Montagem e Caracterização de um Driver Externo para a Geração de Fluxo Oscilatório Sub-Kilohertz em Microcanais

Summary

O protocolo demonstra um método conveniente para produzir fluxo oscilatório harmônico de 10-1000 Hz em microcanais. Isso é realizado interligando um diafragma de alto-falante controlado por computador ao microcanal de forma modular.

Abstract

A tecnologia microfluidica tornou-se uma ferramenta padrão em laboratórios químicos e biológicos para análise e síntese. A injeção de amostras líquidas, como reagentes químicos e culturas celulares, é predominantemente realizada através de fluxos constantes que são tipicamente impulsionados por bombas de seringa, gravidade ou forças capilares. O uso de fluxos oscilatórios complementares raramente é considerado em aplicações, apesar de suas inúmeras vantagens como demonstrado recentemente na literatura. A significativa barreira técnica para a implantação de fluxos oscilatórios em microcanais é provavelmente responsável pela falta de sua adoção generalizada. Bombas de seringa comercial avançadas que podem produzir fluxo oscilatório, muitas vezes são mais caras e só funcionam para frequências inferiores a 1 Hz. Aqui, demonstra-se a montagem e a operação de um aparelho baseado em alto-falantes de baixo custo, baseado em alto-falantes do tipo plug-and-play que gera fluxo oscilatório em microcanais. Fluxos oscilatórios harmônicos de alta fidelidade com frequências que variam de 10 a 1000 Hz podem ser alcançados juntamente com controle de amplitude independente. Amplitudes que variam de 10 a 600 μm podem ser alcançadas em toda a gama de operação, incluindo amplitudes > 1 mm na frequência ressonante, em um microcanal típico. Embora a frequência de oscilação seja determinada pelo alto-falante, ilustramos que a amplitude de oscilação é sensível às propriedades fluidas e à geometria do canal. Especificamente, a amplitude de oscilação diminui com o aumento do comprimento do circuito do canal e a viscosidade líquida, e em contraste, a amplitude aumenta com o aumento da espessura e comprimento do tubo de alto-falante. Além disso, o aparelho não requer recursos prévios para serem projetados no microcanal e é facilmente destacável. Pode ser usado simultaneamente com um fluxo constante criado por uma bomba de seringa para gerar fluxos pulsantes.

Introduction

O controle preciso da taxa de fluxo líquido em microcanais é crucial para aplicações de laboratório em um chip, como produção de gotículas e encapsulamento¹, mistura ^2,3, e a classificação e manipulação de partículas suspensas ^4,5,6,7. O método predominantemente utilizado para o controle de fluxo é uma bomba de seringa que produz fluxos estáveis altamente controlados dispensando um volume fixo de líquido ou uma taxa de fluxo volumétrico fixo, muitas vezes limitado ao fluxo totalmente unidirecional. Estratégias alternativas para a produção de fluxo unidirecional incluem o uso da cabeça gravitacional⁸, forças capilares⁹ ou fluxo eletro-osmótico¹⁰. As bombas de seringa programáveis permitem um controle bidirecional dependente do tempo das taxas de fluxo e volumes dispensados, mas limitam-se a tempos de resposta superiores a 1 s devido à inércia mecânica da bomba de seringa.

O controle de fluxo em escalas de tempo mais curtas desbloqueia uma infinidade^de 6,11,12,13,14,15 de outras possibilidades inacessíveis devido a mudanças qualitativas na física do fluxo. O meio mais prático de aproveitar essa física de fluxo variado é através de ondas acústicas ou fluxos oscilatórios com períodos de tempo que variam de ^10-1- ^10-9 s ou 10¹ -10⁹ Hz. A extremidade superior desta faixa de frequência é acessada usando dispositivos de onda acústica a granel (BAW; 100 kHz-10 MHz) e ondas acústicas superficiais (SAW; 10 MHz-1 GHz). Em um dispositivo BAW típico, todo o substrato e a coluna de fluido são vibrados aplicando um sinal de tensão através de uma piezoelétrica ligada. Isso permite rendimentos relativamente altos, mas também resulta em aquecimento em amplitudes mais altas. Nos dispositivos SAW, no entanto, a interface líquido-sólido é oscilada aplicando tensão a um par de eletrodos interdigitados padronizados em um substrato piezoelétrico. Devido aos comprimentos de onda muito curtos (1 μm-100 μm) partículas tão pequenas quanto 300 nm podem ser precisamente manipuladas pela onda de pressão gerada em dispositivos SAW. Apesar da capacidade de manipular pequenas partículas, os métodos SAW estão limitados à manipulação de partículas locais, uma vez que a onda atenua rapidamente com distância da fonte.

Na faixa de frequência de 1-100 kHz, os fluxos oscilatórios são geralmente gerados usando elementos piezo que são ligados a um microcanal polidimetilsiloxano (PDMS) acima de uma cavidade^{projetada 16,17}. A membrana PDMS acima da cavidade padronizada se comporta como uma membrana vibrante ou tambor que pressuriza o fluido dentro do canal. Nesta faixa de frequência, o comprimento de onda é maior do que o tamanho do canal, mas as amplitudes de velocidade de oscilação são pequenas. O fenômeno mais útil nesse regime de frequência é a geração de fluxos de fluxo acústico/viscoso, que são fluxos estáveis corrigidos causados pela não linearidade inerente ao fluxo de líquidos com inércia¹⁸. Os fluxos de fluxo constantes normalmente se manifestam como vórtices de alta velocidade nas proximidades de obstáculos, cantos afiados ou micro-bolhas. Estes vórtices são úteis para misturar^19,20 e separar partículas de tamanho de 10 μm da corrente de fluxo²¹.

Para frequências na faixa de 10-1000 Hz, tanto a velocidade do componente oscilatório quanto seu fluxo viscoso estável associado são consideráveis em magnitude e útil. Fortes fluxos oscilatórios nesta faixa de frequência podem ser usados para focalizar inercial²², facilitar a geração de gotículas²³, e pode gerar condições de fluxo (números de Womersley) que imitam o fluxo sanguíneo para estudos in vitro . Por outro lado, os fluxos de streaming são úteis para mistura, captura de partículas e manipulação. O fluxo oscilatório nesta faixa de frequências também pode ser realizado usando um elemento piezo ligado ao dispositivo como descrito acima^{de 23}. Um obstáculo significativo para implementar fluxos oscilatórios através de um elemento piezo ligado é que ele requer recursos para serem projetados com antecedência. Além disso, os elementos do alto-falante ligados não são destacáveis, e um novo elemento deve ser ligado a cada dispositivo²⁴. No entanto, tais dispositivos apresentam a vantagem de serem compactos. Um método alternativo é o uso de uma válvula de relé eletromecânica²⁰. Essas válvulas requerem fontes de pressão pneumática e software de controle personalizado para operação e, portanto, aumentam a barreira técnica para testes e implementação. No entanto, tais dispositivos permitem a aplicação de amplitude e frequência de pressão definida.

Neste artigo, descreve-se a construção, operação e caracterização de um método fácil de usar para gerar fluxos oscilatórios na faixa de frequência de 10-1000 Hz em microcanais. O método oferece inúmeras vantagens, como montagem econômica, facilidade de operação e pronto para interagir com canais microfluidos padrão e acessórios, como bombas de seringa e tubos. Além disso, em comparação com abordagens similares anteriores²⁵, o método oferece ao usuário controle seletivo e independente de frequências e amplitudes de oscilação, incluindo a modulação entre formas de onda sinusoidal e não sinusoidal. Esses recursos permitem que os usuários implantem facilmente fluxos oscilatórios e, portanto, facilitem a adoção generalizada em uma ampla gama de tecnologias e aplicações microfluidas existentes atualmente nas áreas de biologia e química.

Protocol

1. Design e fabricação de moldes rápidos do protótipo

1. Abra o AutoCAD em um PC. Selecione Arquivo na barra de tarefas e selecione Abrir e navegar e clicar em um arquivo modelo tridimensional (3D) do molde do canal, tendo .dxf ou .dwg extensão.
2. Selecione o modelo inteiro clicando e arrastando uma caixa ao redor dele. Exporte o design como um arquivo .stl selecionando | de arquivos Exporte, em seguida, Outros formatos e escolha .stl da caixa suspensa. 
3. Carregue o arquivo para uma impressora estereolitográfica de resina de alta precisão (SLA), como formlabs FORM3. Despeje a resina na câmara de resina e inicie a impressão e produza o molde com as menores etapas do eixo z (25 mícrons para resina Formlabs CLEAR).
4. Aguarde que a impressão automática da peça seja concluída.
   NOTA: Moldes com características tão pequenas quanto 0,1 mm podem ser fabricados desta forma.
5. Depois de remover a peça da resina, agitar-a em isopropanol por 5 minutos para remover qualquer resina restante.
6. Seque o molde com ar ou gás nitrogênio por 2 minutos.
   NOTA: Fabricações convencionais de molde microfluido com bolachas de silício e fotolitografia com qualquer fotoresista SU8 ou KMPR também podem ser usadas para produzir um molde com características menores.
7. Cure o molde seco a 60 °C em luz UV por um máximo de 1h.

2. Fabricação de microcanal do PDMS

1. Coloque o molde em uma folha de papel alumínio. Para facilitar a delaminação do PDMS, reveste o molde com liberação de molde de silicone em 1 ou 2 passes.
2. Despeje resina PDMS e cross-linker em um copo descartável na proporção de 10:1 em peso e misture com uma colher descartável.
3. Despeje a mistura resultante sobre o molde para produzir um filme de espessura necessária. Para evitar a deformação da parede do canal grande, mantenha a espessura do PDMS de mais de 5 mm ou 3-4 vezes a espessura máxima do recurso.
4. Coloque o molde com PDMS derramado na câmara de degas e feche a tampa. Certifique-se de que o anel O sela hermeticamente a câmara.
5. Feche a válvula de escape e ligue a bomba de vácuo para iniciar a desgaseamento.
6. Desgas a mistura derramada em uma bomba de vácuo para mais de 4-6 ciclos com cada ciclo durando aproximadamente 5 min. Remova manualmente todas as bolhas restantes (em cantos e trincheiras) usando um fio fino.
7. Coloque a temperatura do forno a 80 °C e deixe pré-aqueça. Coloque a mistura no forno a 80 °C por 2h para curar.
8. Retire o molde curado do forno e deixe-o em temperatura ambiente por 10 minutos para esfriar.
9. Usando um bisturi, corte cuidadosamente as bordas do molde. Para a dominação ideal, use uma seringa para injetar isopropanol entre o molde e o PDMS curado.
10. Retire o PDMS curado do molde e corte-o em dispositivos individuais com uma lâmina de barbear. O tamanho de cada dispositivo deve variar entre 10 mm x 10 mm a 30 mm x 70 mm para ser ligado ao escorregador de vidro.
11. Faça um orifício de 1,0-3,0 mm de diâmetro na entrada e saída usando um soco de biópsia.
12. Ligue o gerador de plasma de radiofrequência portátil (RF). Para ativar o deslizamento de vidro, passe constantemente o eletrodo de arame sobre uma lâmina de vidro seco limpa várias vezes por 2 minutos. Mantenha uma abertura de arame para vidro de aproximadamente 5 mm. Coloque o lado do dispositivo do PDMS curado em contato com o escorregador de vidro ativado e, em seguida, coloque em um forno de 80 °C por 2h.
13. Corte a entrada de polietileno e a tubulação de saída no comprimento necessário e insira-as nos orifícios de entrada e saída.
14. Para evitar o descolamento do tubo durante a operação, aplique selante de silicone na superfície de contato e deixe a cura por 2h para fixar o tubo.

3. Montagem do driver oscilatório

1. Aperte as extremidades do clipe do jacaré de um par de fios de jacaré-a-pino nos terminais de um alto-falante. Aqui um alto-falante de 15 W com um cone de 8 cm foi usado, embora outros alto-falantes também possam ser usados.
2. Coloque o chip controlador aux em um recipiente isolante. Insira as extremidades do pino nas tomadas de parafuso do chip controlador aux e aperte firmemente com uma chave de fenda para garantir a conectividade.
3. Conecte uma extremidade de um cabo aux ao chip controlador e a outra extremidade a uma porta aux em um computador ou smartphone.
4. Conecte um adaptador de corrente direta (DC) de 12 V à fonte de alimentação. Ligue o chip do controlador conectando a extremidade coaxial do adaptador DC à tomada de energia.
5. Usando um navegador de internet, navegue até um site de gerador de tons online (por exemplo, https://www.szynalski.com/tone-generator/ ).
6. Digite a frequência desejada (5-1200 Hz) no aplicativo online. Role a barra de volume até a quantidade necessária (por exemplo, 100%).
7. Clique no símbolo Gerador tipo onda e selecione a forma de onda desejada (seno, quadrado, triângulo, dente de serra). Note que o padrão é uma forma de onda senoidal. Pressione Play para acionar o alto-falante.

4. Montagem do adaptador

NOTA: O conjunto completo do adaptador alto-para-tubo é ilustrado pelo esquema na Figura 1.

1. Corrija o alto-falante (Figura 1(I)) no suporte do alto-falante impresso em 3D (Figura 1(II)) (ver speakermount.stl no arquivo suplementar 1) colocando uma fita sobre a superfície curva e ambos os lados da montagem.
2. Oriente o alto-falante verticalmente com a superfície do cone do alto-falante voltada para cima. Coloque o adaptador impresso em 3D (Figura 1(III)) (ver speakertubeadapter.stl em Arquivo Suplementar 2) concentricamente no cone do alto-falante.
3. Aplique o selante de silicone generosamente ao longo das bordas do adaptador e deixe a cura por 2h.
4. Posicione o alto-falante e o suporte do alto-falante no estágio do microscópio e a fita para baixo para evitar o movimento durante a operação.
5. Corte uma ponta de micro-pipeta de 200 μL aproximadamente 2 cm de sua extremidade estreita e descarte a metade mais larga da ponta. A extremidade cônica estreita servirá como um selo de cunha para fixação reversível.
6. Conecte a tubulação de polietileno (Figura 1(V)) à saída do microcanal (Figura 1(VI)) primeiro roscando através da ponta de micro-pipeta (Figura 1(IV)), e depois através da extremidade coaxial do adaptador e finalmente para fora através do lado.
7. Coloque firmemente a extremidade estreita da ponta da pipeta na extremidade coaxial do adaptador para criar uma vedação apertada destacável.

5. Operação da configuração experimental para fluxos oscilatórios em microcanais

1. Adicione partículas rastreadoras em um frasco de 22% de peso/peso (w/w) solução de glicerol para produzir uma suspensão de flutuação neutra com uma fração de volume de 0,01%-0,1% de poliestireno líquido a 20 °C. Misture vigorosamente tremendo para produzir uma suspensão homogênea.
2. Carregue uma seringa de 1 mL com 1 mL de amostra. Monte e aperte a seringa carregada em uma bomba de seringa automática. Insira a agulha de seringa na tubulação de entrada do dispositivo para criar uma vedação impermeável.
3. Certifique-se de que o tubo de saída seja roteado através do conjunto do adaptador e em um reservatório (consulte seção anterior no conjunto do adaptador).
4. Ligue a bomba de seringa. Usando a tela sensível ao toque, selecione o tipo de seringa como Becton-Dickinson 1 mL. Em seguida, selecione Infuse. Em seguida, selecione a taxa de fluxo necessária (0-1 mL/min) ou o volume de fluxo (< 1 mL).
5. Inicie o fluxo constante usando a bomba de seringa. Aguarde até que o volume suficiente do fluido tenha fluído e o tubo de saída esteja cheio de líquido até o alto-falante.
   NOTA: A amplitude oscilatória para uma determinada configuração não variará com o fluxo de transporte constante se o tubo de saída estiver preparado.
6. Selecione uma frequência, amplitude e forma de onda necessárias na aplicação do gerador de tons conforme descrito na etapa 3.5 e pressione Play para gerar fluxo oscilatório dentro do microcanal.

6. Medição de observação e amplitude

1. Monte o dispositivo no microscópio. Configure a configuração óptica selecionando uma lente objetiva com uma ampliação entre 10x e 40x ajustando o plano focal e posicionando o estágio.
2. Para obter medições em um plano focal bem definido, certifique-se de que a profundidade de campo da lente objetiva seja menor do que a profundidade do canal por um fator de 5 ou mais.
3. Para observar o fluxo oscilatório, use uma câmera de alta velocidade com uma taxa de quadro de pelo menos o dobro da frequência de oscilação calculada usando o teorema da amostragem de Nyquist. Para uma resolução praticamente útil da forma de onda, meça pelo menos 10 pontos por período de tempo usando uma taxa de quadros > 10 vezes a da frequência de oscilação.
4. Alternativamente, para observar apenas os efeitos retificados ou de longo tempo dos fluxos pulsantes, realize imagens e stroboscópicas definindo a frequência de observação para qualquer divisor perfeito da frequência de oscilação.
5. Para imagens diretas e estroboscópicas, use uma câmera equipada com um obturador global para evitar o efeito gelatina. Em ambos os casos, mantenha o tempo de exposição consideravelmente menor do que o período de oscilação (por um fator de 10 ou mais) para evitar a est streaking.
6. Para medir a amplitude de oscilação sem uma câmera de alta velocidade, o registro em um framerate manteve-se próximo, mas não igual à taxa de quadros estroboscópicos (por exemplo, 49 quadros/s para um sinal de 50 Hz). Isso resulta em uma oscilação altamente desacelerada a partir da qual a amplitude pode ser medida com precisão.
7. Observe e regisse as medidas de amplitude.

Results

Para ilustrar a capacidade e o desempenho da configuração acima, são apresentados resultados representativos do fluxo oscilatório em um microcanal linear simples com uma seção quadrada transversal. A largura e altura do canal são de 110 μm e seu comprimento é de 5 cm. Primeiro, descrevemos o movimento das partículas rastreoures de poliestireno esféricos e como estas podem ser usadas para verificar a fidelidade do sinal oscilatório, bem como a amplitude de oscilação alcançável. Em seguida, discutimos o efeito de proprieda...

Discussion

Demonstramos o conjunto (ver protocolo passos críticos 3 e 4) e operação (ver protocolo passos críticos 5 e 6) de um aparelho externo baseado em alto-falantes para a geração de fluxo oscilatório com frequências na faixa de 10 a 1000 Hz em dispositivos microfluidos. O rastreamento de partículas de partículas suspensas é necessário para determinar a fidelidade do movimento harmônico, bem como para calibrar a amplitude de oscilação alcançável ao longo da faixa de frequências operacionais. A curva de amplitude-freqüência par...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conjunto de driver oscilatório
Fio de jacaré para pino	Adafruit	3255	Pequeno clipe jacaré para fio jumper macho (12)
Cabo auxiliar	Adafruit	2698	3,5 mm Cabo estéreo macho/macho 1 m
Chip controlador	Damgoo	TPA3116	50w+50w Amplificador de áudio de 2 canais (bluetooth e AUX)
DC adaptador	Adafruit	798	12 V DC 1A adaptador de energia de comutação regulada
Ponta de micropipeta	VWR Signature	37001-532	200 ul ponta de micropipeta
Selante de silicone	Loctite	908570	Selante impermeável de silicone transparente (80 ml)
Alto-falante	Drok	6843996	4,5 polegadas 4 Ohm 40 W alto-falante
Montagem			de alto-falanteImpresso em 3D a partir de 'speakermount.stl' em arquivos suplementares
		de alto-falante para tubo	Impresso em 3D a partir de 'speaketubeadapter.stl' em arquivos suplementares
Microchannel Manufacture
biópsia	Miltex	15110	Punção de biópsia com êmbolo (1 - 4 mm)
Desgaseificador
Copo
Colher
Corrediças de vidro	VWR Signature	16004-430	3" x 1" pré-limpo 1 mm de espessura
Molde			Si - SU-8 ou impresso em 3D
Forno	Resina Fischer Scientific
Isotemp PDMS e reticulador	Dow Chemical	4019862	Resina Sylgard 184 PDMS e reticulador (500 g)
Tubulação de polietileno	Becton Dickinson Intramedic	427440	Tubulação de polietileno (PE 60 - PE 200)
Lâminas de barbear	VWR	55411-050	Lâminas de barbear industriais de borda única
Gerador de plasma RF	Produtos	eletrotécnicos BD - 20	Gerador de alta frequência
Liberação de molde de silicone	CRC	03301	Liberação de Molde de Silicone de Grau Alimentício (16 oz)
Observação e Caracterização
Câmera	Edgertronic		SC2+
Lente	Nikon		Plan Fluor 10x
Microscópio	Nikon		Ti Eclipse estágio manual
Agulhas	Becton Dickinson	305175	Seringa PrecisionGlide 20G
	Becton Dickinson	1180100555	Monoject 1 ml
Bomba de seringa	Harvard Apparatus		Bomba de seringa programável de seringa dupla
Partículas traçadoras	Spherotech	PP-10-10	Partículas traçadoras de poliestireno 1 um