Research Article
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O presente protocolo descreve o desenvolvimento de uma caixa de ferramentas de tempo de reação serial de 5 opções de código aberto para modelos animais roedores, usando Arduino e hardware relacionado e uma caixa de ferramentas Matlab versátil, incluindo um script opcional para treinamento comportamental automatizado. Os scripts são personalizáveis e facilitam a implementação de diferentes projetos de teste e teste.
A tarefa de tempo de reação serial de 5 opções (5-CSRTT) é um teste comportamental frequentemente usado para estudar a atenção visuosespacial e a impulsividade em roedores. A tarefa exige que os animais aloquem atenção a uma matriz horizontal de cinco pequenas aberturas equipadas com fontes de luz e, dentro de uma janela de tempo limitada, cutuque uma abertura de alvo iluminada para obter uma recompensa alimentar na revista de alimentos localizada na parede oposta da câmara. A tarefa considera medidas de controle comportamental, como precisão de resposta e tempos de reação e permite inferir atenção seletiva e impulsividade. A dificuldade da tarefa pode ser controlada modificando a duração do estímulo e o desenho da tarefa em geral. O aparelho comercialmente disponível geralmente consiste em uma câmara experimental e software específico para especificar parâmetros de tarefa, mas devido a hard-e software fixos, eles representam muitas limitações sobre mudanças no design experimental geral e requisitos de tarefas específicas e a saída de dados relacionada. Este artigo explica uma alternativa totalmente personalizável baseada em um microcontrolador de placa única fácil de usar e componentes eletrotécnicos padrão, um script Arduino de acesso aberto e uma caixa de ferramentas Matlab para controle de hardware e especificações de tarefas comportamentais, respectivamente. A caixa de ferramentas inclui um procedimento de escada opcional, permitindo treinamento comportamental automatizado. A configuração completa de hardware, que pode ser instalada em câmaras personalizadas, e o software livremente adaptável incentivam tarefas não padronizadas e design de câmara. O design do sistema e o código de código aberto para controle de hardware e configuração experimental são descritos.
O 5-CSRTT é um teste comportamental, frequentemente utilizado em roedores para estudar processos de atenção visual e impulsividade 1,2,3,4,5,6, como determinar o papel do sistema colinérgico na atenção e a influência dos inibidores de recaptação de norepinefrinas em comportamentos impulsivos7 . O aparelho padrão permite observar várias medidas de controle, como precisão de resposta, tempos de reação, comportamento impulsivo e compulsivo, capacidade motora e motivação 1,2,3,4,5. Consiste em uma matriz horizontal de cinco aberturas equipadas com LED, uma revista de comida nas paredes da câmara oposta às aberturas, e luzes da casa 2,5. Em uma tarefa típica, a luz da casa é iluminada, e o início de uma sessão é marcado pela iluminação da revista de comida, onde uma pelota grátis é entregue. O curso de teste é iniciado quando o animal cutuca o nariz da revista para recuperar a pelota1. Depois disso, a luz da revista de alimentos é apagada, e o intervalo inter-ensaio (ITI) começa, durante o qual o animal deve direcionar sua atenção para as aberturas. Uma vez que o ITI decorre, uma iluminação de estímulo é apresentada em uma das aberturas 1,2,5. O estímulo é dado para um comprimento específico conhecido como duração do estímulo (DST). O animal pode responder ao estímulo enquanto está sendo apresentado ou durante uma janela de tempo limitado após o fim da DST, conhecido como porão limitado (LH). Para responder, o animal tem que cutucar o nariz da abertura do alvo e, se feito corretamente, uma recompensa é liberada na revista de alimentos 1,2,5. Caso contrário, qualquer resposta incorreta, bem como quaisquer respostas antes da apresentação de estímulo (antecipatória ou prematura) ou qualquer falha de resposta (omissão) resulta em um tempo limite (TO), durante o qual a luz da casa é desligada por uma determinada duração 1,2,5 (Figura 1). Em geral, a precisão do estímulo discriminatório mede o funcionamento da atenção, enquanto as respostas prematuras e perseverantes (respostas repetidas nas aberturas após apresentação de estímulo) são consideradas medidas de comportamento impulsivo e compulsividade, respectivamente 1,4,5,6.
Figura 1: Possíveis sequências de ensaio de um típico 5-CSRTT. Após o intervalo intertrial, a luz de estímulo é acesa por uma duração específica e, em seguida, desligada durante o intervalo de espera limitada. O rato pode responder corretamente e receber uma recompensa ou responder incorretamente e obter um tempo limite durante este tempo. Se o rato não responder a tempo, sua omissão resulta em um tempo limite. Da mesma forma, se ele responder antes da apresentação do estímulo leve, sua resposta prematura resulta em um intervalo. Outro teste começa após a coleta da recompensa ou o fim do período de intervalo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O 5-CSRTT é amplamente utilizado devido à sua flexibilidade: ao alterar parâmetros do projeto de ensaio, diferentes subcategorias de atenção podem ser investigadas. Por exemplo, enquanto o animal deve dividir sua atenção através das cinco aberturas diferentes (atenção visuosespacial), o uso de estímulos irrelevantes (por exemplo, estímulos auditivos) permite o teste de atenção seletiva ou sustentada 1,2,5,6. Para isso, a configuração experimental pode ser estendida por meio da inclusão de alto-falantes, que podem ser usados como distrativos ou até mesmo reforçosde estímulos 1,2,5,6. Além disso, a carga atencional pode ser diretamente modulada alterando a apresentação de estímulo ou randomizando a duração do ITI10. O 5-CSRTT não é usado apenas em roedores 3,7, mas recentemente foi adaptado para testar primatas não humanos 1,7,8 epeixes 7,9, mostrando ainda mais sua viabilidade. Uma caixa de ferramentas 5-CSRTT totalmente personalizável permite uma fácil adaptação do paradigma de roedores padrão para outros modelos animais. Além disso, a flexibilidade de personalização da caixa de ferramentas 5-CSRTT também incentiva a pesquisa usando projetos de tarefas não padronizados.
A caixa de ferramentas 5-CSRTT totalmente personalizável apresentada aqui contém um script Arduino para controle de hardware, programado em um ambiente de desenvolvimento integrado. Ele também consiste em uma caixa de ferramentas Matlab (versão R2019b ou mais jovem) para controle de experimentos. O protocolo a seguir explica como configurar a caixa de ferramentas 5-CSRTT com o paradigma padrão amplamente utilizado e mostra configurações opcionais para paradigmas não padronizados.
O procedimento experimental neste protocolo foi realizado seguindo as recomendações da diretiva da UE 2010/63 para o Bem-Estar dos Animais Experimentais e de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal emitida pelo Governo Federal da Alemanha e aprovada pelas autoridades locais. Como a pesquisa exigia apenas treinamento comportamental, nenhum animal foi eutanizado, e todos foram mantidos na criação após a ásição. A pesquisa foi realizada utilizando dez ratos encapuzados lister masculino (4 meses de idade no início do treinamento comportamental).
1. Habitação animal, criação e manuseio
2. Preparação do software de hardware e controle
3. Preparação do software de controle de experimentos
4. Configuração dos parâmetros utilizados na caixa de ferramentas 5-CSRTT
5. Experimento comportamental
Figura 2: O aparelho 5-CSRTT utilizado para o presente estudo. O aparelho é executado em um laptop equipado com a caixa de ferramentas 5-CSRTT, que fornece um script para controlar o microcontrolador e todos os equipamentos relacionados e vários scripts para controlar o experimento 5-CSRTT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A caixa de ferramentas totalmente personalizável é fácil de usar e baseada em um microcontrolador de placa única e componentes eletrotécnicos padrão. A Figura 3 mostra um circuito simplificado e diagrama de fiação. Toda a abertura consiste em 5 LEDs como estímulos de luz e cinco sensores infravermelhos para detectar cutucadas no nariz. A luz da casa consiste em uma tira com oito LEDs, e a revista de comida é feita de uma abertura com uma porta de retalho com um micro interruptor, um distribuidor de pelotas movido a motor e uma tira com oito LEDs para iluminação. O circuito também exemplifica conexões para componentes opcionais, como o alto-falante de campainha passiva para feedback auditivo e um potencializador digital para ajuste de volume. Para obter uma lista dos equipamentos utilizados no desenvolvimento desta caixa de ferramentas, consulte Tabela de Materiais.
Figura 3: Circuito simplificado do hardware do microcontrolador. Para ser personalizável e rapidamente, o equipamento microcontrolador é conectado através de uma tábua de pão. Da parte superior esquerda para baixo esquerda, no sentido horário: Uma placa microcontroladora é conectada a um escudo motor e a um motor DC (representando o motor dispensador de pelotas). À direita estão as tiras de LED para as luzes da casa e da revista food, e no meio estão todos os cinco LEDs brancos para a luz de estímulo e os cinco pares de sensores infravermelhos usados nas aberturas. Abaixo da placa microcontrolador está um microswitch simples (representando o interruptor usado na porta da aba da revista de alimentos). Finalmente, um alto-falante passivo e um potencialiômetro digital são retratados no meio. Esta imagem foi feita usando o software de código aberto Fritzing. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Linkage e funções de todos os componentes dos scripts de controle do experimento e diagrama simplificado da função "Código". (A) O script "Usuário" envia seus parâmetros para a função "Código", que por sua vez se conecta diretamente à função "Escadaria", permitindo que ele atualize qualquer parâmetro usado na função "Código" enquanto o experimento estiver em andamento. A função "Código" envia seus resultados para a função "DataProc" no final da sessão. (B) Antes de iniciar uma sessão de experimento, a função "Código" verifica primeiro se é suposto iniciar o protocolo de habitação. Caso não, ele configura os parâmetros com base nas definições escolhidas no script "Usuário". Antes de cada teste começar, a função então verifica se a tecla ESC no teclado foi pressionada. Se não, continua com um novo julgamento. Caso contrário, ele interrompe a sessão de experimento e passa os dados coletados para a função DataProc. Esta verificação crítica antes de cada início de teste permite que o programa pare antes que qualquer limite de tempo escolhido seja atingido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Interações entre os diferentes scripts de controle de experimentos podem ser vistas na Figura 4A. O script "Usuário" inclui todos os parâmetros que definem o experimento. Lá, variáveis que determinam o tempo, o número e o brilho do experimento de estímulos iluminados, duração de ITI e afins podem ser escolhidos livremente. A função Código (Arquivo Suplementar 5) inclui uma descrição detalhada de um único ensaio e todos os resultados possíveis, que é reiterado ao longo do experimento, como mostrado na Figura 4B. Além disso, consiste em um protocolo para a habituação do animal ao aparelho. A função Código também verifica regularmente o desempenho do animal. Além disso, a função Escadaria é opcional. O desempenho do sujeito é comparado aos critérios previamente definidos, e os parâmetros desejados são atualizados automaticamente se o desempenho do animal atender a esses critérios. A função Escadaria também pode considerar os resultados adquiridos da sessão do dia anterior. Enquanto o experimento estiver em execução, uma verificação de desempenho no final de um teste calculará a precisão, as omissões e o número total de respostas corretas dos ensaios concluídos e comparará o resultado com os critérios desejados para uma atualização de nível, conforme especificado na função Staircase. Finalmente, a função DataProc processa todos os dados coletados e gera gráficos simples para análise rápida. No final de uma sessão, a caixa de ferramentas salva automaticamente todos os dados em um arquivo *.mat e gera um arquivo extra de *.xlsx com as informações essenciais do experimento.
Figura 5: Exemplo de diferentes configurações de estímulo da caixa de ferramentas 5-CSRTT. O diagrama exemplifica possíveis combinações de estímulos-alvo na dependência da configuração escolhida. Ambas as configurações "all" e "single" são usadas no paradigma padrão (para a habitação e experiência comportamental). As configurações "vizinhas" e "deslocadas" mostram configurações de estímulo não padronizadas, permitindo o uso de outros números de estímulos acessos, que também podem ter um contraste diferente do estímulo-alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A etapa 4.2.7.7 do protocolo menciona um recurso opcional: alterar o agrupamento de aberturas de destino. O paradigma padrão 5-CSRTT faz uso de um único estímulo de alvo. Aqui, exemplificamos como a caixa de ferramentas apresentada permite modificações do paradigma padrão. A Figura 5 exibe algumas combinações de grupo possíveis de um total de cinco aberturas relativas à configuração escolhida. A configuração "tudo" acende todas as aberturas disponíveis para que cada abertura seja agora uma abertura de destino, o que pode ser útil nas fases iniciais de treinamento. A configuração do vizinho garante que o número (livremente escolhido) de aberturas de destino será vizinho um do outro. As configurações podem ser especificadas de tal forma que os vizinhos não serão idênticos à abertura do alvo, mas serão iluminados em contraste menor (ou até maior). O uso de aberturas com diferentes contrastes de iluminação permite testar novos paradigmas, como o uso de recompensas de diferentes graus para cutucadas de nariz nas aberturas de alto ou baixo contraste. A Figura 5 mostra um exemplo com três aberturas de destino com iluminação idêntica. A configuração única é normalmente usada no padrão 5-CSRTT, onde apenas um único alvo é iluminado. Finalmente, a configuração deslocada amplia a configuração do vizinho. Ele desloca o estímulo do vizinho para a última ou primeira abertura no caso da abertura do alvo estiver na primeira ou última posição, respectivamente. Como na configuração do vizinho, a força de iluminação dos vizinhos pode ser livremente escolhida, sendo a mesma ou diferente da abertura do alvo. Além disso, o número de estímulos iluminados globais pode ser livremente escolhido. A caixa de ferramentas calcula então todos os estímulos possíveis automaticamente. No entanto, o parâmetro "Config.LED.NumHighLED" deve ser definido como "1" para esta configuração.
Seguindo o protocolo, o treinamento de ratos (N = 10) para o 5-CSRTT foi realizado de acordo com as etapas de treinamento apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1: Cronograma de treinamento 5-CSRTT e critérios para passar para o próximo nível. (A) O intervalo inter-trial foi mantido constante em 5 s em todos os níveis de treinamento. (B) Duração do estímulo para cada nível de treinamento. (C) Janela de tempo Limited Hold (LH), o tempo máximo tolerado entre o estímulo desligado e qualquer resposta de cutucar o nariz. (D) O número total de respostas corretas necessárias para passar pelo respectivo nível de treinamento. (E) A porcentagem de precisão é calculada como 
. (F) Percentual de erros de omissão é definido como 
. Este critério não inclui respostas prematuras. Clique aqui para baixar esta Tabela.
O desempenho dos ratos foi comparado ao número de dias de treinamento (sessões) necessários para completar cada nível de treinamento dado na Tabela 1. Todos os animais começaram no treinamento nível 1 com DST e LH de 60 s cada. No entanto, alguns ratos (N = 5) receberam treinamento aprimorado de habituação para testar algumas das opções adicionais de estímulo relatadas anteriormente, o que explica a diferença no número de sessões que os animais individuais permaneceram no nível 1 de treinamento. A conclusão do nível foi marcada por atingir um total de 30 ou mais respostas corretas. StD e LH diminuíram durante os níveis seguintes, enquanto os critérios para avançar para o próximo nível de treinamento ficaram mais difíceis, aumentando a demanda de atenção da tarefa 1,6.
A Tabela 2 mostra a planilha de .xlsx de um exemplo gerada automaticamente durante uma sessão. O rato começou com a configuração especificada no nível de treinamento 5. Após quatro ensaios, o rato avançou para o nível 6, considerando os ensaios realizados na sessão atual mais a precisão alcançada na sessão anterior. Quantos ensaios devem ser realizados no mínimo na sessão atual para avançar para o próximo nível de treinamento é especificado na variável "Config.Experiment.MinNumTrials". Na mesma sessão, o rato avançou para o nível de treinamento 7 após completar 66 ensaios no nível 6 e alcançar a exigência de > 80% de precisão e < omissão de 20%. No total, os ratos foram treinados por 26 dias utilizando a configuração dos níveis de treinamento conforme previsto na Tabela 1. O número de sessões gastas por nível de treinamento é fornecido na Figura 6A. A linha preta mostra a média entre todos os sujeitos, e cada linha colorida exibe os dados de um rato. Todos os ratos atingiram o oitavo nível dentro de 14-22 sessões (Figura 6B). A Figura 6C mostra o desempenho médio dos sujeitos por nível de treinamento e em todos os dias de treinamento no aparelho 5-CSRTT. A linha preta tracejada representa a porcentagem de precisão, e a linha preta reta representa a porcentagem de omissão. A precisão foi calculada como a razão entre o número de respostas corretas e o número total de respostas. As omissões foram calculadas como a razão entre o número de omissões e o número total de ensaios (ou seja, a soma das respostas corretas, respostas incorretas e omissões). A linha cinza indica o número médio total de respostas corretas em todos os ensaios em cada nível. A Figura 6D exibe a precisão final alcançada por cada sujeito no oitavo e último nível de treinamento.
Em média, os ratos passaram 5,9 sessões (± 1,03 SEM) para completar o nível 1, entre 1,5 (±0,17) e 3,5 (±0,5) sessões para completar o nível 2 a 6, e 1,7 (±0,16) para completar o nível 7 antes de atingirem o nível final 8. Como é evidente na Figura 6A, a variância entre os sujeitos foi mais significativa nos níveis iniciais (SD = 3,25 no nível 1, 1,58 no nível 2) e diminuiu nos níveis posteriores (0,47 e 0,48 nos níveis 6 e 7, respectivamente). No nível 4, quando a duração do estímulo foi ainda reduzida, a média de sessões gastas (2,6 ± 0,52) e a variância entre ratos (1,64) aumentaram, com dois ratos levando 5 e 6 dias para concluir o nível.
Figura 6: Resultados do experimento comportamental com a caixa de ferramentas 5-CSRTT. (A) O número de sessões realizadas em cada nível de treinamento. A linha preta retrata o número médio de sessões de todos os sujeitos para cada nível (média ± SEM) e as linhas coloridas representam dados individuais dos sujeitos. (B) O número absoluto de sessões necessárias para atingir o nível final, por sujeito. (C) Medidas médias de desempenho ao longo do treinamento (média ± SEM). A linha preta pontilhada retrata a precisão de todos os assuntos em todas as respostas em todas as sessões por nível de treinamento, e a linha preta mostra a porcentagem de omissão correspondente. A linha cinza retrata o número absoluto médio de respostas corretas de todos os sujeitos em cada nível de treinamento. (D) Precisão por assunto durante o oitavo e último nível de treinamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 2: Dados coletados de um rato de exemplo durante uma sessão de treinamento. A coluna A exibe a contagem de ensaios sobre a sessão em relação ao nível de treinamento atual, como mostrado na coluna B. A coluna C exibe a duração do ITI e a coluna D exibe o tempo de início do teste. As colunas E a I mostram o nível de brilho para o estímulo led nas aberturas de 1 a 5, respectivamente. Um nível de brilho de 0 significa que o estímulo estava desligado, e um nível de brilho de 0,2 significa que o estímulo foi ligado com 20% de sua intensidade máxima. As colunas J e K mostram a hora exata em que o estímulo foi ligado e desligado, respectivamente. A coluna L exibe o resultado do ensaio: 0 significa "omissão", 1 significa "resposta correta", 3 significa "resposta incorreta" (cutucar o nariz na abertura não-alvo) e 4 significa "prematuro". A coluna M mostra qual abertura foi cutucada pelo nariz durante o julgamento, enquanto a coluna N mostra a hora exata do cutuque o nariz. As colunas O, P e Q mostram o tempo em que o motor do distribuidor de pelotas foi ligado, o número do motor correspondente, e o momento em que o rato abriu o distribuidor de pelotas para receber sua recompensa, respectivamente. A coluna R exibe o tempo final do teste. As colunas S, T, U, V e W mostram o número total de respostas prematuras, tempo limite, empurrões de painel durante um ITI, o número total de respostas perseverantes e o tempo total de execução da sessão em minutos, respectivamente. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Arquivo Suplementar 1: Script para o controle de hardware do software IDE (código Arduino). Isso inclui todos os comandos para controlar o hardware e componentes eletrotécnicos da caixa de ferramentas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 2: Script para a função "Usuário" no software de controle de experimento. Isso inclui todos os parâmetros que definem o experimento. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 3: Script para a função "Escadaria" no software de controle de experimento. Isso monitora o desempenho do sujeito e o compara aos critérios previamente definidos. Os parâmetros desejados são atualizados automaticamente se o desempenho do animal atender a esses critérios. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 4: Script para a função "DataProc" no software de controle de experimento. Isso processa todos os dados coletados e gera gráficos simples para análise rápida. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 5: Script para a função "Código". Isso inclui uma descrição detalhada de um único teste e todos os resultados possíveis, o que é reiterado ao longo do experimento. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
O presente protocolo descreve o desenvolvimento de uma caixa de ferramentas de tempo de reação serial de 5 opções de código aberto para modelos animais roedores, usando Arduino e hardware relacionado e uma caixa de ferramentas Matlab versátil, incluindo um script opcional para treinamento comportamental automatizado. Os scripts são personalizáveis e facilitam a implementação de diferentes projetos de teste e teste.
Este trabalho é suportado pelo DFG WE 5469/3-1.
| de | 1200 Ohm | Já disponível no laboratório | |
| Potenciômetro digital de 8 bits 10 kΩ | Microchip | MCP42010-I/P | De Conrad.de: 1083205 |
| ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 Lernset | JOY-IT | ARD-Set01 | De Reichelt.de: ARD MEGA2560 |
| KIT ARD SHD MOTOR Arduino Shield - Motor | Adafruit | 1438 | De Reichelt.de: ARD |
| KIT DE CABEÇOTE EMPILHÁVEL SHD MOTOR ARDUINO - R3 | Sparkfun Electronics | PRT-11417 | De Antratek.de: PRT-11417 |
| Chow | Altromin | 1324 N | Altromin chow products |
| Euro-Gehä use | Hammond Electronics | 1591EBK | De Conrad.de: 520691 |
| Pellets de alimentos | Bio-Serv | F0021 | De Bio-serv.com: Pellets de precisão sem poeira Laboratório |
| fritzing | de roedoresPotsdam | Fritzing Download de software | |
| Ambiente de desenvolvimento integrado | Arduino | Arduino IDE download (disponível gratuitamente) | |
| Sensor de feixe de ruptura IR - LEDs 3mm | Adafruit | 2167 | De Mouser.de: 485-2167 |
| Laptop ou Computador | |||
| LED branco redondo 5mm 2000mcd 20mA | TruComponents | 1573731 | De Conrad.de: 1573731 |
| Microinterruptor | Hartmann | MBB1 01 A 01 C 09 A | De Conrad.com: 707243 |
| NeoPixel Stick - 8 WS2812 5050 RGB LEDs | Adafruit | 1426 | De Reichelt.de: DEBO Alto-falante passivo LED NP8 2 |
| 93038c213a | dacampainha | elétricaDe Conrad.de: 1511468 | |
| Disco | de liberação de pellets | Já disponível no laboratório. Produtos similares descritos abaixo. Lembre-se de que alguns desses produtos fazem uso de motores e sensores infravermelhos diferentes (e mais fortes). O uso do microinterruptor (linha 7) e o O Arduino Motor Shield (linha 3) precisa ser adaptado para atender a essas novas especificações. Recomendamos a impressão 3D do disco para trabalhar com os materiais e softwares fornecidos. Placa de base universal Carbatec Open Science Framework Open Feeder Open Ephys 3d Model Food Pellet Dispenser Campden Instruments 45mg pellet dispenser | |
| Plataforma de programação | Mathworks | R2019b ou mais recente | |
| Psychtoolbox Software | V3 | Psychtoolbox-3 download | |
| Motor de engrenagem de dentes retos com motor de escova DC | Micromotores | B138F.12.208 | Micromotos Série B138F Dados técnicos |
