenção é de 1,4%.
4. Confirme se a respiração do rato está estável e eles não respondem a uma pitada de dedo do dedo do sol. Aplique uma fina camada de pomada oftálmica em cada olho para evitar arranhões na córnea. Transfira o mouse para uma almofada estéril e mantenha a anestesia usando um cone de nariz para entregar isoflurane continuamente na mesma taxa que na etapa 1.3.
   NOTA: O uso de camundongos de 12 semanas ou mais é recomendado, pois os fêmures de camundongos mais jovens podem ser muito finos para acomodar um pino estabilizador.
5. Injete subcutâneamente o mouse com 0,05 mg/kg de peso corporal de buprenorfina de liberação lenta (ver Tabela de Materiais).
6. Utilizando um aparador elétrico, raspe um quadrado de 2 x 2 cm em ambas as coxas correspondente à localização do fêmur.
7. Desinfete a área raspada usando gaze ou cotonetes estéreis para espalhar uma camada de iodo seguido de enxágue com 70% de etanol (Figura 1A).

2. Cirurgia

1. Usando um bisturi estéril, faça uma incisão de 5 mm na região raspada e desinfetada e retire a pele para expor a fáscia subjacente.
2. Use fórceps retos e tesouras finas para agarrar delicadamente e cortar a fáscia cobrindo diretamente o fêmur para expor o músculo. Um corte de 5 mm da fáscia é suficiente para acessar o músculo subjacente.
3. Usando um par de fórceps retos, separe suavemente o músculo do fêmur com danos mínimos no tecido.
4. Uma vez visível o fêmur, deslize os fórceps curvas sob o fêmur entre o músculo separado e o osso. Deixe os fórceps abrirem lentamente para manter a separação muscular e fixar o fêmur para facilitar um corte limpo.
   NOTA: O fêmur deve permanecer exposto e separado do músculo e da pele quando as fórceps não estiverem mantidas, como mostra a Figura 1B.
5. Faça um corte transversal no meio do eixo do fêmur usando uma serra portátil na configuração de baixa potência (Ver tabela de materiais para a lâmina e kit de ferramentas rotativas utilizados).
   NOTA: Uma vez que o fêmur esteja completamente cortado, duas extremidades de fratura são criadas: a seção proximal (presa ao osso do quadril) e a seção distal (presa ao joelho, também conhecida como articulação do sufocamento). Evite cortar o fêmur em um único movimento. Em vez disso, faça 3-5 passes até que o fêmur seja completamente cortado. Isso é fundamental para evitar superaquecimento do tecido circundante e gerar detritos ósseos significativos, impactando negativamente a cicatrização.
6. Insira uma agulha-guia (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (ver Tabela de Materiais) na cavidade da medula da seção distal. Use os dedos para torcer suavemente a agulha enquanto empurra para roscar através da articulação do joelho (Figura 1C).
   1. Remova a agulha guia da extremidade distal e repita na extremidade proximal, usando o mesmo movimento de torção suave para empurrar a agulha guia através da articulação do quadril. Deixe a agulha guia na extremidade proximal, com sua ponta emergindo da pele (Figura 1D).
      NOTA: Para estabilizar as extremidades da fratura, uma agulha guia foi usada primeiro para criar uma via através das extremidades da fratura, e então um pino estabilizador foi roscado através desta via para proteger as extremidades da fratura¹⁴.
7. Insira o pino estabilizador (agulha, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (ver Tabela de Materiais) na ponta da agulha guia (Figura 1E). Empurre suavemente para que o pino estabilizador entre quando a agulha-guia sair da cavidade da medula da extremidade proximal.
   1. Descarte a agulha-guia. Use pinças para segurar e alinhar a extremidade distal com a extremidade proximal e continue a roscar o pino estabilizador através da cavidade da medula distal até que saia da articulação do joelho usando a via feita em 2.6 (Figura 1F).
      NOTA: O pino estabilizador deve agora estar salientes do quadril e das articulações do joelho.
8. Usando o grampo cirúrgico, puxe a ponta do pino para aproximar as seções proximal e distal, para que mal toquem. Realinhar as extremidades da fratura com fórceps, se necessário, e dobre as extremidades do pino estabilizador em direção ao local da fratura usando o grampo cirúrgico (ver Tabela de Materiais).
   1. Remova o plástico da base da agulha usando cortadores de arame. Usando o grampo, torça ambas as extremidades do pino até que fiquem cegas para evitar danos internos no tecido.
      NOTA: As extremidades da fratura estão agora bloqueadas no lugar para que o rato possa colocar peso na perna ferida. O pino é fixado se as extremidades da fratura não puderem se separar. Um cortador de arame também pode ser usado para cortar as extremidades. O pino estabilizador deve permanecer no lugar durante toda a duração do estudo até que o mouse seja eutanizado. As tentativas de desalojar o pino são susceptíveis de desestabilizar a resposta da fratura e causar danos ao animal. O pino pode ser removido na dissecção.
9. Use fórceps retoques para reposicionar o músculo no fêmur. Usando fórceps curvos, aperte as extremidades da pele e feche a abertura usando clipes de ferida.
   NOTA: Não feche a pele muito bem com os clipes ou o mouse evitará colocar peso nesta perna. Limitar o carregamento físico durante a recuperação pode atrasar o processo de cicatrização.
10. Repita as etapas 2.2 a 2.4 na outra perna e feche a ferida sem realizar a fratura do fêmur.
    NOTA: Este fêmur operado por farsa serve como controle contralateral.
11. Retire a exposição isoflurane, coloque o rato na gaiola aquecida e garanta que eles recuperem a consciência dentro de 10-15 minutos.
12. Monitore o local de atividade e incisão do camundongo diariamente por 5 dias após a cirurgia para sinais de angústia ou infecção.
    NOTA: Se o animal demonstrar sinais de dor, não está comendo e/ou hesita em andar em suas patas traseiras, consulte o pessoal veterinário e administre analgésicos adicionais.
13. Remova os clipes da ferida 10 dias após a cirurgia.
    NOTA: Se a ferida não parecer ter sido fechada após 10 dias, consulte o personel veterinário e o IACUC antes de remover os clipes.

3. Colheita de tecidos

1. Eutanize os camundongos por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical.
   NOTA: Este procedimento é consistente com o Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.
2. Usando tesouras e fórceps, remova a pele de ambas as pernas do rato, desloque a cabeça femoral do osso do quadril e corte o músculo adjacente para liberar a perna.
   NOTA: Evite remover muito músculo ao redor do fêmur, pois o calo pode ser desalojado ou danificado.
3. Evitando o pino estabilizador, corte a articulação do joelho para separar o fêmur da tíbia.
4. Disseque ao redor das partes distal e proximal do fêmur para expor as extremidades do pino estabilizador.
5. Com um cortador de arame duro, corte as extremidades contundentes dobradas do pino para que apenas a parte reta do pino permaneça. Use fórceps para deslizar lentamente e suavemente o pino estabilizador para fora do fêmur.
   NOTA: Se o pino não deslizar facilmente para fora, não aplique força, pois isso pode desalojar o calo e danificar a amostra. Em vez disso, tente girar o pino e removê-lo delicadamente. A remoção do pino também pode ser mais fácil após a fixação.

4. Histologia - Manchas de Azul Alcian / Eosin /Laranja G

NOTA: A coloração azul/laranja G/Eosin é usada rotineiramente para visualizar cartilagem (azul) e osso (rosa). A área da cartilagem pode ser quantificada como proporção da área total do calo (Figura 2A,B).

1. Fixar fêmures em formalina tamponada 10% neutra durante a noite a 4 °C.
2. Lave as amostras fixas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
3. Coloque amostras em 0,5M EDTA, pH 8.0 em um agitador rotativo lento por 2 semanas. Mude a solução EDTA a cada dois dias para garantir uma decalcificação eficiente.
   NOTA: Não é necessário rpm específico para o agitador; certifique-se de que o líquido flua no recipiente para cobrir todas as amostras. A decalcificação completa pode ser testada por raio-X dos fêmures.
4. Para processar as amostras para parafinas incubar-nas nas seguintes soluções (1h cada): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xileno, Xileno, Parafina, Parafina.
5. Incorpore as amostras em parafina para secção.
6. Corte de 5-7 μm de espessura seções longitudinais dos fêmures fraturados usando um microtoma.
7. Desparafinar as seções incubando-as em 2 banhos de Xileno (5 min cada).
8. Reidratar as seções incubando no seguinte gradiente de etanol (2 min cada): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. Coloque lâminas na água da torneira por 1min.
10. Faça as soluções de azul alciano, álcool ácido, água de amônio e Eosin/Laranja G para histologia, conforme mencionado no Arquivo Suplementar 1.
    NOTA: Os volumes sugeridos de cada solução devem ser suficientes para submergir completamente os slides para a coloração.
11. Coloque slides em álcool ácido para 30 s e incubar em azul alciano por 40 minutos.
12. Lave suavemente sob a torneira de funcionamento até que a água esteja limpa por cerca de 2 minutos.
13. Mergulhe os slides rapidamente em álcool ácido por 1 s.
14. Enxágüe conforme descrito na etapa 4.9.
15. Incubar em água de amônio por 15 s.
16. Enxágüe conforme descrito na etapa 4.9.
17. Coloque em 95% EtOHfor 1 min e incubar em Eosin/Orange G para 90 s.
18. Desidratar os slides rapidamente com uma única queda em 70% EtOH, 80% EtOH e 100% EtOH.
19. Coloque slides em Xileno por 1 minuto para limpar os slides.
20. Aplique mídia de montagem e um clipe de cobertura para imagens.
    NOTA: Para análise molecular, RNA e proteína podem ser isolados do calo. Dissecar cuidadosamente o músculo sob um escopo dissecando e separar o calo do osso subjacente usando um bisturi.

5. MicroCT

NOTA: Nos estágios posteriores de cicatrização, o microCT pode ser realizado à imagem e quantificar a mineralização no calo duro e na lacuna da fratura. Em camundongos C57BL/6J, o calo é geralmente mineralizado e detectável por microCT após 10 dias pós-fratura (dpf) (Figura 2C).

1. Fixar fêmures em formalina tamponada 10% neutra durante a noite a 4 °C.
   NOTA : O MicroCT pode ser realizado nos mesmos fêmures utilizados para histologia, desde que seja feito antes da decalcificação edta (etapa 4.3). Ao utilizar os mesmos fêmures para ambas as técnicas, realize microCT, recupere as amostras e vá para a etapa 4.3.
2. Lave as amostras fixas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e armazene em 70% de EtOH.
3. Realize microCT com um voxel isotrópico de 7 μm a um nível de energia de 55 kVP e uma intensidade de 145 μA (ver Tabela de Materiais).
4. Contorça as fatias de microCT para incluir o calo e exclua o osso cortical.
   NOTA: À medida que o calo fica mais mineralizado com o tempo, o limiar pode ser ajustado para visualizar e medir o volume do calo em diferentes estágios.
5. Obtenha o volume ósseo contido nos contornos calos como medida do volume do calo.
   NOTA: A abertura da fratura pode ser medida diretamente nas fatias de microCT à medida que a distância ocupada pelo rompimento.

Em camundongos C57BL/6J, uma cirurgia bem sucedida completa os passos de cura mencionados anteriormente com pouca ou nenhuma resposta inflamatória local ou envolvimento periosteal no fêmur contralateral operado pela farsa. Um hematoma é formado algumas horas após a cirurgia, e o periosteum é ativado para recrutar progenitores esqueléticos para condrogênese. Várias populações de células, como progenitores mesenquimais Prx1+, podem ser rastreadas durante o processo de reparo usando modelos de mouse fluorescentes disponíveis comercialmente (Figura 3). Aos 5 dias de fratura pós-fratura (dpf), a coloração azul alciana pode ser usada para visualizar o calo macio e, posteriormente, quantificar a área da cartilagem (Figura 2A,B). A mineralização é detectável por microCT a 28 dpf (Figura 2C). O volume do calo mineralizado, a distância da fratura e a força óssea medida por testes mecânicos são comumente utilizados como desfechos quantificáveis da reparação da fratura. Modificação genética ou intervenção medicamentosa pode mudar o curso da recuperação, por isso recomenda-se realizar um estudo de curso-tempo para caracterizar fraturas em diferentes estágios de reparo. Todo o calo pode ser dissecado para análise molecular e o eixo ósseo contralateral pode ser usado como controle.  Se as extremidades da fratura não estiverem alinhadas ou adequadamente fixadas com o pino, as imagens resultantes mostrarão falta de formação de calo em todos ou em um lado do local da fratura (Figura 4).

Figura 1: Fratura e inserção do pino estabilizador. (A) Um quadrado é raspado na perna direita de um mouse C57BL/6J. (B) Depois que uma incisão é feita na pele e fáscia, fórceps curvos são fixados sob o fêmur para separar o músculo, pele e osso. (C) Após a montagem do corte, são criadas duas extremidades de fratura: a seção proximal do fêmur presa ao osso do quadril e a seção distal presa ao joelho. A agulha guia (verde) é inserida na seção distal e empurrada através da articulação do joelho. (D) A agulha-guia é removida da seção distal, inserida na seção proximal e empurrada através da articulação do quadril. (E) O pino estabilizador (agulha cinza) é inserido na agulha guia saliente da articulação do quadril. (F) O pino estabilizador é empurrado através da seção proximal, para a seção distal, e através da articulação do joelho usando o caminho feito pela agulha guia em C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Histologia e microCs de fratura do fêmur. (A) Foram coletadas seções de parafina fixas de formalina das fraturas do fêmur aos 5, 10 e 28 dpf e manchadas com barra azul/eosina alciana/laranja G. Scale = 500 μm. (B) A área de cartilagem foi quantificada utilizando-se o software ImageJ em 5, 10 e 28 dpf. (C) Aos 28 dpf, observou-se a mineralização, e o volume calo e a lacuna da fratura poderiam ser medidos por microCT. Barra de escala = 1.000 μm. Dados apresentados como ± SEM. O volume de calo mineralizado foi medido pelo contorno ao redor do osso cortical no local da fratura. A área cinza escura delineia o calo mineralizado na imagem, enquanto o osso cortical (cinza claro) não está incluído na medida. Dados apresentados como Média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Modelo de repórter fluorescente usado para visualizar a expansão das células periosteais Prx1+ após a fratura. Prx1CreER; Os camundongosrosa26 tdTomato foram injetados diariamente durante cinco dias com 80 mg/kg de peso corporal de tamoxifen para induzir a expressão tdTomato. Três dias após a injeção final, a fratura do fêmur foi iniciada, e os camundongos foram sacrificados às 7 ou 14 dpf para rastrear onde as células expressas de Prx1 e sua prole (Prx1+) estão localizadas dentro do calo de fratura e periosteum expandido. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplo de cicatrização irregular devido a problemas cirúrgicos. As extremidades da fratura não foram alinhadas adequadamente e o pino estabilizador perfurou a seção proximal do fêmur neste exemplo. Esses erros resultaram na formação de calo onde o fêmur foi perfurado (caixa amarela) em vez do local do corte. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Complementar 1: Composição das soluções necessárias para a histologia. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.