Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície

A atividade antiviral associada à tetherin é induzida por α interferon, e compreende amarras à base de proteínas, que levam à retenção de virions totalmente formados em superfícies celulares infectadas¹. A necessidade de glicosilação por amarrina na inibição da liberação do vírus permanece incerta, implicando a importância dos padrões de glicosilação em glicanos expressos recombinantemente para estudos in vitro ^1,2, o que depende da conformação de (no caso do vírus da gripe) hemaglutinina da gripe expressa superficialmente ^3,4 . Observou-se que a modificação do oligossacarídeo amarrado à glicosilação ligada a N é suficiente para a restrição mediada por teia da liberação do HIV tipo 1², enquanto a dimerização desempenha um papel essencial na prevenção da liberação do vírus, envolvendo assim o domínio transmembrana ou a âncora glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para amarrar os virions em brotamento⁵ . Características exclusivas são descritas para a amarrina humana e murina para bloquear vários vírus envelopados, retrovírus e filovírus. A BST-2/tetherin é uma proteína antiviral induzível por interferon da imunidade inata^1,6, atuando com atividade antiviral de amplo espectro e é antagonizada pelas glicoproteínas^{do envelope 5} para translocar a tetherin ou interromper a estrutura da tetherin ⁶. Por exemplo, a glicoproteína HA do envelope expresso superficialmente e a neuraminidase no vírus influenza A são bem conhecidas pelo antagonismo da teina de maneira específica da cepa⁷, facilitando o reconhecimento dos locais de ligação do receptor hospedeiro⁸. Os anticorpos direcionados ao glicano são estudados na estequiometria de suas interações com os escudos glicanos de rápida personalização no AH, resultando em afinidade de ligação aos subtipos 4 H3N2 e H1N1^da influenza A.

Para elucidar os mecanismos de ligação entre agentes antivirais e picos de envelope de vírus, ou seja, ligantes de carboidratos e métodos imunológicos e espectroscópicos complementares, metades mono, di- e tri-manose são sintetizadas quimicamente. Os peptídeos manosilados, são criados via glicosilação azida de glicosil {beta}-peracetato para a transformação de azidas de glicosila 1,2-trans⁹, imitando a N-acetilglucosamina tipicamente encontrada e oligossacarídeos de alto manose na superfície de vírus com risco de vida. Os bioisósteros triazólicos são utilizados para imitar ligações que formam o resíduo manosilado do peptídeo HA¹⁰ e facilitar interações site-specific com derivados antivirais CV-N em torno do segundo ponto de glicosilação ligado a N no domínio da cabeça de AH (topo de AH com 4 glicanos ligados a N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . As interações entre o ácido glutâmico (Glu) e a arginina (Arg) e o dipolo de hélice resultante manifestaram boa estabilidade de ambos os peptídeos modelo e proteínas, mas são visualizadas usando SPR. Se comparado com o reconhecimento de um único sítio de glicosilação quimicamente sintetizado no HA¹⁰, inibindo diretamente a ligação do receptor nas metades de glicano, uma maior afinidade de uma estrutura Fc mutada de quatro locais ao seu receptor é mostrada para provocar funções efetoras in vivo, revelando a composição não relacionada de glicanos ligados a N ligados ao mutante Fc a ser determinada mecanicamente¹³.

O CV-N apresenta atividade antiviral contra o HIV 14,15, influenza¹⁶ e vírus Ebola, que é mediada pela ligação nanomolar a modificações de oligossacarídeos de alta manose em proteínas spike do envelope^12,17,18,19. Determina-se que a ligação do AH influenza a um sítio de ligação a carboidratos (H) de alta afinidade em CV-N ou dois Hs em CVN2 dimérico covalentemente ligado tem constantes de dissociação de equilíbrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e K_D = 2,7 nM, respectivamente. Tanto o CV-N quanto o CVN2 abrigam outro um ou dois sítios de ligação a carboidratos (L) de baixa afinidade 12,17,20,21. O Ebola GP1,2 liga-se a 2H de CVN2 com afinidades na faixa nanomolar inferior (K_D = 26 nM). A CV-N WT vinculando-se ao Ebola GP1,2 e HA apresenta afinidades de K D = 34 nM a K_D = 5,7 nM (A/New York/55/04)¹². As lectinas, como a CV-N, que visam especificamente glicanos de alta manose nos envelopes virais, inibem ainda mais a replicação do vírus da hepatite C, SARS-CoV, herpesvírus, vírus de Marburg e vírus do sarampo²².

A pequena molécula CV-N tem sido estudada minuciosamente há mais de 20 anos, pois se funcionaliza para se ligar a uma ampla gama de vírus para inibir a entrada viral^16,18. Análises estruturais e ensaios de afinidade de ligação indicam reticulação de dois Ls em um dímero CVN2 trocado por domínio por ligação bivalente na faixa micromolar para aumentar a avidez às glicoproteínas do envelope viral^10,19. A ligação seletiva de Manα1-2Manα nos braços D1D3 de Man(8) e Man(9) compreende dois locais de ligação de diferentes afinidades localizados em protômeros de proteínas opostas²⁰, alcançando, assim, afinidades de ligação nanomolar (Figura 1B). Assim, o CVN2 é considerado um pseudo-anticorpo quanto à sua aplicação para ligar epítopos na gp120 do HIV, semelhante aos anticorpos neutralizantes do vírus¹⁷. Neste documento, o autor está interessado em investigar a potencial ligação do CVN2 ao pico do SARS-CoV-2 através do seu domínio de ligação ao receptor (RBD). Curvas de ligação da enzima conversora de angiotensina humana imobilizada (ECA)-2 com o SARS-CoV-2 RBD resultam em K_D = 4,7 nM para essa interação de ligação biologicamente relevante²³.

Por outro lado, classes selecionadas de imunoglobulinas reconhecem padrões proteicos estruturais específicos e consistentes, que conferem um substrato para a maturação por afinidade nas regiões de AH ancoradas na membrana²⁴. O CV-N mostra atividade altamente potente em quase todos os vírus influenza A e B¹⁶, sendo um agente antiviral amplamente neutralizante. Nosso conhecimento é incompleto sobre a localização de epítopos direcionados no caule de HA1 e HA2 que possivelmente envolvem estruturas epitópicas para direcionamento de glicano por anticorpos altamente neutralizantes e em comparação com a ligação à^{lectina 25}.

Figura 1: Representação esquemática do ensaio de ligação SPR para CV-N a espículas de envelope de vírus. (A) Ensaio SPR para ligação de CV-N ao ligante: proteína de comprimento total HA (90 kDa). Conjunto de dados cinéticos (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) mostrando ligação duplamente referenciada em tempo real à influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Ligação da variante V2 do CVN2L0 ao ligante imobilizado DM dentro de uma faixa de concentração de 500 nM a 16 μM. Sequência: Os resíduos de L são destacados em amarelo. Os resíduos de H são destacados em cinza. E58 e R73 são um substituto para cisteínas na proteína selvagem e fazem da V2 uma dobra proteica estável com três em vez de quatro ligações dissulfeto Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Enquanto o escudo glicano na parte superior do AH membrana-distal induz uma ligação de alta afinidade ao CV-N 12, a ligação do CVN2 ao AH adjacente a uma ponte dissulfeto da parte superior do AH tem sido observada em seus locais de baixa afinidade^10,12. Várias interações polares e locais de interação são identificados na ligação a carboidratos pelo CV-N. Essas interações são verificadas por meio da geração de variantes knock-out no sítio de ligação para correlacionar afinidades de ligação com a glicosilação predita in silico ¹². Assim, o projeto visa comparar peptídeos HA quimicamente manosilados previamente testados em afinidade e especificidade de ligação com sequências peptídicas curtas de picos de 2019-nCoV relacionados ao SARS e SARS-CoV-2, ocorrendo naturalmente modificados por um pequeno número de diferentes locais de glicosilação ligados a N e glicosilação ligada a O. Usando microscopia crioeletrônica e ensaios de ligação, Pinto e colaboradores relatam um anticorpo monoclonal, S309, que potencialmente reconhece um epítopo na proteína spike SARS-CoV-2 contendo um glicano conservado dentro do subgênero Sarbecovirus, sem competir com a ligação do receptor²⁶. O protocolo deste estudo descreve como projetar, expressar e caracterizar variantes de CV-N são importantes para estudar como CV-N e CVN2 se ligam a proteínas glicosiladas e peptídeos manosilados sintéticos utilizando a tecnologia SPR^10,12.

O dímero ligado a tandem CVN2L0²⁷ e as variantes de local de ligação (V2-V5) são expressas de forma recombinante e as variantes estão com substituições de ligação dissulfeto (C58E e C73R) (Figura 2A). Além disso, um mutante com uma mutação de ponto único E41A é preparado porque esta posição tem sido vista como um resíduo de contato cruzado intermolecular. Este mutante é outra molécula interessante para medições de ligação SPR entre a lectina e oligossacarídeos de alta manose decifrando domínios de ligação e permite a comparação com a forma dimérica. A estrutura cristalina trocada por domínio do CVN2 mostra um ligador flexível, que se estende entre 49 e 54 resíduos. Os dois domínios podem continuar se movendo ao redor da dobradiça como corpos rígidos, desenvolvendo um monômero através de interações de domínio intramolecular (domínio A -resíduos 1-39;90-101- com domínio B -resíduos 40-89) ou um dímero por troca de domínio intermolecular [domínio A (do primeiro monômero) com domínio B (do segundo) e domínio B (do primeiro monômero) com domínio A (da segunda cópia)]. Não há interações próximas entre os domínios A e B dos dois protômeros, com exceção de Glu41²⁸. O gene para CV-N pode ser desenvolvido usando um método de PCR repetitivo com oligos^{sintetizados 40-mer 29} e é então subclonado nos sítios NdeI e BamHI de pET11a para transformação (eletroporação) em células eletrocompetentes, conforme descrito por Keeffe, J.R.27. A proteína, que é usada para alcançar a respectiva estrutura cristalina (PDB ID 3S3Y), inclui uma etiqueta de purificação N-terminal de 6 histidinas seguida por um local de clivagem da protease do Fator Xa. A mutagênese dirigida ao local é utilizada para fazer mutações pontuais, alternar códons e inserir ou excluir bases ou códons únicos ou múltiplos para troca de aminoácidos. Essas transformações fornecem informações inestimáveis sobre a função e a estrutura das proteínas. CV-N, CVN2 e CVN3 recombinantemente expressos e purificados têm sido biofisicamente bem estudados^20,21,27, são de baixa produção e, portanto^, utilizados para caracterizar ensaios de ligação a glicanos imobilizados em chips de sensor SPR. O ensaio imunoenzimático convencional (ELISA) fornece menor reprodutibilidade em relação à técnica de imobilização de ligantes de glicano e transforma a ligação em tempo real de várias variantes do local de ligação, o que é mostrado para SPR, em ensaios de desfecho.

A variante de afinidade de ligação CVN2L0-V2 (uma dobra intacta de CV-N homodimérico com uma substituição de ponte dissulfeto¹⁰) é expressa com uma etiqueta His-em Escherichia coli (E. coli), purificada sobre a coluna Ni-NTA aplicando cromatografia de afinidade e testada quanto à ligação a HA (H3N2), peptídeo HA monomanisílico e peptídeo HA dimanosilado usando SPR. Peptídeos quimicamente manosilados, ou proteínas HA e S, todos são ligantes e amina acoplados à superfície do chip hidrofílico através de ésteres reativos ou engenharia de proteínas de biotina-estreptavidina. O mesmo procedimento de corridas sequenciais é aplicado a esses ligantes, injetando várias diluições de CV-N e variantes de CV-N (e CVN2) para obter informações cinéticas para as análises de interação molecular, conforme descrito abaixo³⁰. O chip sensor SPR imobilizado por RBD é usado para estudos de ligação de peptídeos CV-N a S, e as afinidades são comparadas à ligação do SARS-CoV-2 com a ACE2 humana.

Para o presente estudo, uma proteína de fusão modificadora semelhante à ubiquitina (SUMO) CVN foi usada em ensaios de imunoabsorção enzimática em vez de CV-N e é adequada para ensaios baseados em células. A proteína recombinante de comprimento total do vírus da gripe A HA H3 é obtida comercialmente (ver Tabela de Materiais) ou expressa em linhagens celulares HEK293 de mamíferos e células de insetos infectadas por baculovírus de acordo com protocolos padrão¹². A proteína spike Wuhan-1 é expressa em células HEK293 de mamíferos. A síntese de peptídeo monomanosilado (MM) e peptídeo dimanosilado (DM) permite a detecção de ligantes homogêneos para CVN2 e molécula pequena monomanosilada¹⁰.

1. Criando construções CV-N

1. Para cada uma das variantes CVN2 e proteína CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), obtenha a construção do gene com uma sequência líder de pelB N-terminal e His-tag no vetor pET27b(+) de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais, Arquivo Suplementar 1).
2. Obter CVN2L0 e suas variantes (V2, V3, V4 e V5; Figura 2A,C) no fundo de um gene modelo CVN2L0 que consiste em duas sequências de DNA distintas para cada repetição CV-N.
3. Dissolver o DNA plasmidial liofilizado em água destilada desionizada estéril (ddH₂O) até uma concentração final de 100 ng/μL.

2. Preparação de placas de ágar LB com células transformadas de DNA plasmídico

1. Preparar o meio de cultura LB-Lennox dissolvendo 10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levedura e 5 g/L de NaCl em ddH₂O (ver Tabela de Materiais) e ajustar o pH para 7,4. Efectuar a transformação em E. coli BL21 (DE3) competente para cada variante (V2-V5) por método químico, de acordo com um relatório¹⁰ publicado anteriormente.
2. Divida a solução (900 μL e 100 μL), transfira 100 μL em placas de ágar LB (50 μg/mL de canamicina) e use suavemente um espalhador de células estéreis. Incubar as placas de ágar durante a noite a 37 °C.

3. Clonagem

1. Subclonar o gene para CV-N nos sítios NdeI e BamHI do pET11a (ver Tabela de Materiais) para transformação (electroporação) em células electrocompetentes seguindo a referência²⁷.

4. Mutagênese dirigida ao local

1. Gerar CVN2L0²⁹ e CVN-E41A mutante no fundo de um gene modelo CVN2L0 contendo duas sequências de DNA distintas para cada repetição CV-N²⁷.
2. Fazer mutações utilizando um kit de mutagénese sítio-dirigido (ver Tabela de Materiais) e primers mutagénicos específicos 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' e 5'-cctgaactctctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' para executar a PCR³¹.
   1. Inicie uma série de reações de amostra usando múltiplas concentrações de DNA de fita dupla (dsDNA) variando de 5-50 ng (por exemplo, 5, 10, 20 e 50 ng de molde de dsDNA). Mantenha a concentração do primer constante.
      NOTA: A mistura de PCR e o protocolo de ciclo térmico são geralmente utilizados conforme descrito no manual de instruções para o kit de mutagénese dirigida ao local³².
3. Adicione a enzima de restrição Dpn I (1 μL, 10 U/μL, ver Tabela de Materiais) abaixo da sobreposição de óleo mineral. Misture bem e suavemente as reações, gire para baixo em uma microcentrífuga de mesa por 1 min e incube imediatamente a 37 °C por 1 h para digerir o dsDNA superenrolado parental.

5. Transformação de células bacterianas

1. Descongele as células supercompetentes XL1-Blue (ver Tabela de Materiais) suavemente sobre o gelo. Para transformar cada controle e reação da amostra, alíquota das células supercompetentes (50 μL) a um tubo de fundo redondo de polipropileno pré-resfriado (14 mL).
   1. Transfira 1 μL do DNA de fita simples tratado com Dpn I (ssDNA) de cada reação de controle e amostra (ssDNA mutado) para alíquotas separadas das células supercompetentes, que sintetizam a fita complementar. Gire as reações de transformação cuidadosamente para misturar e incubar as reações no gelo por 30 min.
      NOTA: Antes de transferir o DNA tratado com Dpn I para a reação de transformação, recomenda-se remover cuidadosamente qualquer óleo mineral restante da ponta da pipeta. Como um controle opcional, a eficiência de transformação das células supercompetentes XL1-Blue precisa ser verificada pela mistura de 0,1 ng/μL do plasmídeo de controle pUC18 (1 μL) com uma alíquota de 50 μL das células supercompetentes.
2. Aplicar pulso de calor às reações de transformação a 42 °C durante 45 s e, em seguida, colocar as reações no gelo durante 2 minutos.
   NOTA: O pulso de calor aplicado já foi otimizado para as condições mencionadas em tubos de fundo redondo de polipropileno (14 mL).
3. Adicionar 0,5 mL de caldo NZY+ (contendo por litro: 10 g de amina NZ (hidrolisado de caseína), 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, 12,5 mL de 1 M MgCl 2, 12,5 mL de 1 M MgSO₄, 10 mL de glicose₂ M, pH 7,5 e pré-aquecido a 42 °C) e incubar as reações de transformação a 37 °C com agitação a 225-250 rpm por 1 h. Chapear o volume correto de cada reação de transformação (5 μL da transformação plasmídica de controle; 250 μL da transformação da amostra) em placas de ágar LB-ampicilina.
   NOTA: Para os controlos de transformação e mutagénese, espalhar células em placas de ágar LB-ampicilina com 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopiranosídeo (X-gal, 80 μg/ml) e isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosídeo (IPTG, 20 mM) (ver Tabela de Materiais). Inocular 50 mL das culturas celulares com uma única colônia de E transformado. células coli para purificar o DNA plasmídico mutado para análises. A mutagênese é confirmada pelo sequenciamento de DNA em uma instalação externa.

6. Expressão e purificação de proteínas

1. Para uma cultura em larga escala, inocular uma pequena quantidade de LB (contendo ampicilina) com uma única colônia da placa transformada.
2. Utilizando a cultura noturna, inocular a expressão cultura com aditivos, como 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₄ e 20 mM de glicose, diluindo a cultura de sementes para 1/100.
   1. Cultivar células com agitação vigorosa a 37 °C. Cultivar células para um Abs 600 nm entre 0,4-0,6 (fase intermediária) antes de resfriar as células a 20 °C. Induza com 1 mM IPTG e cresça durante a noite.
   2. Em seguida, colher as células por centrifugação a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.
3. Ressuspender o pellet celular em tampão salino tamponada com fosfato (PBS) e recentrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C. Em seguida, descarte o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender o pellet restante em 10 mL de tampão de lise e incubar a suspensão por 1 h a 37 °C.
   NOTA: Composição do tampão de lise: (50 mM de NaH 2 PO₄, 300 mM de NaCl, 2% de Triton-X100, 500 ng/mL de lisozima, 1 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de MgCl₂, pH 8, ver Tabela de Materiais).
   1. Sujeitar a mistura a dois ciclos de congelamento-descongelamento (-80 °C). Separe as fracções solúveis e insolúveis por centrifugação a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C e analise-as utilizando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), em particular, dodecil sulfato de sódio (SDS)-PAGE³³ (Figura 2B,C).
      NOTA: As células podem ser lisadas de várias maneiras, como congelamento-descongelamento, sonicação, homogeneização, lise enzimática ou uma combinação desses métodos. A purificação a partir de corpos de inclusão é recomendada para a coleta de altos rendimentos proteicos²⁶.
4. Purificar proteínas utilizando cromatografia em coluna de Ni-NTA (ver Tabela de Materiais). Carregar a fração solúvel sobre uma coluna de grânulos de Ni-NTA regenerados (1 mL/min). Lave o sistema com tampão TBS (50 mM de Tris, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,5) antes de iniciar um gradiente (0-100% 500 mM de imidazol em TBS acima de 60 min) e coletar frações (1 mL/min). Dializar as proteínas purificadas para caracterização bioquímica contra PBS 100 mM (Figura 2C,D).
5. Alternativamente, use o gel de afinidade His-Select Ni 2+ (ver Tabela de Materiais) em tubos de 14 mL para ligar e ressuspender seu CV-N expresso recombinantemente em soluções tampão com imidazol 20 mM e imidazol²⁵⁰ mM, respectivamente. Incubar em lote por pelo menos 30 min.
   NOTA: Aplique estas proteínas semi-purificadas a uma coluna pré-embalada de uso único para troca tampão e limpeza de amostras biológicas, por exemplo, carboidratos e proteínas, que podem carregar 1-1,5 mL de eluído a partir de cromatografia de afinidade de metal imobilizado.
6. Transferir as soluções proteicas para tubos de centrifugação com um filtro de corte de 10 kDa (ver Tabela de Materiais) e concentrá-las por centrifugação durante 10 minutos a 4.500 x g e 4 °C. Para medições de SPR, troque as soluções a analisar por 10 mM de HEPES, cloreto de sódio de 150 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de 3 mM e Tween20 a 0,05%, pH 7,4 (HBS-EP(+), ver Tabela de Materiais).
   1. Adicionar este tampão de funcionamento SPR a um factor de diluição de 1:10 e centrifugar quatro vezes até ao volume inicial durante 10 min a 4.500 x g e 4 °C.
7. Determinar a concentração de proteína a 280 nm usando um espectrofotômetro NanoDrop UV-Vis (ver Tabela de Materiais) com base no coeficiente de extinção calculado (20.440 M-1 ^cm-1) para a proteína principal CVN2L0 mostrando um tamanho de 23.474 Da³⁴. Use PBS (100 mM, pH 7,0) ou tampão SPR como um espaço em branco e meça a concentração de proteína em três etapas de diluição (1:1, 1:10 e 1:100).

Figura 2: Sequências e expressão de CV-N. (A) CVN2 sem um ligador entre cada repetição de CV-N (101 aminoácidos cada) e quatro pontes de dissulfeto é expresso no vetor pET11a em E. coli. (B) Expressões de duas colônias independentes para CV-N (monômero) e CVN2 (dímero). (C) As variantes de ligação dissulfeto são purificadas e analisadas no SDS-PAGE. Um marcador de baixo peso molecular (6 μL) é usado como referência. WT = CVN2L0 com quatro pontes de dissulfeto conforme marcado em (A). V2 é uma variante com uma substituição de ligação dissulfeto por resíduos polares nas posições 58 e 73. V3-V5 são variantes com duas ligações S-S restantes e polares (C58E-C73R) ou apolares (C58W-C73M) substituindo aminoácidos ou uma combinação dessas substituições de pares de resíduos. (D) Os cromatogramas de HPLC de CVN2L0 purificado são elutados a uma taxa de fluxo de 1 mL/min com um gradiente linear de 5%-65% tampão B no tampão A acima de 30 min. O tampão A é: 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético em ddH₂O, tampão B é: 0,08% (v/v) de ácido trifluoroacético em acetonitrila. A proteína é analisada em uma coluna de sílica gel de alto desempenho 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) a 214 nm e 280 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Espectroscopia SPR

1. Use o sistema SPR de canal duplo (consulte Tabela de materiais) com o tampão de funcionamento HBS-EP(+) e a glicina HCl de 10 mM pH 1,5-1,6 como tampão de regeneração. Ligue o instrumento, o desgaseificador, o amostrador automático e a bomba e lave todo o sistema com ddH₂0 por 1 h. Coloque o buffer em execução pronto para uso em um frasco separado.
2. Solte o óleo de emersão no detector e monte um chip sensor de vidro (consulte Tabela de Materiais) revestido com uma fina película de ouro e no lado superior funcionalizado com hidrogel de carboximetildextrana diretamente no detector abaixo da célula de fluxo de três portas. Corrija a configuração puxando o manuseamento para baixo.
   NOTA: C19RBDHC30M 200 nm estreptavidina derivada carboximetildextran hidrogel com uma densidade média de síndrome respiratória aguda grave biotinilada coronavírus-2 RBD proteína, é um sensorchip pronto para uso com o ligante pré-imobilizado.

8. Ensaio de ligação SPR para ligação CV-N a HA, proteína S e RBD

1. Imobilize os ligantes proteicos para chips sensores seguindo as etapas abaixo.
   1. Abra uma tabela de execução clicando em Formulário na barra de menus e em Executar Editor de Tabela no software SPRAutoLink integrado (consulte Tabela de Materiais). Escolha e clique em BASIC_Immobilization na lista de tabelas de execução disponíveis e siga as etapas do procedimento experimental na tela do computador. O respectivo Editor de Exemplo usado é mostrado no canto superior direito.
   2. Clique em Sample Set Editor na seção Formulário para preencher a lista de reagentes para dois racks colocados no amostrador automático para análises adicionais. Clique em Autosampler Direct Control como uma "Ferramenta" na barra de menus para trazer os racks para frente ou de volta para casa. Escolha 4 °C como temperatura de funcionamento.
      NOTA: O software SPR permite o "Controle Direto do Instrumento SPR" e o "Controle Direto da Bomba" através da seleção das ferramentas correspondentes, bem como do manuseio do amostrador automático e clicando em Formulário; também Executar Editor de Tabela, Data-Plot ou Pós-Processamento pode ser escolhido para executar a análise de dados. Os arquivos são salvos diretamente no diretório padrão e exportados como scrubber.files da janela Pós-processamento.
2. Inicie a bomba para infundir ddH₂0 clicando em Ferramentas e Controle Direto da Bomba e registre os dados clicando em Controle Direto do Instrumento SPR e, cada vez, Inicie nas janelas recém-exibidas. Coloque os reagentes de acoplamento (passo 8.3) em frascos para injetáveis de 300 μL, coloque-os nos racks do amostrador automático e inicie a tabela de execução clicando em Executar.
   NOTA: As superfícies dos cavacos são condicionadas com tampão de glicina de 10 mM pH 9,0 ou podem ter sido lavadas com cloreto de sódio 1 M, tampão de borato de sódio 0,1 M pH 9,0 para condicionar a superfície do chip derivado carboxila para a mistura de ativação EDC/NHS³⁰.
3. Para esta interação proteína-proteína simples, use o chip CMD500D (ver Tabela de Materiais) para gerar uma unidade de índice de micro-refração (μRIU) = 2500 - 3000 célula de fluxo com HA imobilizado e μRIU = 400 célula de fluxo com proteína spike. A uma taxa de fluxo de infusão de 15 μL/min, injetar uma mistura aquosa e igual de 0,4 M de cloridrato de carbodiimida N-etil-N'-(dimetilaminopropil) (EDC*HCl) e 0,1 M de N-hidroxisuccinimida (NHS) aplicando as seguintes etapas sequenciais.
   1. Reencher a bomba de recarga a 25.000 μL/min, realizar o ajuste da linha de base por 30 s, injetar 90 μL de solução de ativação da amostra (EDC/NHS) durante 6 minutos de tempo de contato e, em seguida, segure por mais 5 minutos.
   2. Repita este ciclo após a linha de base correr por 1 min a 10 μL/min apenas na célula de fluxo esquerda (azul) para injetar e imobilizar peptídeos^{quimicamente sintetizados 10}, HA e proteína spike a 20 μg/mL, e permitir o ajuste basal subsequente com ddH₂O por 1,5 min antes de extinguir a superfície do chip ativado com 1 M de etanolamina HCl pH 8,5.
4. Mudar os tubos do amostrador líquido para o desgaseificador de ddH₂0 para o frasco com HBS-EP(+) (figura suplementar 1).
5. Analise os sensorgramas SPR.
   1. Para realizar estudos cinéticos, use várias concentrações de analitos (^10-5-10-8 M), com uma etapa de regeneração após cada injeção e medições em branco após diferentes analitos. Altere a taxa de fluxo para 10 μL/min e inicie as injeções por 4 minutos de tempo de contato, depois 5 min de geração basal e duas etapas de regeneração de 2 min cada com um intervalo de 30 s.
   2. Injetar a solução tampão para medições em branco cujos sensorgramas são subtraídos das amostragens para normalizar diferentes concentrações de proteínas.
6. Clique em Formulário, role para baixo e altere para "Pós-processamento" clicando neste modo de operação. Clique em Adicionar para selecionar curvas de ligação geradas ao longo do tempo no Formulário de Gráfico de Dados para cada célula de fluxo e exporte a sobreposição como um arquivo de depuração (.ovr). Clique em Arquivo para abrir as opções de salvamento de arquivos. Obter curvas de resposta alinhando as curvas esquerda e direita e subtraindo os sinais do segundo canal de referência dos do canal ligante.
   NOTA: Os dados são operados em "Pós-Processamento" definindo sensorgramas computacionalmente. É colocado em uma sobreposição de sensorgramas de células de fluxo esquerda e direita, ou representado como sensorgramas da diferença de ambos os canais.
7. Limpe todo o fluídico com tampão de glicina 50-100 mM pH 9,5, água e etanol a 20% antes e depois das medições de ligação para remover vestígios de sal ou qualquer contaminação proteica, ou mais rigoroso, com SDS a 0,5% e glicina.
   NOTA: Para evitar danos ao instrumento, recomenda-se verificar a estabilidade mecânica do chip de vidro antes de reinserir o cartucho do chip no instrumento se os chips tiverem sido armazenados sob buffer ou a 100% de umidade.

Uma molécula CVN2L0 trocada por domínio dimérico é testada para ligação à região superior do AH em três experimentos SPR separados e a afinidade de ligação é apresentada em valores de KD. Assume-se que o domínio B compreende sítios de ligação H, que são impactados pela substituição de uma ligação dissulfeto em resíduos iônicos, e o domínio A forma L10,18. Injeções únicas de CVN2L0 e variantes V2 (três pontes de dissulfeto) e V5 (duas pontes de dissulfeto) são primeiro testadas para ligação ao chip sensor acoplado a HA para estimar as capacidades de ligação antes de configurar a medição cinética usando o amostrador automático e o editor de mesa de execução (Figura 3A e Figura 2 Suplementar). Injeções repetidas são automatizadas para uma série de CVN2L0, V2 e V5 em várias concentrações na faixa nanomolar e μ-molar no sistema ao longo do tempo (Figura 3B-D). Correlacionando o número de ligações Cys-Cys intactas, o CVN2L0 é o AH imobilizado de ligação a KD = 255 nM quando atinge uma boa saturação. Nesse caso, ambos os valores de KD, calculados a partir de dados cinéticos ou ajustando os dados de equilíbrio à isoterma de ligação de Langmuir, estão em concordância moderada (Tabela 1 e Figura Suplementar 3, Figura Suplementar 4).

Figura 3: Ensaio de ligação SPR para ligação de ligantes através de interações multivalentes. CVN2 (WT) e variantes de sítio de ligação V2 e V5 com substituições de dissulfeto na bolsa de ligação a carboidratos de alta afinidade são testados para ligação covalentemente imobilizada HA. (A) As curvas de ligação das células de fluxo esquerda e direita de CVN2, V2 e V5 podem ser extraídas do protocolo de execução SPR, e os sensorgramas são resumidos em uma sobreposição. (B) Sensorgrama do experimento SPR convencional mostrado como análises cinéticas para ligação de CVN2L0 a HA, injetando concentrações de analito de 10-4 a 10-8 M. CVN2L0 é medido até a maior concentração em 1,5 μM (linha superior) e até 500 nM (linha de fundo), para o qual nenhuma saturação na superfície do chip nem ligação de equilíbrio é alcançada. RU = Unidades de resposta. Um chip sensor CMD500D é usado. (C) Sensorgrama SPR para ligação V2 ao AH. (D) V5 vinculativa ao HA. A figura (B-D) é reproduzida com permissão da referência10. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Afinidades de ligação do CVN2 e variantes ao AH medidas via SPR. O Scrubber 2.0 (um software BioLogic) é utilizado para ajustar curvas de associação e dissociação SPR em tempo real e para calcular as constantes de dissociação de equilíbrio (KD) a partir de dados cinéticos e de equilíbrio. Ka = constante da taxa de associação. Kd = constante da taxa de dissociação.

Enquanto os valores de KD para ligação de CVN2L0 e V2 ao AH estão ambos na faixa nanomolar, V5 é diminuído na ligação (Tabela 1). Em V5, duas ligações dissulfeto são substituídas por resíduos de emparelhamento iônico que retreinam potenciais interações iônicas entre resíduos mutantes de Glu e Arg (Figura 2A,3D). Os dados primários são analisados seguindo as equações integradas de taxa de associação e taxa de dissociação, que descrevem a cinética de ligação da interação do CV-N solúvel com o ligante imobilizado e a dissociação do complexo formado da superfície do chip. Duas medições independentes são realizadas e sensorgramas, equivalentes aos obtidos a partir de replicações, são analisados. KD é calculado como o quociente de koff/kem (Tabela Suplementar 1)10,35. No entanto, KD está relacionado com os dados de equilíbrio que se ajustam à isoterma de Langmuir 36, onde a resposta de ligação ao equilíbrio é plotada em função da concentração do analito (Figura Suplementar 3A,4A,3B,4B). De forma dependente da concentração, a constante da taxa de dissociação kd é determinada após análises e incorporada no ajuste da fase de associação (kon) para estimar a constante da taxa de associação ka. (Tabela 1, Figura Suplementar 3C, Figura Suplementar 4C).

Em seguida, a ligação do CV-N ao AH é comparada à sua interação com o RBD. A ligação do CV-N WT ao SARS-CoV-2 RBD é medida com afinidade mais fraca (K D = 260 μM, Figura 4A) em comparação com a ligação ao HA (K D = 5,7 nM)8,10,12 e a ligação à proteína S (KD = 18,6 μM, Figura 5). A concentração versus resposta é plotada para a ligação do CV-N WT à RBD, assumindo o direcionamento específico de carboidratos possivelmente conservados na subunidade RBD S1 (Figura 4A). O mesmo gráfico de afinidade é mostrado para a ligação de CVN2L0-V4 ao DM que não é mais analisável devido à substituição de ligações dissulfeto que interferem na ligação de alta afinidade a pequenos peptídeos glicosilados (Figura 4B).

CVN2L0-V4 (2 ligações dissulfeto opostas à substituição assimétrica de resíduos de cisteína por resíduos de Glu-Arg ou aminoácidos anfipáticos Trp e Met) pode formar redes de ligação de hidrogênio não polares em torno do sítio de ligação de carboidratos do pseudodomínio B10. A maior densidade de glicanos na proteína HA atinge a ligação com resíduos polares de Glu-Arg em vez de cistinas (Tabela Suplementar 1), e uma associação com peptídeos manosilados (KD = 10 μM para DM) entre CVN2L0 e modificações em Glu-Arg, mas mostra dissociação descontínua de variantes deste peptídeo monoglicosilado, em particular quando H é modificado em ambos os monômeros. Para a interação entre CVN2L0-V4 com DM, a resposta de 56 μM CVN2L0-V4 injeção produz uma resposta maior do que Rmax. (Figura 4B). V5 (2x Glu-Arg) falha na dissociação do DM ligado à superfície (dados não mostrados). Em suma, as curvas de resposta de concentrações mais baixas diminuem antes de terminar a injeção para todos os sensorgramas em CVN2 ligando-se ao peptídeo sem H nativo e monômero ligando-se ao RBD.

Figura 4: Análises SPR do monômero CV-N WT de ligação ao RBD. K D é calculado ajustando dados cinéticos (lado esquerdo, K D = 260 μM) e comparado com dados de afinidade (lado direito) usando um modelo biomolecular simples para ligação 1:1 entre ligante e analito (KD equil = 274 μM). A resposta de ligação de equilíbrio ou capacidade de ligação é plotada em função da concentração em comparação com as curvas de ligação SPR (0-605 μM CVN). H = Local de ligação de alta afinidade. L = Local de ligação de baixa afinidade. Ambos são encontrados em CV-N e CVN2L0. (B) Ligação dimérica CVN2L0-V4 ao DM, assumindo 2L sem K Danalisável. As concentrações de CVN2L0-V4 são de 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ligação mutante CVN-E41A e CV-N WT à glicoproteína S (A). As setas indicam o início da fase de associação e dissociação. (B) Ligação CVN-E41A à RBD no SARS-CoV-2. Os ligantes são pré-imobilizados em chips de sensor de policarboxilato HC e CMD500D. A subunidade S1 da Covid-19 [Pinto, D. et al.26; e Barnes, C. et al.37] é utilizada para a imobilização do RBD. Vazão: 30 μL/min, 25 °C; dados brutos plotados. Em comparação, a ligação de anticorpos séricos do sangue humano ao RBD com um fator de diluição de 1:200 é representada. (C) Ensaio SPR de ligação do CV-N WT à glicoproteína S que é imobilizada a um nível de resposta de 400 μRIU para capturar CV-N. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Já foi demonstrado anteriormente que o CV-N monomérico com um único L não pode se ligar suficientemente à gp120, mas que a capacidade de neutralização do CV-N requer reticulação de dois sítios de ligação a carboidratos e é predominantemente restaurada pela dimerização para funcionalizar com 2H12,19. Assim, um mutante monomérico CVN-E41A é expresso, que é suspeito de desestabilizar o pseudo-domínio B ou pode interromper a conectividade com o segundo domínio A, como encontrado no CV-N WT. O MONÔMERO CVN-E41A revela estabilidade ao se ligar à proteína S semelhante ao monômero CV-N. Embora a resposta SPR para concentrações de analito de 605-680 μM resulte em unidades de alta resposta e sensorgramas SPR típicos para ligação CV-N WT e E41A, respectivamente, o mutante é instável quando diluído (Figura 5).

Figura 1 Suplementar: Sensorgrama SPR para captura de mimetismo de DM como parte do topo do AH influenza. Captura de tela: Gráfico de dados SPR mostrando o protocolo de execução SPR para a imobilização de DM no chip sensor SPR CMD500D, que é revestido com hidrogel carboximetil dextran de 500 nm e adequado para análises cinéticas de analitos de baixo peso molecular em alta densidade de ligantes. Os chips sensoriais são montados diretamente no detector com óleo de emersão e fixados abaixo de uma célula de fluxo de três portas. Após a têmpera da superfície do chip ativado com 1 M de etanolamina HCl pH 8,5, o CVN2 é injetado duas vezes (concentração = 1 μM e 2 μM, respectivamente). Roxo: Diferença entre a célula de fluxo 1 e a célula de fluxo 2; a resposta é registrada em um intervalo de 0,2 s. Azul: Célula de fluxo 1: 3000-4000 unidades de índice de micro-refração (μRIU) revestidas de uma solução de 400 nM do ligante DM para uma superfície carboxilada ativada. Vermelho: Célula de fluxo de referência 2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Execução manual no chip sensor CMD500D funcionalizado com HA mostrando a ligação dos diméricos CVN2L0-V5, V2 e CVN2L0. Em taxas de fluxo de infusão de 30-50 μL/min, CVN2L0 e variantes de ligação dissulfeto expressas com um His-tag e purificadas sobre Ni-NTA são injetadas na faixa média de μM e testadas quanto à ligação ao AH com uma fase de associação de 3 min e fase de dissociação de 2 min. As injeções são V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subclonado de uma proteína SUMO-fusão (1 μM) e CVN2L0 (2 μM). O tampão de funcionamento a pH fisiológico é utilizado para todas as experiências a 25 °C. Todas as soluções são desgaseificadas e filtradas (0,2 μm) antes da injeção no sistema. Roxo: Diferença entre a célula de fluxo 1 e a célula de fluxo 2; a resposta é registrada em um intervalo de 0,2 seg. Azul: Célula de fluxo 1: 2540 μRIU HA. Vermelho: Célula de fluxo de referência 2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Ligação CVN2 ao AH. Análises de sensorgramas quando as curvas são auto-alinhadas. (A) Sensorgramas zerados e alinhados usando o software Scrubber (à esquerda) e isoterma de ligação mostrando a curva de resposta dependente da concentração aos analitos ligados (à direita). (B) Isoterma de ligação expressa em percentagem de capacidade. (C) Curvas teóricas de associação e dissociação ajustadas computacionalmente. (D) Dados cinéticos em sensorgramas SPR sem curvas ajustadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 suplementar: Ligação CVN2 ao AH. Análises de sensorgramas quando as curvas são alinhadas manualmente. (A) Sensorgramas zerados e alinhados usando o software Scrubber (à esquerda) e isoterma de ligação mostrando a curva de resposta dependente da concentração aos analitos ligados (à direita). (B) Isoterma de ligação expressa em percentagem de capacidade. (C) Curvas teóricas de associação e dissociação ajustadas computacionalmente. (D) Dados cinéticos em sensorgramas SPR sem curvas ajustadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Dados cinéticos obtidos de sensorgramas SPR para a ligação das variantes de ligação CVN2L0 e Cys-Cys V2, V4 e V5 ao AH usando um modelo de ligação Langmuir 1:1. KD [M] = k off/k on  ou kd/ka. Todos os dados são gerados a 25 °C no buffer HBS-EP(+).: Clique aqui para baixar esta tabela.

O autor não tem nada a revelar.