Dissecando, consertando e visualizando o Drosophila Pupal Notum

Summary

O presente protocolo detalha a preparação e visualização do tecido fixo do notum pupal Drosophila . Pode ser usado para tecido intacto ou ferido, e a arquitetura original do tecido é preservada. Os procedimentos de dissecação, fixação e coloração estão descritos neste artigo.

Abstract

As pupas de Drosophila melanogaster ficam imóveis por vários dias durante a metamorfose, durante a qual desenvolvem um novo corpo com um fino ingugumento adulto transparente. Sua imobilidade e transparência os tornam ideais para experimentos de imagem ao vivo in vivo. Muitos estudos se concentraram na monocamadoto epitelial dorsal do notum pupal por causa de sua acessibilidade e tamanho relativamente grande. Além dos estudos de mecânica epitelial e desenvolvimento, o notum tem sido um tecido ideal para estudar a cicatrização de feridas. Após uma lesão, todo o processo de reparação epitelial pode ser capturado por imagens ao vivo ao longo de 6-12 h. Apesar da popularidade do notum para imagens ao vivo, muito poucos estudos publicados utilizaram amostras fixas de notum. Fixação e coloração são abordagens comuns para quase todos os outros tecidos de Drosophila, aproveitando o grande repertório de simples manchas celulares e anticorpos. No entanto, o notum pupal é frágil e propenso a enrolar e distorcer após a remoção do corpo, tornando-se desafiador complementar a imagem ao vivo. Este protocolo oferece um método simples para fixação e coloração do notum pupal, intacto e após ferimentos a laser. Com esta técnica, o lado ventral da pupa é colado até um deslizamento para imobilizar a pupa, e o notum é cuidadosamente removido, fixo e manchado. O epitélio de notum é montado em um slide ou entre dois deslizamentos para facilitar a imagem do lado dorsal ou ventral do tecido.

Introduction

O notum pupal de Drosophila melanogaster tem sido cada vez mais utilizado para estudos de imagem ao vivo na última década porque o animal é imóvel e tem uma cutícula transparente nesta fase 1,2,3,4,5,6,7. No entanto, o notum pupal é desafiador para dissecar e corrigir, dificultando o complemento de estudos de imagem ao vivo com anticorpos e coloração celular. O objetivo geral deste trabalho é criar um protocolo reprodutível para dissecar e fixar o notum pupal para manchas de anticorpos e células em amostras novas ou previamente live-imaged.

À medida que as larvas começam a metamorfose, a epiderme se afasta da cutícula larval, formando um caso de pupal duro⁸. O plano corporal larval é quebrado, e o novo plano corporal adulto é desenvolvido. Durante esse tempo, as pupas são imóveis, tornando-as ideais para imagens ao vivo. Um tecido comumente imaged é o notum pupal, um epitélio monocamado adulto que se forma no tórax dorsal. O notum é visualmente acessível após uma simples dissecção para remover o estojo pupal⁹. Todo o animal pode então ser montado, e o notum pode ser ao vivo por horas ou dias, tornando-se um tecido ideal para estudar comportamentos epiteliais de células durante o desenvolvimento, homeostase e após o ferimento^de 10,11,12,13,14. No entanto, o notum é desafiador para dissecar e corrigir porque é frágil e coberto com uma fina cutícula adulta transparente que é hidrofóbica. Esta cutícula hidrofóbica torna-a propensa a enrolar-se em soluções aquosas quando removida do resto do corpo. Assim, a dissecção e fixação de notum tem sido relatada apenas raramente e a dissecção muitas vezes não é descrita 15,16,17,18. Sem um protocolo detalhado na literatura, é proibitivamente difícil para um pesquisador de Drosophila complementar imagens vivas com coloração de pupas.

Esta técnica visa dissecar e corrigir amostras que foram previamente imagens ao vivo, incluindo aquelas que foram feridas a laser. Como a imagem viva requer a remoção do caso pupal, essa técnica de dissecção começa removendo o caso pupal anterior, ao contrário dos protocolos anteriores que fixam ou bissectam pupae dentro do caso pupal ^4,19,20. O notum é um tecido frágil, e a ferida pode exacerbar sua fragilidade. Assim, para sustentar esse tecido delicado, o integumento (o epitélio e a cutícula adulta transparente anexada) do notum e parte da cabeça e abdômen são dissecados longe do resto da pupa enquanto sempre submersos em um ambiente aquoso. Este método reduz a probabilidade de o tecido enrolar e ser inutilizável. Esta técnica tem manchado com sucesso tecido de notum ferido tão cedo quanto 30 min de ferimentos pós (Figura 1E-H) e a 3 h de ferimentos pós (Figura 1I-L). Espera-se que este protocolo seja eficaz durante a duração do desenvolvimento de notum ou reparo de feridas. A técnica atual será útil para pesquisadores que desejam unir as capacidades de imagem ao vivo do notum pupal com a abundância de reagentes imunohistoquímicos disponíveis.

Protocol

Drosophila melanogaster (moscas frutíferas) foram mantidos a 25 °C em um meio padrão de farinha de milho-melaço. Os estudos foram realizados em pupae histone H2A marcada por EGFP (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). As moscas foram obtidas de um centro público de estoque (ver Tabela de Materiais).

1. Imobilização pupae

1. Aplique uma tira de 2" de fita dupla face em um slide de microscópio.
2. Identifique prepupae branca em frascos levantados a 25 °C e use um marcador para indicar sua localização fora do frasco. Retorne os frascos para 25 °C.
   NOTA: Prepupae branco são caracterizados por sua imobilidade, cor branca e espirros sempreados. Estes formam 0-1 h após a formação de pupário (APF), ou estágio P1⁸.
3. 12-15 h depois, remova cuidadosamente 3-4 das pupas indicadas (sem estalá-las) usando um escopo de dissecção e colete-as no slide do microscópio ao lado da fita.
   NOTA: Pupae agora será estágio P5 com um saco de cabeça sempre visível no final anterior do pupae⁸.
4. Coloque a pupa pelo menos uma largura de pupa separada na fita com seus lados ventral para baixo.
5. Coloque uma gota de cola adesiva em um filme de parafina (ver Tabela de Materiais) ou em uma tampa de tubo de centrífuga. Mergulhe a ponta de pipeta de 0,1-10 μL (sem pipeta) na gota de cola adesiva. Toque na ponta da pipeta duas vezes em uma tampa de 24 mm x 60 mm (1,5 de espessura), 1 cm x 1 cm de distância de um canto, criando uma linha de cola adesiva ~1/2 no comprimento da pupa.
6. Predefinir uma pipeta de 0,2-2 μL (P2) a 2 μL, e uma pipeta de 200 μL (P200) a 200 μL, e encaixá-las com pontas para que estejam prontas para serem preenchidas com 1x PBS + 0,1 mM Ca²⁺, que solidificará rapidamente a cola adesiva no contato.
7. Insira fórceps (ver Tabela de Materiais) perto do lado da cabeça e remova suavemente a caixa do anterior para o posterior⁹. Remova o máximo possível do caso. Segure as pernas em desenvolvimento da pupa com um par de fórceps contundentes e puxe cuidadosamente a pupa de seu estojo.
   NOTA: Uma pequena ruptura na porção ventral da pupa não será prejudicial a este procedimento.
8. Coloque a pupa no canto da mancha.
9. Segure a pupa no abdômen posterior ou na asa em desenvolvimento com fórceps contundentes, levante e coloque o lado ventral da pupae para baixo na linha de cola adesiva.
10. Encha rapidamente a pipeta P2 com 2 μL de 1x PBS + 0,1 mM de Ca^2+, e segurando-a no ar, expela apenas o suficiente para formar uma pequena bolha na ponta (0,25-0,5 μL).
11. Toque na pequena bolha da solução para um lado da pupae na base do tórax, em seguida, repita do outro lado.
    NOTA: Isso solidificará uma pequena quantidade da cola adesiva para manter a pupa no lugar. Geralmente, todas as soluções não serão utilizadas.
12. Encha a pipeta P200 com 200 μL de 1x PBS + 0,1 mM de Ca²⁺, em seguida, coloque a ponta da pipeta sobre o tórax e expulse o conteúdo para submergir completamente a pupa. O restante da cola adesiva se solidificará imediatamente.
13. Remova ~100 μL da solução PBS, de modo que a pupa mal fique submersa antes de prosseguir imediatamente para o próximo passo.
    NOTA: Para amostras não enroladas, comece a partir da etapa 1.1. Para as amostras parcialmente dissecadas, comece na etapa 1.5. Ferimentos via ablação a laser foram descritos anteriormente^14,21. As etapas de imobilização, dissecção e montagem precisam ser realizadas usando um microscópio de dissecção.

2. Dissecando o notum

1. Segure um par de tesouras de microdisseção que abracem um lado da alça contra o dedo indicador da mão dominante e o dedo médio, de modo que o polegar da mão dominante aplique a força de corte (Figura 2A,B).
2. Estabilize o pescoço da tesoura contra o dedo médio da mão não dominante enquanto prepara a mancha com o dedo anelar da mão não dominante.
3. Corte no meio do abdômen dorsal para criar um pequeno orifício, ~0,2-0,5 mm. Alguns hemoliptos geralmente derramam e é um bom indicador da brecha.
4. Faça pequenos cortes de 0,5-0,75 mm através do ingíguo posterior para anterior, cercando o tecido dorsal para isolá-lo. Para criar um tecido o mais plano possível, evite cortar muito ventrally; apenas a "cúpula" dorsal do tórax deve ser removida juntamente com pequenas seções da cabeça e abdômen.
5. Repita os cortes posteriores ao anterior do outro lado da pupae.
6. Gire o estágio de dissecção para permitir um corte limpo na cabeça, se necessário.
   NOTA: Nesta fase, o integumento dorsal, ou notum, será separado do resto da pupa. Se ele aparecer separado, mas não for facilmente movido, alguns cortes abaixo do távio podem ajudar a desalojá-lo.
7. Adicione ~200 μL de 1x PBS ao centro do deslizamento de tampa e faça um canal conectando-o à gotícula de dissecção original arrastando suavemente a ponta pipeta através do vidro de cobertura da nova gota para o original.
8. Usando um par de fórceps contundentes, empurre suavemente ou arraste o notum isolado para o centro da tampa e gire, de modo que o lado interno fique de frente para cima. Nunca remova o tecido da gota.
   NOTA: É essencial afastar o notum do local de dissecção original para evitar resquícios da cola adesiva que oclui a amostra durante a imagem posterior.
9. Segure o notum para baixo com os fórceps contundentes pressionando as seções abdominais ou da cabeça. Usando um par de fórceps afiados e/ou expulsões suaves de 1x PBS de uma pipeta de 200 μL, remova qualquer corpo de gordura restante, faixas musculares ou hemisfânficos (se presentes) para expor totalmente o epitélio monocamado e tornar a eventual coloração mais uniforme. O notum dissecado deve aparecer como na Figura 3A.
10. Uma vez que o tecido esteja limpo, use uma pipeta de 200 μL para remover o máximo possível da solução PBS (juntamente com detritos e a parte ventral da pupa), monitorando com um escopo de dissecção para evitar aspirar o notum.
11. Uma vez que a maior parte do líquido tenha sido removida, use um tecido absorvente para limpar cuidadosamente o resto da cola adesiva e pupa, bem como quaisquer outros detritos que permaneçam na tampa.
    NOTA: Se alguma cola adesiva permanecer na tampa, não causará um problema desde que seja mais fina do que o próprio tecido dorsal.
12. Adicione 150-200 μL de 4% PFA (em 1x PBS) e fixe por 20 min na temperatura do quarto. Dependendo da velocidade de dissecção, 1 ou mais pupas podem ser dissecadas durante a fixação da primeira pupa.
13. Remova o PFA e substitua-o por 1x PBS para lavar o notum uma vez por 30 s.
14. Se continuar com a coloração de anticorpos, realize 5 min de lavagem (3 vezes) em 1x PBS ou 1x PBST (Arquivo Suplementar 1) para permeabilize o tecido se o antígeno for intracelular.
15. Armazene a amostra em 1x PBS + 0,02% NaN₃ durante a noite em uma câmara umidificada, ou se planeja mantam o tecido, incubar durante a noite na solução de bloqueio (Arquivo Suplementar 1).

3. Manchando o notum

NOTA: Para coloração usando anticorpos ou manchas celulares siga os passos abaixo. -O notum não deve ser removido da solução, pois isso provavelmente fará com que o tecido se enrole. Assim, adapte os protocolos de coloração a serem conduzidos inteiramente no deslizamento de tampas e mantenha em uma câmara umidificada por quaisquer passos com mais de 5 minutos. Monitorar as amostras sob um microscópio de dissecção pode ajudar a prevenir a aspiração acidental do tecido durante as lavagens.

1. Para visualizar as bordas celulares, incubar em 200 μL de anticorpo igG2a do mouse primário anti-FasIII (ver Tabela de Materiais) a 1:8 de concentração diluída em Buffer de Bloqueio + 0,02% NaN₃ durante a noite a 4 °C.
2. Lave o excesso de anticorpo primário (3 vezes) com 200 μL de 1x PBS + 0,02% NaN₃ para 1 h por lavagem à temperatura ambiente.
3. Realize a incubação secundária de anticorpos com 200 μL de 1:200 de concentração anti-mouse IgGa2 em Cy3 em Buffer de Bloqueio + 0,02% NaN₃ para 2 h em temperatura de quarto.
4. Lave o excesso de anticorpo secundário (3 vezes) com 200 μL de 1x PBS + 0,02% NaN₃ para 1 h por lavagem à temperatura ambiente.
5. Para visualizar os núcleos, incubar amostras em 1 μg/mL de DAPI por 45 minutos para permitir tempo suficiente para a mancha penetrar através de faixas musculares; a fixação em um meio de montagem contendo DAPI não é eficaz com este tecido.
6. Lave o excesso de DAPI (3 vezes) com 200 μL de 1x PBS + 0,02% NaN₃ por 5 min por lavagem em temperatura ambiente, depois deixe em 200 μL de 1x PBS + 0,02% NaN₃ durante a noite a 4 °C, ou monte imediatamente.

4. Montagem e visualização do notum

1. Após a coloração, prepare um novo deslizamento de tampas de 24 × 60 (topper) com suportes.
   NOTA: Como o notum é em forma de cúpula, achatá-lo completamente resulta em tecido enrugado distorcido. Criar uma lacuna entre as duas tampas permite que o notum mantenha sua forma normal.
2. Crie uma lacuna de ~200 μm usando espaçadores feitos de 22 x 22 tampas (no. 0 espessura, ~100 μm de espessura), aderido ~1 cm de distância com esmalte no meio do topper.
3. Para aderir, coloque os espaçadores no topper e pinte as bordas distais dos espaçadores com uma fina camada de esmalte. Deixe secar.
   NOTA: Use apenas um esmalte fino e escorrendo; esmalte grosso vai adicionar espaço adicional desnecessário entre o deslizamento de tampa e topper.
4. Remova o máximo possível da solução aquosa da amostra.
5. Aplique imediatamente duas gotas (~100 μL) de meio de montagem anti-fade (ver Tabela de Materiais) na amostra.
6. Se necessário, use fórceps limpos e afiados para posicionar o notum no centro da gotícula média de montagem anti-fade.
7. Coloque a mancha de cobertura com o notum sobre um suporte ~10 x 40 mm, como um pedaço de espuma fina (cortado do material de embalagem dentro das caixas de deslizamento de cobertura), para elevar a amostra para que ela não adere à superfície de trabalho.
8. Sob um escopo de dissecção, abaixe lentamente o topper sobre a amostra. Uma vez que o meio de montagem anti-fade se encontre com o topper, solte suavemente e permita que a ação capilar puxe o topper para baixo.
   NOTA: Nos primeiros segundos, pequenos ajustes podem ser feitos na posição de deslizamento de cobertura sem danificar o notum.
9. Coloque outro pedaço de espuma no topper e use um slide de microscópio padrão como peso para persuadir suavemente o meio de montagem anti-fade entre o deslizamento de tampa da amostra, topper e espaçadores.
10. Após 5-10 min, use um tecido absorvente para afastar qualquer excesso de excesso de montagem anti-fade, tocando suavemente as bordas do deslizamento de tampa.
11. Aplique suavemente esmalte em cada canto das tampas para aderir a eles juntos. Uma vez seco, pinte todas as bordas das tampas para selar. Evite revestir todas as bordas primeiro, pois isso pode muitas vezes mudar a tampa e danificar o tecido dorsal.
12. Visualize o notum sob microscopia de fluorescência (ver Tabela de Materiais) através do lado dorsal e/ou ventral.

Results

A técnica apresentada funciona bem no notum não rosnado (Figura 1A-D), permitindo a investigação do desenvolvimento e da homeostase do tecido, por exemplo, a formação das células de cerdas mecanosensoriais poliploides¹⁸, ou o anterior ao fluxo posterior das células epiteliais¹⁰. Este protocolo também é aplicável a um notum ablado a laser (Figura 1E-L), onde a resposta celular à lesão pode ser analisada ao vivo com fluoroforos endógenos como Histone2-EGFP (Figura 1B,F,J). A mancha pós-coloração com imunohistoquímica (passo 3) pode revelar muitas características, como a Fasciclin III, que rotula as bordas celulares (Figura 1C,G,K). Além disso, manchas quantitativas como DAPI (Figura 1A,E,I) podem ser usadas para avaliar alterações de conteúdo de DNA, incluindo poliploide induzida por feridas²².

O protocolo atual é particularmente benéfico, pois pode ser usado após experimentos de imagem ao vivo de longo prazo. Como as pupas são imóveis, elas podem ser imagens por horas (Figura 4A,B). É importante ressaltar que este protocolo não causa alterações consideráveis na arquitetura geral ou morfologia do epitélio da ferida após a dissecção (Figura 4B,C). Assim, as características dentro do tecido poderiam ser imagens a longo prazo e, em seguida, investigadas com imunohistoquímica ou manchas celulares.

A imagem profunda dentro dos tecidos é complexa devido à sua opacidade, e a Drosophila é revestida em uma cutícula^{cerada 8} tornando a imagem profunda ainda mais difícil. No entanto, com esta técnica, pode ser colocado um notum dissecado entre dois deslizamentos de cobertura permitindo a imagem da monocamada epitelial de ambos os lados: o lado apical através da cutícula (Figura 5A-D) e/ou o lado basal do epitélio que enfrenta a cavidade corporal (Figura 5E-H). Essas diferentes visões são idealmente adequadas para visualizar diferentes estruturas dentro do tecido. Por exemplo, a visão apical é ideal para visualizar bordas de células epiteliais e núcleos que ficam logo abaixo da cutícula (Figura 5A-D). Com a visão basal, esses sinais apical são menos visíveis (Figura 5E-H). No entanto, as estruturas basais são observadas na margem da ferida (Figura 5J,L amarelas, setas brancas). Essas estruturas basais são muito mais brilhantes, pois há menos oclusão na vista basal do que na visão apical.

Figura 1: Dissecou, fixou e manchou nota pupal de Drosophila. (A-D) Notum desenrolado. (E-H), Notum ferido 30 min após ablação a laser. (I-L) Notum ferido 3 h após ablação a laser. (A,E,I) A mancha da DAPI mostra núcleos. (B,F,J) Histone2-EGFP transgênico, usado em imagens vivas, é visível após a fixação e coloração. (C,G,K) O anticorpo anti-FasIII mostra que as manchas de anticorpos funcionam bem no notum fixo. (D,H,L) Imagem mesclada. As imagens são capturadas com objetivo de 40x usando microscopia de disco giratório, projeções de intensidade máxima de z-stacks são mostradas com fatias Z de 0,3 μm. A-D representa 263 fatias Z. O E-H representa 195 fatias. I-L representa 53 fatias Z. A linha laranja tracejada denota margem de ferida. A barra de escala em L é de 25 μm, aplicável a A-L. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Colocação manual para dissecção de notum. (A-B) Vistas esquerdas e direitas da colocação manual para segurar a tesoura de microdisseção. Para evitar o aperto de mão, o pescoço da tesoura é colocado contra o dedo médio da mão não dominante. A tesoura precisa ser paralela ao slide do microscópio para evitar a deformagem do tecido notum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Notum dissecado corretamente vs. notum enrolado. (A) Pós-dissecção de notum pupal e limpeza sem enrolação e pronto para fixação. (B) Pupal notum enrolado em si mesmo depois de ser removido de 1x PBS, tornando-o inutilizável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: As imagens pré e pós-fixadas são em grande parte semelhantes. Um notum pupal expressando Histone2-EGFP nos núcleos foi imageado (A) ao vivo antes da ablação e (B) 3 h após a ablação a laser. (C) O notum foi recuperado, dissecado e corrigido conforme mencionado no protocolo e re-imaged após a fixação. O local da ferida está rotulado com uma estrela vermelha. As imagens foram capturadas com objetivo de 40x usando microscopia de disco giratório, fatias Z foram tiradas a cada 0,3 μm. Projeções de intensidade máxima de 34 fatias Z pré-feridas (A), 48 Z-slices 3 h após o ferimento (B) e 103 fatias Z pós-dissecção, fixação e coloração (C). A barra de escala em C é de 25 μm, aplicável a A-C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens apical e basais de um notum ferido. O mesmo notum pupal ferido é mostrado em todos os painéis. A ferida está marcada com uma estrela vermelha. A linha pontilhada laranja indica a margem da ferida. (A-D) O notum é imageado do lado apical, através da cutícula. (E-H) O notum é imaged do lado interior basal. (I-L) Os painéis superiores mostram uma imagem X-Z do notum, lado apical para cima, com a folha epitelial designada por um triângulo branco. A linha laranja denota o plano apical-basal da fatia X-Y, mostrado nos painéis inferiores. Dentro dos painéis inferiores, a linha laranja mostra o plano da imagem X-Z acima. (I) Apicamente imaged notum - apical slice. A visão superior X-Z mostra imagens precisas da folha epitelial apical (triângulo branco). Esta visão é equivalente a uma exibição de imagem ao vivo. (J) Notum apicamente imageado - fatia basal, parcialmente obstruída por tecido apical. Outros tecidos denotados por seta amarela (possível faixa muscular) e setas brancas (possíveis glóbulos sanguíneos) são visíveis no lado basal. (K) Notum imagem basal - fatia apical, parcialmente obstruída por tecido basal e cicatriz de ferida (área central escura). (L) Notum imagem basal - fatia basal. Esta vista mostra melhor os tecidos basais denotados com setas amarelas e brancas. A,E: Mancha DE DAPI, B,F: Histone-EGFP, C,G: Mancha de FasIII. As imagens foram capturadas com objetivo de 20x com microscopia de disco giratório. As fatias Z foram tomadas a cada 0,9 μm. A-D mostra a projeção de intensidade máxima de 19 fatias. E-H representa a projeção de intensidade máxima de 17 fatias. Barras de escala de 25 μm em D,H,L aplicam-se a A-D, E-H, I-L, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Complementar 1: Elaboração de soluções e buffers. As receitas para as seguintes soluções são detalhadas: 1xPBS, 1x PBST, solução de bloqueio e fixação em paraformaldeído. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

Passos críticos
Otimizar três etapas aumentará drasticamente o sucesso deste protocolo. Primeiro, na etapa 1.5, esteja poupando com a cola adesiva aplicada na tampa. Se muito cola adesiva for adicionada, a pasta pode ficar sepultada em uma espessa camada de cola adesiva solidificada, o que tornará impossível a dissecção, e se cobrir o próprio notum, a cola adesiva ocluirá a luz da amostra. Em segundo lugar, durante as etapas 2.3-2.6, certifique-se de remover apenas a cúpula superior do notum, excluindo o máximo possível do tecido lateral. Se incluído, o tecido lateral ficará comprimido durante a montagem e fará com que o meio do notum se aperte para dentro, muitas vezes colocando-o fora da distância de trabalho de objetivos de abertura numérica alta. Em terceiro lugar, durante a etapa de limpeza 2.9, deve-se tomar cuidado extremo para não danificar o epitélio monocamadas. Se o tecido tiver grandes porções faltando ou nenhum sinal puder ser detectado, este passo é provável que a culpa seja.

Solucionando problemas
Edição 1: Após a montagem, a pupa sai da fita de dupla face durante a dissecação. Esta é uma questão comum, especialmente para iniciantes. O melhor remédio é garantir que o exterior da caixa de pupas esteja completamente seco/livre de detritos alimentares. Remover alimentos com um par de fórceps contundentes e permitir que a caixa seque por 10-15 min ajudará a aderir à fita. Alternativamente, use a mão não dominante e um par de fórceps contundentes para segurar a pupae contra a fita durante a dissecção. Se o problema persistir, aplicar uma pequena gota de esmalte de 5-10 μL na base da extremidade posterior da caixa e permitir que ele endureça geralmente fornece adesão suficiente até mesmo para o unruliest de pupae.

Problema 2: O Notum entra em colapso durante a etapa 2.3, ou a brecha inicial através do integumento não é suave. Se o integumento é difícil de romper, pode haver muita cola adesiva das etapas de imobilização. Colocar a pupae dissecada em cola menos adesiva melhorará essa questão. Além disso, certifique-se de que a tesoura de microdisseção esteja afiada. A tesoura sem corte não será capaz de cortar o integumento e tendem a fazê-lo entrar em colapso para dentro. Uma vez que o hemoglifo desmaia da pupa, certifique-se de que uma das lâminas de corte possa entrar na pupa sem fazer com que o notum se deforme. Se o notum entrar em colapso e a lâmina não entrar na pupa, continue cortando até que uma lâmina entre na pupa.

Edição 3: Durante a etapa 2.4, a tesoura pega ou arrasta o integument. Se a tesoura começar a pegar ou arrastar o integumento, muitas vezes ajuda a mudar para o lado oposto da pupae e continuar a 'soltar' o integument. Outras tesouras de microdisseção contundente dificultarão a obtenção de cortes limpos através do integumento, e a tesoura afiada deve ser usada.

Problema 4: A amostra é acidentalmente aspirada durante a coloração (etapas 3.1-3.6). O notum dissecado é desafiador de se ver porque é transparente. Pode ser útil colocar uma folha azul escuro ou preta abaixo da mancha de cobertura para fornecer contraste (um antigo rack de suporte de ponta de pipeta funciona bem.) Além disso, todas as alterações de solução podem ser realizadas sob um microscópio de dissecção.

Problema 5: Nenhum sinal é detectado/sinal irregular é detectado. Depois de descartar problemas específicos da mancha, se nenhum sinal for detectado ou for irregular, a etapa 2.9 (limpeza) é provavelmente a culpada. Um sinal ausente ou irregular pode se originar de danos e remoção do tecido epitelial durante a limpeza. Por outro lado, um sinal ruim pode ser causado pela oclusão das bandas musculares/células do corpo de gordura se não forem removidas, pois podem limitar a difusão de manchas e anticorpos no notum em relação ao tecido circundante. Se o tecido estiver danificado, ser mais suave durante a limpeza é a melhor solução. Se, em vez disso, a mancha for visível, mas irregular, o aumento do vigor/tempo dedicado à etapa de limpeza é recomendado para remover o máximo possível do músculo e corpo de gordura. Além disso, aumentar a duração da mancha pode ajudar a resolver esse problema com uma melhor limpeza.

Problema 6: O tecido de notum tem uma aparência distorcida/enrugada durante a imagem. Deformar e enrugamento do tecido vêm de duas fontes. Primeiro, comprimir o notum durante a montagem fará com que ele aperte e deforme. A melhor solução é remover o máximo possível dos tecidos laterais para que a cúpula seja o mais curta possível e possa caber entre os espaçadores de deslizamento de tampa. Em segundo lugar, se o notum for dobrado durante a dissecação, esta curva não se endireitará durante a montagem, por isso deve-se tomar cuidado extra para não deformar o notum durante a dissecação. A dobra acidental do notum é mais comum ao cortar o integument longe do resto da pupa. É tentador ter a tesoura de dissecção em um ângulo relativo à pupa em vez de mantê-las no plano de amostra como a pupa. No entanto, a tesoura angular faz com que o integumento se aperte para cima quando cortado em vez de permanecer plano.

Métodos, limitações e aplicações futuras existentes
Wang et ^al.20 relataram um protocolo de dissecção comparável para o isolamento do epitélio pupal. Esta técnica exige que a pupa permaneça dentro de seu estojo e seja rapidamente bisseccionada com um bisturi. Este protocolo é incompatível com amostras de imagens vivas anteriormente, pois a imagem ao vivo requer a remoção de uma grande parte do caso pupal. Como pupas não têm rigidez, a biseção pupal fora do caso destruiu o tecido, inspirando a criação desse protocolo. A técnica aqui detalhada permite o isolamento e fixação do notum, e pode ser usada como primeiro passo para uma ampla gama de outros métodos, como criosectioning, hibridização in situ ou microscopia eletrônica.

Essa técnica tem algumas limitações. Primeiro, dissecar, fixar e colorir o notum é mais demorado do que a imagem viva fluorescente marcada proteínas no notum, o que requer apenas uma dissecção simples para remover o caso pupal ^9,23. Em segundo lugar, em comparação com dissecções de outros tecidos de Drosophila, essa dissecção é mais difícil por causa do tecido fino, frágil e cutícula hidrofóbica. Para simplesmente visualizar proteínas na epitélia Drosophila, a imunohistoquímica em embriões fixos, discos de asa larval ou ovários é mais fácil. No entanto, essa técnica permite que o poder da imagem ao vivo seja emparelhado com fixação e coloração, tornando-a uma ferramenta poderosa uma vez dominada.

Uma técnica de dissecção/fixação tem algumas vantagens em relação à imagem ao vivo. Estruturas basais (interiores) podem ser melhor resolvidas com uma visão basal (Figura 5L,J). Mais importante, a imagem viva é limitada a fluoroforos que devem ser fornecidos geneticamente, muitas vezes exigindo longos esquemas de travessia genética. Em contrapartida, o presente protocolo permite a aplicação de manchas, imunohistoquímica e outras técnicas que requerem dissecção e fixação. Isso aumenta drasticamente o número de sinais sondados no tecido, ao mesmo tempo em que potencialmente diminui o tempo para resultados experimentais.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ ” Fita Dupla Face Permanente Scotch	3M	665
0.1-10 µ Ponteira de pipeta L uTIP	Biotix	M-0011-9FC
22 x 22 mm No. 0 lamínulas de espessura	Thomas Scientific	1207Z28
24 x 60 mm lamínula	Corning	2980-246
3M VetBond	3M	1469SB	Chamado de "cola adesiva" no protocolo
Anti-FasIII primário Mouse IgG2a	Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma	7G10
Cloreto de cálcio	Fisher Chemical	c79-500
Cy3-conjugado AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a	Jackson ImmunoResearch	115-165-206
DAPI	Sigma Aldrich	D9542-1mg
Dumont # 5 Pinça de ponta fina	Ferramentas de ciência fina	No. 11254-20
Dumont # 5 Pinça de ponta fina: Blunt	Fine Science Tools	No. 11254-20	Pinças muito usadas e não afiadas, ou embotadas com uma pedra de amolar
Lâminas de microscópio duplas foscas Fisherbrand	Fisher Scientific	22-034-486
		de
	Câmara Umidificada Genesee Scientific	49-101
: Pequeno recipiente embrulhado em papel alumínio forrado com papel de filtro saturado com água	Cole-Parmer	759075D	Uma grande câmara umidificada pode ser feita a partir da caixa de isopor contendo cubetas Cole-Parmer, 759075D, preenchida com 50 ml de água.
KimWipe	KimTech	34155	Chamado de "Tecido Absorvente" no protocolo
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Eclipse Ti2-E
NIS Elements Software	Nikon	AR
Parafilm	Pechiney Embalagem Plástica	PM-996
Paraformaldeído (PFA) 16%	Ted Pella, Inc	18505
Frascos de Plástico	Genesee Scientific	32-114
Azida de Sódio (NaN3)	Fisher Scientific	19038-1000
Microscópio de Microdissecação Estéreo	Carl Zeiss	STEMI 2000
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00	Tesoura nova ou recém-afiada
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000	Chamado de "meio de montagem antifade" no protocolo
Vecta Shield com DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Não é ideal para pupal notum.
X-Light V2 Lente de Crista de Disco Giratório		V2 L-FOV