Kit de ferramentas de código aberto: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array para gravação de nervos

Grande parte da pesquisa em neurociência se baseia no registro de sinais neurais usando eletrofisiologia (ePhys). Esses sinais neurais são cruciais para entender as funções das redes neurais e novos tratamentos médicos, como máquina cerebral e interfaces nervosas periféricas1,2,3,4,5,6. Pesquisas em torno de nervos periféricos exigem eletrodos de gravação neural feitos sob medida ou comercialmente disponíveis. A gravação neural de eletrodos-ferramentas exclusivas com dimensões em escala de micron e materiais frágeis requer um conjunto especializado de habilidades e equipamentos para fabricar. Uma variedade de sondas especializadas foram desenvolvidas para usos finais específicos; no entanto, isso implica que os experimentos devem ser projetados em torno de sondas comerciais disponíveis atualmente, ou um laboratório deve investir no desenvolvimento de uma sonda especializada, que é um processo demorado. Devido à grande variedade de pesquisas neurais no nervo periférico, há alta demanda por uma sonda ePhys versátil4,7,8. Uma sonda ePhys ideal contaria com um pequeno site de gravação, baixo ^impedance9 e um ponto de preço financeiramente realista para implementação em um ^sistema3.

Os eletrodos comerciais atuais tendem a ser eletrodos extraneurais ou manguitos (Neural ^Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11), que ficam fora do nervo, ou intrafasciculares, que penetram no nervo e se sentam dentro do fascículo de interesse. No entanto, à medida que os eletrodos de punho ficam mais longe das fibras, eles captam mais ruídos de músculos próximos e outros fascicles que podem não ser o alvo. Essas sondas também tendem a restringir o nervo, o que pode levar a um acúmulo de células gliais e tecido cicatricial na interface do eletrodo enquanto o tecido se cura. Eletrodos intrafasciculares (como ^LIFE12, ^TIME13 e Utah Arrays14) adicionam o benefício da seletividade de fascículos e têm boas relações sinal-ruído, o que é importante em sinais discriminadores para interligação de máquinas. No entanto, essas sondas têm problemas com a biocompatibilidade, com os nervos ficando deformados ao longo do tempo3,15,16. Quando compradas comercialmente, ambas as sondas têm designs estáticos sem opção de personalização específica de experimentos e são caras para laboratórios mais novos.

Em resposta aos problemas de alto custo e biocompatibilidade apresentados por outras sondas, os eletrodos de fibra de carbono podem oferecer uma avenida para os laboratórios de neurociência construirem suas próprias sondas sem a necessidade de equipamentos especializados. As fibras de carbono são um material de gravação alternativo com um pequeno fator de forma que permite a inserção de baixo dano. As fibras de carbono proporcionam melhor biocompatibilidade e resposta de cicatriz consideravelmente menor do que o silício17,18,19 sem o processamento intensivo da sala ^de limpeza5,13,14. As fibras de carbono são flexíveis, duráveis, facilmente integradas com outros ^{biomateriais19}, e podem penetrar e registrar a partir de ^nervos7,20. Apesar das muitas vantagens das fibras de carbono, muitos laboratórios acham a fabricação manual dessas matrizes árdua. Alguns ^grupos21 combinam fibras de carbono em feixes que, coletivamente, resultam em um diâmetro maior (~200 μm); no entanto, para nosso conhecimento, esses feixes não foram verificados em nervos. Outros fabricaram matrizes de eletrodos de fibra de carbono não evidenciadas, embora seus métodos exijam guias de fibra de carbono fabricados em sala de limpeza22,23,24 e equipamentos para povoar suas matrizes17,23,24. Para lidar com isso, propomos um método de fabricação de uma matriz de fibra de carbono que possa ser realizada no banco de banco de laboratório que permita modificações improvisadas. A matriz resultante mantém pontas de eletrodos individuadas sem ferramentas especializadas de preenchimento de fibras. Além disso, várias geometrias são apresentadas para corresponder às necessidades do experimento de pesquisa. Construído a partir de trabalhos anteriores8,17,22,25, este artigo fornece metodologias detalhadas para construir e modificar vários estilos de matrizes manualmente com o mínimo de tempo de treinamento de sala de limpeza necessário.

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan.

1. Escolher uma matriz de fibra de carbono

1. Escolha uma placa de circuito impresso (PCB) de um dos três desenhos mostrados na Figura 1.
   NOTA: Para este protocolo, Flex Arrays será o foco.
   1. Consulte os projetos de PCB no site do Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), gratuitamente e pronto para ser enviado e encomendado para impressão através de uma gráfica PCB.
   2. Consulte a Tabela 1 para obter um resumo dos conectores para cada placa e suas especificações para ajudar a escolher o conector que funcionará para a configuração experimental específica.

2. Soldar o conector para a placa de circuito

1. Coloque um ferro de solda a 315 °C (600 °F).
2. Aplique fluxo em todas as almofadas de solda no PCB.
   NOTA: O fluxo dentro de um tubo pode ser espremido através das almofadas, enquanto o fluxo em uma panela pode ser aplicado com a extremidade de madeira de um aplicador de ponta de algodão manchando o fluxo em todas as almofadas liberalmente.
3. Formar pequenos montes de solda nas almofadas traseiras do Flex Array (Figura 2A).
4. Soldar a linha inferior dos pinos do conector para a linha de trás das almofadas de solda (Figura 2B).
   NOTA: Todos os projetos de placa fornecidos pelo laboratório Chestek foram projetados para que os conectores emparelhem precisamente com sua placa designada.
   1. Para isso, solde os pinos de ambos os lados do conector com fácil acesso aos montes de solda. Uma vez seguro, empurre suavemente a ponta de ferro de solda entre os pinos dianteiros para soldar as conexões restantes na parte de trás.
      NOTA: Uma vez que a linha de trás dos pinos esteja segura, o resto do conector se alinhará com cada pino acima da almofada de solda atribuída.
5. Solde a primeira fila de pinos na placa aplicando uma pequena quantidade de solda em cada pino. Aplique uma camada adicional de fluxo se a solda não estiver acontecendo rapidamente.
   1. Limpe o fluxo de excesso com álcool isopropílico 100% (IPA) e uma escova de cerdas curtas.
6. Encapsular as conexões soldadas em epóxi de conjunto atrasado (Figura 2 C,D) usando uma agulha de 23 G e uma seringa de 1 mL colocada lado de bipe para baixo nos pinos. Empurre epóxi através da seringa lentamente para que ela flua para dentro e ao longo das conexões.
   1. Deixe o tabuleiro durante a noite para que o epóxi atrasado possa curar.
      NOTA: Enquanto a inserção do produto para o conjunto atrasado epóxi afirma que ele cura em 30 minutos, deixá-lo durante a noite permite que uma conexão mais estável se forme.
7. Fixar a parte traseira da placa para os lados do conector, colocando uma pequena linha de epóxi de conjunto atrasado através do lado de trás da placa e puxando-o para as bordas do conector.
   1. Deixe o tabuleiro para curar durante a noite de novo.
      NOTA: Neste momento, ou armazene as matrizes ou continue a compilação. Se parar na compilação, armazene as matrizes em uma caixa limpa e seca à temperatura ambiente.

3. População de fibras

1. Corte um capilar de vidro puxado para que sua ponta se encaixe entre os traços da matriz (Figura 3A).
   1. Usando um puxador de vidro e filamento, faça capilares usando as seguintes configurações: Calor = 900, Puxar = 70, Velocidade = 35, Tempo = 200, Pressão = 900.
      NOTA: Os números são unitários e específicos para este dispositivo (veja a Tabela de Materiais).
2. Use as extremidades de madeira de dois aplicadores de ponta de algodão (um por cada parte de epóxi prateado) para colher uma pequena proporção de epóxi prateado de ~1:1 em um prato plástico e misture usando as mesmas varas usadas para colher. Descarte os aplicadores após a mistura.
3. Corte 2-4 mm da extremidade do feixe de fibra de carbono em um pedaço de papel de impressora usando uma lâmina de barbear. Para separar facilmente as fibras do pacote, que são difíceis de separar, puxe um pedaço de papel laminado suavemente sobre a parte superior do pacote.
   NOTA: O pedaço de papel laminado transfere estática para as fibras, que se separarão por si só.
4. Aplique epóxi prateado entre todos os outros pares de traços de um lado da placa com o capilar de vidro (Figura 3B).
   1. Leve uma pequena gota de epóxi na ponta de um capilar puxado. Aplique suavemente entre todos os outros traços na extremidade do tabuleiro, preenchendo a lacuna.
      NOTA: A lacuna deve ser preenchida até o topo dos dois traços sem transbordar para tocar traços vizinhos. Cada traço está conectado a um canal. Este método de população epóxi significa que cada fibra terá dois canais conectados a ela. Isso porque dois traços permitem um melhor alinhamento de fibras, e a redundância no canal ajuda a garantir a conexão elétrica.
5. Use pinças revestidas de Teflon para colocar uma fibra de carbono em cada traço epóxi (Figura 3C).
6. Use um capilar limpo puxado para ajustar as fibras de carbono, de modo que elas sejam perpendiculares até o final da placa Flex Array e enterradas sob o epóxi (Figura 3D).
7. Coloque as matrizes em um bloco de madeira com extremidades de fibra suspensas na borda do bloco.
   NOTA: O peso da extremidade traseira manterá a matriz no bloco.
8. Asse o bloco de madeira e os arrays a 140 °C por 20 minutos para curar o epóxi prateado e travar as fibras no lugar.
9. Repita as etapas 3.4-3.8 para o outro lado da placa.
   NOTA: Os arrays podem ser armazenados após qualquer etapa de cozimento; no entanto, estática das caixas de armazenamento pode fazer com que as fibras se afastem da placa se muito pouco epóxi prateado for aplicado ao preencher a placa.
   1. Crie uma plataforma de adesivo levantada dentro de uma caixa para que a maior parte da placa possa ficar presa ao adesivo permitindo que as extremidades fibras da placa sejam suspensas dentro da caixa para evitar a quebra de fibras. Armazene em temperatura ambiente.
      NOTA: Se as fibras se afastarem da placa durante o armazenamento, raspe o epóxi dos traços com um capilar de vidro puxado limpo e repita as etapas 3.1-3.8 para substituir as fibras. A partir deste ponto, as matrizes devem ser armazenadas com as fibras suspensas desta forma para evitar a quebra de fibras.

4. Aplicar epóxi ultravioleta (UV) para isolar as fibras de carbono

1. Use um capilar limpo e aplique uma pequena gota (~0,5 mm de diâmetro de epóxi UV nos traços expostos em um lado da placa (Figura 4A). Continue adicionando gotículas UV epóxi até que os traços estejam completamente cobertos.
   NOTA: Não permita que o epóxi UV entre nas fibras de carbono além da extremidade do PCB para garantir uma inserção suave mais tarde.
2. Cure o epóxi UV sob uma luz de caneta UV por 2 min (Figura 4B).
3. Repita os passos 4.1-4.2 para o outro lado da placa.
4. Corte as fibras para 1 mm usando um tique-sítipo e uma tesoura cirúrgica.
   NOTA: Os arrays podem ser armazenados neste momento até que estejam prontos para prosseguir para os próximos passos. Eles devem ser armazenados em uma caixa que elevará as fibras de carbono para longe da própria caixa. As matrizes podem ser armazenadas à temperatura ambiente indefinidamente.

5. Verificando conexões elétricas com escaneamentos de impedância de 1 kHz (Figura 5)

1. Submergir fibras de carbono 1 mm em 1x salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Para completar o circuito, use um cloreto prata-prata (Ag| AgCl) eletrodo de referência e uma haste de aço inoxidável (eletrodo de contador).
   1. Usando um grampo de béquer, suspenda o Ag| Eletrodo agCl no PBS 1x e conectá-lo à referência do sistema de impedância que está sendo utilizado.
   2. Usando um grampo de béquer, suspenda a haste de aço inoxidável no PBS 1x e conecte-se à entrada do eletrodo do sistema de impedância que está sendo utilizado.
3. Execute uma varredura de impedância de 1 kHz para cada fibra usando um conjunto de potencialização para uma frequência de varredura de 1 kHz a 0,01 _Vrms em uma única forma de onda seno. Defina o potencialiostat para 0 V no início de cada varredura para 5 s para estabilizar o sinal gravado. Registo as medições através do software associado ao potencialiostat.
   NOTA: As medidas podem ser tomadas em qualquer ponto da compilação; no entanto, eles só são necessários antes do isolamento e durante a preparação da ponta. A Tabela 2 lista faixas típicas de impedâncias após cada etapa de construção a 1 kHz para a referência do usuário.
4. Enxágüe as fibras em água deionizada (DI) mergulhando-as em um pequeno béquer três vezes e deixe-as secas à temperatura ambiente.
   NOTA: Os arrays podem ser deixados em armazenamento até que o usuário possa continuar na próxima etapa.

6. Isolamento de Parileno C

NOTA: O parileno C foi escolhido como o material de isolamento para as fibras de carbono, pois pode ser depositado à temperatura ambiente sobre lotes de matrizes e fornece um revestimento altamente conformal.

1. Mascarar o conector Flex Array usando o conector de acasalamento.
2. Coloque um lote de 8-12 arrays em uma caixa de armazenamento com uma plataforma de adesivo elevada para que eles possam ser isolados em uma única corrida. Coloque as matrizes para que a extremidade do conector da matriz esteja na plataforma adesiva com a extremidade fibrada da matriz pendente (Figura 6) para evitar que as fibras grudem no adesivo e se retirem e garantam um revestimento parileno uniforme sobre as fibras.
3. Cubra as matrizes em um sistema de deposição Parylene C até uma espessura de 800 nm em uma sala de limpeza, usando equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados, conforme definido pela sala de limpeza individual que está sendo usada.
   NOTA: Aqui, o EPI foi definido como sapatos de limpeza, terno, cobertura da cabeça, óculos, máscara e luvas de látex. Deve-se notar que este é um EPI padrão para entrar em uma sala de limpeza. Esta etapa pode ser terceirizada para uma empresa de revestimento parileno por uma taxa; no entanto, um serviço comercial pode ser capaz de revestir mais matrizes ao mesmo tempo. Cada sistema de deposição parileno C pode ter diferentes precauções de segurança. Entre em contato com o técnico antes de usar para garantir a segurança do usuário.
4. Remova o conector de acasalamento usado como máscara do Flex Array.
5. Coloque as matrizes em uma nova caixa para armazenamento até que estejam prontos para uso.

7. Métodos de preparação de ponta

NOTA: Duas preparações de ponta nesta seção usam lasers para cortar fibras. Epi adequado, como óculos resistentes aos comprimentos de onda utilizados, devem ser sempre usados ao usar o laser, e outros usuários de laboratório nas proximidades do laser também devem estar em EPI. Embora os comprimentos de fibra listados nestas etapas sejam comprimentos recomendados, os usuários podem tentar qualquer comprimento que se adapte às suas necessidades. O usuário deve escolher um dos seguintes métodos de preparação de ponta, pois o corte da tesoura sozinho não será suficiente para re-expor o ^eletrode25.

1. Corte de alumínio de ítrio dotado de neodímio (Nd:YAG) corte a laser
   1. Corte as fibras para 550 μm com tesoura cirúrgica.
   2. Use um laser pulsado de 532nm Nd:YAG (5 mJ/pulse, 5 ns de duração, 900 mW) para cortar 50 μm da ponta das fibras para re-expor o carbono sob o Parileno C (geralmente leva 2-3 pulsos).
      1. Alinhe as pontas de fibra usando o estereoscópio embutido que vem com este sistema laser.
         NOTA: Este sistema permite que o usuário alinhe uma janela (aqui, 50 μm x 20 μm (altura x largura)) foi usado para abranger a extremidade da fibra.
      2. Concentre o estereoscópio na extremidade da fibra em ampliação de 500x para um corte preciso e preciso.
         NOTA: Parileno C vai ablular ligeiramente (<10 μm) da ponta deixando uma ponta cíndrica e contundente.
2. Maçarico Afiando25,26,27
   1. Corte as fibras para 300 μm com tesoura cirúrgica.
   2. Submergir a matriz em um prato de água deionizada, lado do conector para baixo, e preso ao fundo do prato com uma pequena quantidade de massa.
   3. Use uma câmera de caneta para alinhar as fibras com a superfície da água para que as fibras mal toquem a superfície da água.
   4. Ajuste uma chama de maçarico butano para 3-5 mm e execute-a sobre a parte superior das fibras em um movimento de ida e volta para afiar fibras.
      NOTA: As pontas de fibra brilharão laranja quando a chama passar por cima delas.
   5. Remova a matriz da massa e inspecione-a sob um estereoscópio para pontas pontiagudos sob ampliação de 50x.
      NOTA: Se forem observadas pontas pontiagudas, então não é necessário mais maçarico. Se as pontas parecerem contundentes, repita as etapas 7.2.2-7.2.5.
3. Corte de laser ^UV28
   NOTA: O laser UV só pode ser usado em sistemas de força de inserção zero (ZIF) e Wide Board no momento devido ao grande ponto focal do laser UV usado ser maior que o tom das fibras de carbono Flex Array.
   1. Corte as fibras de carbono para 1 mm com uma tesoura cirúrgica.
   2. Fixar um laser UV a três estágios motorizados configurados ortogonicamente.
      NOTA: O laser UV é um semicondutor de nitrito de gálio de 405 nm multimode (InGaN) com potência de saída de 1,5 W e comprimento de onda de 405 nm.
      1. Certifique-se de que o laser tenha um feixe contínuo para alinhamento e corte rápidos e eficazes.
   3. Proteja a matriz no lugar para manter um plano de eletrodos ainda nivelado para que o laser passe. Certifique-se de que a matriz seja mantida a uma distância apropriada do laser para que as fibras estejam em luz com o ponto focal do laser. Para isso, forneça uma potência menor ao laser e ajuste a distância para melhor foco na ^fibra28.
   4. Mova o ponto focal laser UV através do plano de fibra a uma velocidade de 25 μm/s para cortar as fibras ao comprimento desejado (aqui, todas as fibras são cortadas para 500 μm).
      NOTA: As fibras emitirão uma luz brilhante antes de serem cortadas. Armazene as fibras após o tratamento até que estejam prontas para serem revestidas com um polímero condutor.

8. Poly (3,4-ethylenedioxythiophene):p-toluenesulfonato (PEDOT:pTS) revestimento condutor para impedância baixada

1. Misture soluções de 0,01 M 3,4-etilenodioxilofene e 0,1 M de sódio p-toluenesulfonate em 50 mL de água DI e mexa durante a noite em uma placa de mexida (~450 rpm) ou até que nenhuma particulada possa ser observada na solução.
   NOTA: Armazene a solução em um recipiente resistente à luz. Leve à geladeira a solução após a mistura para manter a solução útil por até 30 dias.
2. Execute uma digitalização de impedância de 1 kHz usando os mesmos parâmetros de antes (etapas 5.2-5.3) em 1x PBS. Note quais fibras têm uma boa conexão (<1 MΩ, tipicamente 14-16 de 16 fibras).
3. Eletroplaca com PEDOT:pTS para diminuir a impedância dos eletrodos.
   1. Submergir as pontas de fibra na solução PEDOT:pTS.
   2. Siga os passos levantados na etapa 5.2, mudando a solução PBS 1x para PEDOT:pTS e curtando todas as conexões à placa para o canal atual aplicado.
   3. Aplique 600 pA por fibra boa para 600 s usando um potencialiostat.
   4. Desligue a célula e deixe descansar por 5 s no final da corrida.
4. Remova as fibras da solução e enxágue-as em água DI.
5. Retome impedâncias de 1 kHz para verificar se as fibras foram revestidas com sucesso (use os mesmos parâmetros listados nas etapas 5.2-5.3).
   NOTA: Boas fibras são designadas como qualquer fibra com uma impedância inferior a 110 kΩ.

9. Conectando fios de terra e referência

1. Raspe suavemente Parylene C do chão e faça referência à placa usando pinças. Curta o solo e as vias de referência em pares neste design de placa.
   NOTA: As vias de terra e referência podem ser encontradas perto do conector na matriz Flex e são os quatro pequenos círculos dourados próximos aos conectores. Os usuários só precisarão remover o Parileno C das vias mais próximas das fibras de carbono para medições.
2. Corte dois comprimentos de 5 cm de fio de prata isolado com uma lâmina de barbear. Desinsula as extremidades dos fios 2-3 mm de uma extremidade para serem anexadas ao Flex Array e ~10 mm das extremidades opostas para permitir um aterramento e referência mais fácil durante a cirurgia.
3. Aqueça o ferro de solda de volta a 600 °F. Aplique uma pequena quantidade de fluxo nas vias.
4. Insira um fio (extremidade exposta de 2-3 mm) em cada uma das vias ePhys na placa. Aplique solda na parte superior das vias (Figura 7A). Deixe a sonda esfriar e, em seguida, vire-a para aplicar uma pequena quantidade de solda na parte traseira da via (Figura 7A).
5. Usando uma tesoura cirúrgica, corte qualquer fio exposto saindo do monte de solda traseira, pois isso ajuda a reduzir o ruído visto na gravação (Figura 7B).
6. Coloque as matrizes de volta na caixa de armazenamento, dobrando os fios para trás e para longe da fibra. Fixar os fios na fita adesiva para evitar possíveis interações entre fios de fibra (Figura 7C).

10. Procedimento cirúrgico

NOTA: O córtex de rato foi usado para testar a eficácia das fibras preparadas a laser UV, pois esta foi descrita anteriormente ^7,20. Estas sondas trabalharão no nervo devido à sua geometria semelhante e níveis de impedância às fibras preparadas pelo maçarico. Esta cirurgia foi realizada com muita cautela para validar que o laser UV não alterou a resposta dos eletrodos.

1. Anestesia um rato long evans masculino adulto usando uma combinação de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confirme anestesia com um teste de beliscão do dedo do dedo. Aplique pomada nos olhos para evitar que os olhos do rato sequem durante a cirurgia.
2. Crie uma craniotomia de 2 mm x 2 mm acima do córtex motor do hemisfério direito. Identifique o canto inferior esquerdo da craniotomia medindo 1 mm anterior de bregma e 1 mm lateral de linha média.
3. Monte a matriz em um instrumento estereotaxico, e zero o instrumento estereotaxic na dura baixa suavemente as fibras até que toquem a superfície da dura. Levante a matriz para longe do local cirúrgico e mova-a para o lado até que esteja pronta para inserção.
4. Ressesse o dura puxando suavemente uma agulha com uma extremidade farpada sobre a superfície do tecido. Uma vez que uma parte da dura se abra ao cérebro, use um par de fórceps finos para ajudar ainda mais a afastar a dura.
5. Insira as fibras na craniotomia e 1,2 mm no cérebro usando um instrumento estereotaxico, baixando lentamente à mão.
6. Registos de ePhys para 10 min com um headstage e preamplifier específico para ePhys.
   1. Defina o filtro de passagem alta do pré-amplificador para processar o sinal a 2,2 Hz, antialias a 7,5 kHz e amostra de 25 kHz.
      NOTA: Para estas medidas, apenas a atividade espontânea é registrada. Nenhum estímulo é aplicado.
7. Eutanásia
   1. Coloque o rato sob isoflurane a 5% abaixo de 1 L/min de oxigênio até que os sinais de vida tenham cessado (20-30 min). Confirme a eutanásia com decapitação.

11. Classificação de picos

1. Use software de classificação de picos para classificar e analisar os dados usando métodos relatados ^{anteriormente8}.
2. Use um filtro de alta passagem em todos os canais (canto de 250 Hz, ^4ª ordem Butterworth) e defina o nível de detecção de forma de onda para -3,5 × limite RMS.
   1. Use um modelo gaussiano para agrupar e espigões com características semelhantes. Combine e os clusters médios de pelo menos 10 formas de onda para incluir em análises posteriores.
   2. Elimine ou exclua todas as formas de onda que não são picos do conjunto de dados.
3. Exportar dados uma vez que todos os canais tenham sido classificados e usar software de análise para traçar e analisar ainda mais as formas de onda.

12. Escaneamento de imagens microscópicas eletrônicas (SEM)

NOTA: Esta etapa tornará os arrays inutilizáveis e deve ser usado apenas para inspecionar os resultados do tratamento de ponta para verificar se as matrizes estão sendo processadas corretamente. Esta etapa não precisa ser feita para construir uma matriz de sucesso. Resumido abaixo está um esboço geral do processo SEM; no entanto, os usuários que não utilizaram o SEM anteriormente devem receber ajuda de um usuário treinado.

1. Corte a extremidade fibra do PCB e monte-a em um stub SEM mascarado de fita de carbono. Coloque as matrizes em uma pequena plataforma de fita de carbono empilhada (4-5 camadas) para evitar que as fibras de carbono grudem no stub SEM.
2. Sputter-coat as matrizes com ouro (100-300 Å) seguindo procedimentos descritos pelo fabricante do revestimento de sputter dourado.
3. Para inspecionar os efeitos do tratamento da ponta, imagem as matrizes em um SEM a uma distância de trabalho de 15 mm e 20 kV de resistência ao feixe.
   NOTA: Os arrays podem ser imagens sem revestimento de sputter sob um vácuo baixo, como mostrado na Figura 8D para fibras cortadas a laser UV. Para esta configuração, recomenda-se ter uma distância de trabalho de 11-12 mm e uma resistência ao feixe de 4 kV.

Validação da dica: Imagens SEM
Trabalhos anteriores20 mostraram que o corte da tesoura resultou em impedâncias não confiáveis como Parileno C dobrado em todo o local de gravação. O corte da tesoura é usado aqui apenas para cortar fibras ao comprimento desejado antes de processar com um método adicional de corte de acabamento. Foram utilizadas imagens SEM das pontas para determinar o comprimento de carbono exposto e a geometria da ponta (Figura 8).

As fibras cortadas a laser de Tesoura e Nd:YAG foram previamente revisadas17,20. As fibras cortadas por tesoura (Figura 8A) têm geometrias de ponta inconsistentes, com Parileno C dobrando sobre a extremidade quando cortada20. As fibras cortadas a laser Nd:YAG permanecem consistentes na área, forma e impedância do local de gravação (Figura 8B). As fibras maçaricos20 levam ao maior tamanho de eletrodo e variabilidade de forma e uma ponta afiada, permitindo a inserção em tecido resistente. Em média, 140 μm de carbono foram reass exposidos, com uma área de transição suave entre o isolamento de carbono e Parileno C (Figura 8C). As fibras cortadas a laser UV foram semelhantes às fibras maçaricadas, mostrando 120 μm de carbono expostos da ponta (Figura 8D). As impedâncias indicaram que os métodos de corte de ponta de laser UV ou maçarico são adequados para ePhys e são soluções viáveis para laboratórios sem acesso a um laser Nd:YAG.

Validação da dica: gravação elétrica
A Figura 9 mostra as impedâncias resultantes de cada método de preparação usando Flex Arrays. Os valores resultantes estão dentro de uma faixa apropriada para gravação de ePhys. As fibras cortadas a laser Nd:YAG resultaram na menor área de superfície, mas nas maiores impedâncias, mesmo com o revestimento PEDOT:pTS (carbono nu: 4138 ± 110 kΩ; com PEDOT:pTS: 27 ± 1,15 kΩ; n = 262). Isso é seguido pela relação inversa em maçarico (carbono nu: 308 ± 7 kΩ; com PEDOT:pTS: 16 ± 0,81 kΩ; n = 262) e UV cortado a laser (carbono nu: 468 ± 85,7 kΩ; com PEDOT:pTS: 27 ± 2,83 kΩ; n = 7) fibras que têm uma grande área de superfície e baixos impedâncias. No entanto, em todos os casos, as fibras revestidas de PEDOT:pTS estão abaixo do limiar de 110 kΩ estabelecido anteriormente para indicar um bom eletrodo de impedância baixa.

Gravações agudas de ePhys foram retiradas de um rato Long Evans agudamente implantado com uma matriz ZIF com uv cortado a laser e fibras tratadas pEDOT:pTS para demonstrar a viabilidade deste método. O ePhys já foi testado e comprovado com fibras tratadas com corte de tesoura20 e Nd:YAG-17 e maçarico7,8 e por isso não foi revalidado neste texto. Gravações agudas de quatro fibras de tratamento a laser UV (2 mm de comprimento) que foram simultaneamente implantadas no córtex motor de rato (n = 1) são apresentadas na Figura 10. Três unidades foram encontradas em todas as fibras, sugerindo que o tratamento das fibras com o laser UV barato é semelhante a outros métodos de corte que permitem que a fibra de carbono regisse unidades neurais, como seria de esperar pelas SEMs e impedâncias. Embora os arrays de fibra de carbono sejam facilmente construídos e modificados para atender às necessidades do usuário, deve-se notar que a validação adicional é necessária para algumas compilações (Tabela 3), enquanto outras são menos adequadas para determinadas tarefas finais.

Parileno Comercial C
Matrizes revestidas comercialmente foram determinadas a ter uma espessura de Parileno C de 710 nm pelo fornecedor, bem dentro da faixa alvo de isolamento. As matrizes foram preparadas para gravações de ePhys usando a preparação da ponta do maçarico. As impedâncias foram tomadas após a elaboração das dicas e comparadas aos dados existentes. Uma sonda revestida de maçarico e PEDOT:pTS tinha uma média de 14,5 ± impedância de 1,3 kΩ em 16 fibras. Foram tiradas imagens sem da ponta e da haste para comparar o depoimento de Parylene C (Figura 11 A,B, respectivamente). Esses resultados mostram que o uso de um fornecedor comercial não alterou os valores de impedância esperados, sugerindo que esta será uma substituição igualmente viável ao depoimento na sala de limpeza da universidade.

Análise de custos do dispositivo
Desde que todas as ferramentas e materiais a granel (por exemplo, epóxies, solda) sejam acessíveis ao pesquisador, uma taxa de usuário parileno C de US$ 41 e um lote de 8 sondas, o custo total dos materiais é de US$ 1.168 (US$ 146 por sonda). O esforço pessoal (Tabela 4) é ~25 h para o lote. Se usar uma etapa de fabricação substituída, o custo das sondas variará de acordo com o custo comercial de revestimento Parylene C ($500-800 citado). O tempo para as etapas de construção (Tabela 4) é agrupado para todos os casos de uma tarefa repetida para a simplicidade. Os tempos de construção para projetos com um tom maior (Wide Board e ZIF) são drasticamente reduzidos à medida que as etapas manualmente intensivas (por exemplo, colocação em fibra de carbono) são mais fáceis e rápidas de serem concluídas.

Figura 1: Conectores e placas de circuito impresso associadas. (A) Placa larga com um dos dezesseis conectores necessários no inset (barra de escala de entrada = 5 mm). (B) ZIF e um de dois conectores e uma mortalha. (C) Flex Array com um conector de 36 pinos; barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Etapas de solda e isolamento para o Flex Array. (A) Coloque a solda para os pinos do conector inferior. (B) Pinos traseiros fixados no lugar com os pinos dianteiros prontos para solda. (C) Conjunto atrasado epóxi isolado Flex Array; note que o epóxi de conjunto atrasado não cobre a referência e as vias de solo de ambos os lados. (D) Backside do Flex Array com uma faixa de epóxi de conjunto atrasado através das vias de almofada (não as vias de terra e referência) e enrolada ao redor da lateral da placa em direção à borda do conector. Barra de escala = 0,5 cm (B) e 1 cm (A, C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Aplicando epóxi prateado e alinhando fibras de carbono entre os traços do Flex Array. Capilares foram destacados com uma sobreposição branca. (A) O fim do capilar se encaixa entre os traços para obter (B) epóxi prateado limpo (denotado com setas no final do capilar e dentro dos traços) deposição sem derramamento fora dos pares de traços. (C) As fibras de carbono são colocadas no epóxi e, em seguida, (D) endireitadas com uma capilar limpa. Barras de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O isolamento com epóxi UV ( A) UV Application (A) é aplicado utilizando um capilar limpo e duas gotas de epóxi UV (marcado com sobreposições brancas). O epóxi UV é aplicado em gotículas de 0,25-0,75 mm de diâmetro até que o epóxi UV forme uma bolha lisa sobre a parte superior dos traços. (B) Epóxi UV é curado sob luz UV. O Flex Array é colocado em massa em um bloco de madeira para facilitar o movimento e alinhamento sob a luz UV. A luz UV é mantida com um suporte ~1 cm acima da extremidade do Flex Array. O Inset (B) mostra o perfil lateral de um Flex Array devidamente isolado por epóxi UV. A bolha epóxi UV em ambos os lados da placa tem aproximadamente 50 μm de altura. Barras de escala = 500 μm (A e inset B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Configuração para medidas de impedância. Todas as peças são rotuladas, e conectores e adaptadores do sistema são dependentes do sistema. O PBS é estrelado como a solução é trocada por PEDOT:pTS mais tarde na compilação; no entanto, a configuração é idêntica de outra forma. Abreviaturas: PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; PEDOT:pTS = poly (3,4-ethylenedioxythiophene):p-toluenesulfonate. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Flex Array preparado para revestimento Parylene C. O Flex Array é fixado em uma plataforma de espuma elevada com fita adesiva lateral para cima durante o processo de revestimento. Barra de escala =10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Fios de terra e referência ligados ao Flex Array finalizado. Solder foi aplicado em cada lado da via em ambos os lados da placa (A) para criar um vínculo seguro. EPhys vias são rotulados no tabuleiro como GND e Ref e emparelhados em lados opostos da placa um do outro. Há duas vias adicionais também rotuladas de GND e Ref2. Ambas as vias GND são curtas juntas. O Ref2 deve ser usado em experimentos eletroquímicos. O excesso de fio (A) é denotado com uma caixa vermelha e é removido (B) da parte traseira da sonda (caixa vermelha mostra onde o fio costumava estar) para ajudar na redução de ruído e manuseio da sonda. (C) Conjunto Flex Final armazenado para uso futuro. Observe que as vias GND e Ref emparelhadas nesta placa tornam-na designada para gravações de ePhys. Barras de escala = 200 μm (A, B). Abreviaturas: ePhys = eletrofisiologia; GND = solo; Ref = referência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Imagens SEM de fibras com diferentes técnicas de corte de ponta. (A) Fibra cortada por tesoura com muito pouco carbono exposto. (B) Corte a laser Nd:YAG. (C) Fibra remada com ~140 mm de carbono exposto da ponta. (D) Fibras cortadas a laser UV com ~120 mm de carbono expostos da ponta. Setas vermelhas indicam a área de transição entre Parileno C e fibra de carbono nua. Barras de escala = 5 μm (A), 10 μm (B), 50 μm (C, D). Abreviaturas: SEM = escaneamento microscópico eletrônico; Nd:YAG = Granada de alumínio de ítrio dopado de neodímio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Diferenças de impedância entre apenas a aplicação do tratamento (carbono nu exposto) e com a adição de PEDOT:pTS. Em todos os casos, a adição de PEDOT:pTS diminui a impedância por uma ordem de magnitude. Tamanho da amostra: Nd:YAG = 262, Maçarico = 262, UV = 7. A diferença de tamanho da amostra UV deve-se à novidade do método de preparação; no entanto, ele mostra uma faixa semelhante ao maçarico, como esperado. Os dados de impedância são expressos como ± erro padrão. Abreviaturas: PEDOT:pTS = poly(3,4-ethylenedioxythiophene):p-toluenesulfonate; Granada de alumínio de ítrio dopado de neodímio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Dados de espetamento eletrofisiológico agudo de quatro eletrodos cortados a laser UV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Matrizes comerciais revestidas de Parileno C. (A) A matriz afiada mostra o afiação uniforme em todas as fibras indicando que não há desvantagens no revestimento comercial. (B) Após o maçarico, a transição (caixa vermelha) entre fibra de carbono nua e Parileno C não mostra diferença discernível entre as matrizes revestidas em uma instalação de limpeza. Barras de escala = 200 μm (A) e 10 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Cada PCB tem um conector e tom diferentes associados a ele. Abreviação: PCB = placa de circuito impresso.

Tabela 2: Faixa típica de impedâncias após cada etapa de construção (n = 272). *n = 16. Sondas tratadas com PEDOT:pTS acima de 110 kΩ ainda podem registrar sinais; no entanto, todos os eletrodos tratados normalmente caem abaixo desse valor. Abreviaturas: PEDOT:pTS = poly(3,4-ethylenedioxythiophene):p-toluenesulfonate; Granada de alumínio de ítrio dopado de neodímio.

Tabela 3: Usos validados de cada placa com os métodos de corte descritos. Todos os métodos de corte incluíam eletrodeposição de PEDOT:pTS. 'Não Viável' indica que um fator de forma do design impede que este tratamento de ponta seja testado neste momento (ou seja, campo de fibra). Abreviaturas: Granada de alumínio de ítrio dopado de neodímio; SEM = microscopia eletrônica de varredura; ePhys = eletrofisiologia; ZIF = força de inserção zero.

Tabela 4: Tempo necessário para cada etapa de um processo de fabricação. A soldagem do conector e dos fios de referência e terra foram combinados aqui para simplificar a lista de atividades. Abreviaturas: PEDOT:pTS = poly(3,4-ethylenedioxythiophene):p-toluenesulfonate; Granada de alumínio de ítrio dopado de neodímio.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.