Caracterização das Células Endoteliais de Crescimento Sanguíneo (CBO) do Sangue Periférico Porcino

O endotélio é uma estrutura dinâmica e altamente complexa e um componente vital da parede vascular. Ele reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos para fornecer uma interface física entre o sangue circulante e os tecidos circundantes. Sabe-se que essa estrutura heterogênea desempenha várias funções, como angiogênese, inflamação, vasorregulação e hemostasia1,2,3,4. As células endoteliais da veia umbilical humana são um tipo celular amplamente estudado para avaliar a funcionalidade das células endoteliais. No entanto, a variabilidade do lote específico do paciente, o fenótipo inconsistente e a eficiência mínima de divisão sugerem a necessidade de determinar uma fonte celular que possa melhorar todas essas características⁵.

A obtenção de uma população homogênea de células endoteliais primárias pode ser tecnicamente desafiadora, e as células endoteliais primárias não possuem alta capacidade^{proliferativa6}. Assim, para estudar a regeneração vascular e avaliar processos fisiopatológicos, vários grupos têm tentado obter e avaliar diferentes tipos de células endoteliais derivadas do sangue periférico, por exemplo, células progenitoras endoteliais (CPEs) ou células endoteliais de crescimento sanguíneo (BCAB)6,7,8,9 . As CPEs precoces fusiformes originam-se de células-tronco hematopoéticas (CTHs) e têm potência de crescimento limitada e capacidade angiogênica limitada de produzir células endoteliais maduras. Além disso, assemelham-se muito aos monócitos inflamatórios. Além disso, sua capacidade de se diferenciar em células endoteliais maduras, proliferantes e funcionais ainda é discutível6,7,9,10. A cultura contínua de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) pode dar origem a uma população secundária de células conhecidas como CPEs de crescimento tardio, BOECs ou células formadoras de colônias endoteliais (CEFCs)6,7,9,10. Medina et al., em 2018, reconheceram as limitações das CPEs, a ambiguidade de sua nomenclatura, juntamente com uma falta geral de concordância com muitos tipos celulares distintos continuamente agrupados sob CPEs¹¹. Em contraste, os BOECs tornaram-se reconhecidos por seu papel no reparo vascular, saúde e doença e terapia celular. Estudos futuros e uso terapêutico dessas células dependerão de protocolos para derivar consistentemente esses tipos celulares de células progenitoras circulantes.

Células primárias como as BOECs podem ser usadas como substituto para a obtenção de células endoteliais maduras altamente proliferativas⁶. As EEP são fenotipicamente distintas das CPEs precoces e exibem características endoteliais típicas, como morfologia de paralelepípedos e expressão de junções aderentes e^cavéolas12. O perfil gênico de Hebbel et al.13,14,15 constatou que as BOECs ou ECFCs são as verdadeiras células endoteliais^, pois promovem a formação de microvasculares e grandes vasos. Assim, as EEP podem ser utilizadas como ferramenta para avaliar processos fisiopatológicos e variação genética¹⁶. Também são considerados uma excelente fonte celular para terapia celular para regeneração vascular¹⁷. Portanto, um protocolo padronizado para derivar consistentemente essas células altamente proliferativas é essencial.

Enquanto os BOECs fornecem uma ferramenta poderosa para estudar a variação patofisiológica e genética humana, uma fonte mais homogênea de BOECs pode fornecer resultados experimentais e terapêuticos mais robustos e confiáveis. Homogeneidade superior pode ser obtida com o uso de fontes de células xenogênicas derivadas de animais geneticamente semelhantes criados em condições semelhantes¹⁸. Enquanto fontes de células xenogênicas são propensas a provocar uma resposta imune do hospedeiro, estratégias de imunomodulação estão sendo desenvolvidas com o objetivo de gerar animais imunocompatíveis e produtos de origem animal, incluindo células. Os porcos, em particular, são uma fonte abundante de sangue periférico e são comumente usados para estudar dispositivos médicos e outras terapias devido às semelhanças anatômicas e fisiológicas com os seres humanos. Assim, este estudo refina o protocolo para o isolamento e expansão de BOECs altamente proliferativas a partir de sangue periférico suíno. O protocolo detalhado abaixo é um método simples e confiável para obter um grande número de BOECs a partir de um volume relativamente pequeno de sangue. As culturas podem ser expandidas através de várias passagens para gerar milhões de células a partir de uma única amostra de sangue.

Todos os estudos em animais foram aprovados pelos respectivos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Medical College of Wisconsin e na Mayo Clinic.

OBS: Neste estudo, foram utilizados suínos domésticos cruzados Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), machos e fêmeas, de 40-80 kg, com 3-6 meses de idade.

1. Coleta de sangue periférico suíno

1. Prepare materiais.
   1. Diluir a solução de heparina a 100 U/mL em solução salina estéril.
   2. Adicionar 3-4 mL de solução de heparina a cada um dos dois tubos cônicos de 50 mL e duas seringas de 60 mL.
   3. Introduzir solução de heparina não diluída (1.000 U/ml) num tubo de extensão.
   4. Conecte uma agulha 19 G a uma extremidade do tubo de extensão preenchido com heparina e uma seringa de 60 mL contendo heparina à outra extremidade.
2. Anestesiar um porco de acordo com as políticas institucionais
   1. Administrar uma injeção IM de atropina (0,05 mg/kg), tiletamina/zolazepam (2-5 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg) para induzir a anestesia.
      OBS: a anestesia adequada é alcançada quando o animal está inconsciente e os músculos mandibulares não rígidos.
   2. Coloque o animal na posição supina e coloque toalhas enroladas em ambos os lados para proporcionar estabilidade.
   3. Aplique uma pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   4. Fornecer suporte térmico durante a anestesia, incluindo cobertores, almofadas de aquecimento e/ou mesa de procedimento aquecida.
3. Limpe a área da virilha femoral com solução de esfoliação de betadina.
4. Puncione a veia ou artéria femoral com a agulha 19 G e retire lentamente (~1-2 mL/s) 50 mL de sangue para dentro da seringa.
   Observação : desenhar muito rápido pode danificar as células.
5. Deixando a agulha no lugar, torça imediatamente o tubo de extensão e desconecte a seringa de 60 mL
6. Transfira lentamente o sangue para um tubo cônico de 50 mL contendo heparina.
7. Tampe bem o tubo cônico de 50 mL, inverta suavemente algumas vezes para misturar e coloque no gelo.
8. Conecte a seringa restante contendo heparina de 60 mL ao tubo de extensão, destorça o tubo de extensão e retire lentamente mais 50 mL de sangue para a seringa.
9. Retire imediatamente a agulha da artéria ou veia e retire lentamente o sangue restante do tubo de extensão para a seringa.
10. Desconecte a seringa de 60 mL do tubo de extensão e transfira lentamente o sangue para o tubo cônico de 50 mL contendo heparina restante.
11. Tampe bem o tubo cônico de 50 mL, inverta suavemente algumas vezes para misturar e coloque no gelo.
12. Aplicar hemostasia de pressão na região da virilha femoral do porco.
13. Recuperar o porco de acordo com as políticas institucionais. Monitorar continuamente o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter o decúbito esternal e retornar à área regular do alojamento/canil.

2. Isolamento de células mononucleares

1. Diluir o sangue 1:1 com solução salina tamponada com fosfato (PBS) em quatro tubos cônicos de 50 mL.
   NOTA: Este trabalho precisa ser realizado em uma capela de cultura celular usando uma técnica asséptica para evitar a contaminação da cultura celular.
2. Adicionar 25 mL de solução de gradiente de densidade pronta para uso à temperatura ambiente a oito tubos cônicos de 50 mL.
3. Pipetar muito lentamente 25 mL de sangue/solução salina ao longo do interior de cada solução de gradiente de densidade contendo 50 mL de tubo cônico, segurando o tubo em um ângulo acentuado em relação à ponta da pipeta.
   NOTA: A solução de sangue deve cobrir suavemente sobre a solução de gradiente de densidade e manter uma interface bem definida.
4. Centrifugar os tubos por 30 min a 560 x g e temperatura ambiente (TR).
   NOTA: Para obter melhores resultados, desative o freio centrífugo, se possível.
5. Use uma pipeta fina para coletar cuidadosamente o buffy coat (camada turva de células mononucleares acima da solução de gradiente de densidade e abaixo do plasma transparente) de cada tubo e distribua uniformemente em dois novos tubos cônicos de 50 mL. Eliminar a solução de gradiente de densidade que contém tubos.
   NOTA: Colete o máximo possível da pelagem bufante enquanto coleta o mínimo possível da solução de gradiente de densidade e plasma.

3. Lavagem e chapeamento de células

1. Revestir uma placa de 6 poços com fibronectina.
   1. Fazer uma solução-mãe de fibronectina plasmática humana diluindo-a a 1 mg/mL em água estéril. Conservar as alíquotas a -20 °C.
   2. Completar 3,6 ml de uma solução funcional de fibronectina diluindo 600 μL de solução de reserva de fibronectina em 3 ml de PBS.
   3. Transfira 600 μL da solução de trabalho de fibronectina para cada poço de uma placa de 6 poços e agite suavemente até revestir uniformemente.
   4. Aguarde 30 min para que a fibronectina cubra os poços e aspirar suavemente a solução para fora de cada poço.
2. Enquanto espera que a fibronectina revestire, lave as células mononucleares
   1. Recarga dos tubos com até 45 mL de PBS
   2. Centrifugar por 5 min a 560 x g e 4 °C com freio baixo. Aspirar o sobrenadante de ambos os tubos.
   3. Ressuspender cada pastilha de células em 25 mL de PBS.
   4. Repita para lavar uma segunda vez.
3. Ressuspender cada pastilha de células em 5 mL de PBS e adicionar 15 mL de solução de cloreto de amônio a 0,8% a cada tubo.
   NOTA: Este passo é para lisar os glóbulos vermelhos restantes.
4. Incubar no gelo por 10 min.
5. Lave as células como antes, enchendo os tubos com PBS e centrifugando por 5 min a 560 x g e 4 °C com freio baixo. Aspirar o sobrenadante de ambos os tubos.
6. Ressuspender cada pastilha de célula em 25 mL de PBS e repetir para lavar uma segunda vez.
7. Ressuspender cada pastilha celular em 6 mL de meio de cultura EGM-2 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1x solução antibiótico/antimicótico contendo 10.000 U/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina.
   NOTA: O meio de cultura EGM-2 consiste em meio de cultura EBM-2 suplementado com 200 μL de hidrocortisona, 2 mL de fator de crescimento de fibroblastos humanos (hFGF-B), 500 μL de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), 500 μL de análogo recombinante do fator de crescimento semelhante à insulina (R₃ IGF-1), 500 μL de ácido ascórbico, 500 μL de fator de crescimento epidérmico humano (hEGF), 500 μL de gentamicina/anfotericina e 500 μL de heparina por 500 mL.
8. Transfira suavemente 2 mL da suspensão celular para cada poço da placa de 6 poços revestida com fibronectina e agite suavemente até revestir uniformemente.
   NOTA: O objetivo é semear o maior número possível de células para maximizar o número de colônias endoteliais que se formarão.

4. Cultura celular

1. Incubar as células a 37 °C, 5% CO₂ e 100% de umidade.
2. No dia seguinte, adicione delicadamente 1 mL de meio de cultura fresco a cada poço.
   NOTA: é importante ser suave para não perturbar as células que são fracamente aderentes ao revestimento da fibronectina.
3. No dia seguinte, realizar a troca do meio de cultura aspirando suavemente 1,5 mL de meio de cultura de cada poço e substituindo-o por 1,5 mL de meio de cultura fresco.
4. Em cada um dos 5 dias seguintes, realizar suavemente uma troca completa do meio de cultura em cada poço (2 mL de meio de cultura fresco por poço).
5. Depois disso, troque suavemente o meio de cultura três vezes por semana.
6. Visualize regularmente as culturas celulares sob microscopia de luz de baixa potência (objetiva 4x).
   NOTA: Colônias de células endoteliais de crescimento sanguíneo aderente (BOEC) começarão a aparecer nos poços 7-10 dias após o plaqueamento. Os tipos celulares não aderentes serão descartados com mudanças no meio, e outros tipos celulares aderentes se dissiparão gradualmente à medida que as colônias BOEC crescem.
7. Passar os BOECs para um frasco T-75 revestido com fibronectina quando ~70%-80% confluente e continuar trocando o meio de cultura três vezes por semana.
   NOTA: A densidade de semeadura pode ser controlada através da passagem de colónias para um frasco T25. As passagens subsequentes não requerem revestimento com fibronectina, e as trocas do meio de cultura podem ser reduzidas para duas vezes por semana.
8. As células das passagens 1-3 podem ser usadas para experimentos ou transferidas para um meio de congelamento e armazenadas em nitrogênio líquido para uso futuro.

A morfologia das células cultivadas foi observada desde o início do cultivo até a observação de colônias de BOEC (Figura 1). Uma população menor de células aderentes começou a se fixar às placas de cultura e crescer, enquanto as células não aderentes foram removidas com mudanças no meio de cultura (Figura 1B). As colônias apareceram pela primeira vez no 6º dia como uma coleção de células endoteliais-símile proliferando radialmente para fora a partir de um ponto central (Figura 1D). Com o avanço da cultura, as colônias celulares tornaram-se mais densas e apresentaram morfologia de paralelepípedos semelhante às células endoteliais maduras (Figura 1F). A morfologia típica de paralelepípedos endoteliais fornece uma fácil identificação preliminar de BOECs usando um microscópio de luz.

As colônias de células endoteliais estão tipicamente prontas para passagem aos 10-14 dias de cultura. Neste momento, a placa de 6 poços normalmente produzirá ~1 milhão de células com viabilidade percentual de 93%-98%. Durante a primeira passagem, as células endoteliais se expandirão para produzir ~6-10 milhões de células em um frasco T75.

Para avaliar a morfogênese das BOECs, a matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel) foi plaqueada em placas de angiogênese de 15 poços a 10 μL/poço e incubada a 37 °C por 30 min para permitir a polimerização. As células de passagem 2 foram semeadas em placas revestidas com matriz de membrana basal e imageadas em 14 h e 24 h. Uma densidade de aproximadamente 3.500 células por poço foi capaz de formar uma rede e estruturas semelhantes a tubos. A formação de tubos foi observada dentro de 14 h para meio livre de soro (EGM-2 com suplementos, exceto FBS) e dentro de 24 h para meio de crescimento completo (EGM-2 com suplementos incluindo FBS). A adição de SFB pode ter diluído os fatores de crescimento específicos da célula endotelial (por exemplo, VEGF) e introduzido outros fatores de sinalização, resultando no atraso do processo de formação do tubo. A microscopia de contraste de fase 2D foi utilizada para obter imagens da formação de tubos em meio sem soro (Figura 2A,B) e meio de crescimento completo (Figura 2C,D). As células em ambas as condições de meios sofreram diferenciação morfológica e rapidamente se organizaram em extensas redes de estruturas capilares semelhantes a tubos. Essas estruturas eram compostas por cordões celulares organizados, assemelhando-se a redes capilares in vivo. Além disso, micrografias em aumento de 20x ilustram em detalhes a complexa organização multicelular das células endoteliais e sua diferenciação morfológica. Não foram observadas diferenças morfológicas entre as condições do meio. A extensa rede de estruturas semelhantes a tubos capilares sugere fortemente a diferenciação de células cultivadas em células endoteliais maduras e funcionais.

As BOECs foram ainda caracterizadas pela expressão do marcador de células endoteliais maduras CD31 ou da molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias-1 (PECAM1) (Figura 3A,B). BOECs mostraram expressão uniforme de CD31. Além disso, a análise por citometria de fluxo confirmou a ausência de CPEs, uma vez que as células coraram negativamente para o marcador de monócitos CD14 em comparação com o grupo controle positivo de CMSP (Figura 3C,D).

Figura 1: Imagens de microscopia óptica fenotípica. As imagens de microscopia óptica de BOECs cultivadas observadas em aumento de 10x no (A) dia 0, (B) dia 2, (C) dia 4, (D) dia 6, (E) dia 8 e (F) após a primeira passagem. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diferenciação morfológica e organização da passagem 2 BOECs. A diferenciação morfológica e a organização das BOECs de passagem 2 em estruturas semelhantes a tubos capilares foram observadas na matriz da membrana basal em 14 h para o meio livre de soro e dentro de 24 h para o meio de crescimento completo. (A) Meio sem soro a 4x, (B) Meio sem soro a 20x, (C) Meio de crescimento completo a 4x e (D) Meio de crescimento completo a 20x. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização das BOECs com CD31 e CD14. (A) As BOECs de passagem 2-3 foram coradas para PECAM1 usando anticorpo anti-CD31-FITC visto em verde e (B) imagens de microscopia de contraste de fase correspondentes. As células foram coradas em suspensão, e a suspensão foi fotografada em lâmina de microscópio. Barras de escala: 200 μm. (C) Análise por citometria de fluxo de BOECs com anticorpo CD14-AF700 em comparação com (D) células mononucleares do sangue periférico de controle positivo (PBMCs). Coloração CD14 positiva mostrada em azul e células não coradas mostradas em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.