Metodologia para testar agentes de controle e inseticidas contra o café Berry Borer Hypothenemus hampei

O borer de café (CBB), Hypothenemus hampei, foi detectado pela primeira vez em 1988 na Colômbia e desde então tornou-se a espécie de praga mais importante da cultura do café. As fêmeas da CBB deixam o fruto natal já fertilizado, buscando novos frutos guiados pelos produtos químicos voláteis que emitem ^1,2. Um ciclo completo é cumprido dentro de 23 dias³ a uma temperatura de 25 °C. O ciclo começa com a fêmea fundadora penetrando na semente e colocando ovos no endosperm de frutas. As larvas fechadas comem a semente. Se os frutos forem dissecados neste momento, seria possível observar tanto a fêmea fundadora quanto sua prole. Após 14 dias, as larvas se tornam pupas-geralmente, o estágio pupae dura 5 dias. Na fase adulta, as fêmeas copulam com seus irmãos, e as fêmeas recém-fertilizadas voam para longe das frutas danificadas em busca de novas frutas de café para iniciar um novo ciclo⁴.

Tanto o processo de penetração quanto o resultado da alimentação larval prejudicam a semente do café, diminuindo a qualidade da bebida do café e reduzindo significativamente a receita; maiores que 5% de infestação em plantações de café é geralmente considerado o limiar econômico.

O controle da CBB baseia-se em uma estratégia integrada de manejo de pragas (IPM), incluindo controle cultural e práticas agronômicas, agentes biológicos naturais e o uso de inseticidas químicos, que requer condições de segurança e aplicação oportuna⁴.

Para avaliar novos inseticidas para o controle da CBB, são necessárias metodologias de baixo custo que permitam a obtenção de resultados rápidos. Tanto procedimentos laboratoriais quanto de campo estão atualmente em uso, incluindo dietas artificiais contendo café em que os inseticidas são incorporados ^5,6, ou pulverização dos inseticidas no café pergaminho seco ^7,8,9. Além disso, foram relatados experimentos realizados no campo utilizando galhos de cafeicultos cobertos com mangas entomológicas^{, 10,11}; no entanto, esses métodos requerem trabalho intenso e longos períodos de avaliação.

Uma condição que se assemelha às condições naturais do campo, que também é rápida e barata, é o uso de frutas de café verdes ou maduras. No entanto, essas frutas devem ser mantidas em condições adequadas para o desenvolvimento da CBB, evitando alterações e contaminantes por microrganismos para manter sua qualidade e propriedades. Para isso, foram utilizados diferentes desinfetantes, bem como procedimentos envolvendo calor e radiação 7,9,12,13,14,15,16.

Além disso, os métodos de avaliação de inseticidas em relação à CBB exigem simulações de fêmeas adultas voando em busca de frutas ou penetrando nessas frutas^17,18. Para isso, foram realizadas infestações artificiais de frutas no campo ^8,11,19, embora esse processo seja intensivo em mão-de-obra e dependa das condições ambientais.

Aqui, descrevemos uma metodologia padronizada para avaliação de produtos que podem ter diferentes efeitos sobre a CBB em condições ambientais controladas que se assemelham às condições do campo.

NOTA: Este protocolo aborda diferentes métodos para identificar diferentes efeitos sobre a CBB em condições laboratoriais.

1. Coleta de frutas

1. Escolha GFs com uma idade de desenvolvimento de ~120-150 dias depois de florescer de árvores em uma plantação de café no início da manhã.

2. Desinfecção de frutas²⁰

1. Leve cerca de 300 GFs para o laboratório. Selecione GFs uniformemente dimensionados e saudáveis e retire os peduncles.
2. Mergulhe os GFs em uma solução de sabão (2 mL de sabão líquido de lavagem de louça em 998 mL de água da torneira), seguido de esfregar para lavar os GFs. Em seguida, enxágue as frutas com água, trocando a água três vezes.
3. Mergulhe os GFs em solução de hipoclorito de sódio de 0,5% (100 mL em 900 mL de água da torneira) e mexa em um agitador a 110 rpm por 15 min. Em seguida, enxágue os GFs com água mexendo em um agitador e trocando a água três vezes, a cada 10 minutos.
4. Seque os GFs com toalhas de papel estéreis.
5. Coloque os GFs em bandejas (33 cm x 25 cm x 2 cm) e irradie-os por 15 minutos, colocando os GFs a uma distância de 55 cm da fonte UV dentro de uma estação de fluxo horizontal laminar habilitada para UV.
6. Durante o período de 15 minutos, a cada 5 minutos, mova os GFs para garantir a irradiação de toda a fruta.

3. Desinfecção de insetos²¹

1. Use insetos CBB recém-emergido (no mesmo dia) para configurar os bioensagratos.
2. Mergulhe os CBBs em 0,5% de solução de hipoclorito de sódio, agitando-os lentamente com uma escova por 10 minutos.
3. Filtre os CBBs através de um pano de musselina e lave-os três vezes com água destilada estéril.
4. Remova o excesso de água com toalhas de papel estéreis.

4. Avaliação de um produto com efeito protetor sobre as frutas (pré-infestação) (Figura 1)

1. Use um grupo de GFs por unidade experimental. Geralmente, um grupo de 30 GFs são usados por unidade experimental.
2. Coloque os GFs em caixas plásticas (unidade experimental).
3. Aplique o produto de teste nas diferentes concentrações para avaliação. Realize a aplicação com uma unidade de pulverizador portátil. Aqui foram testadas emulsão alcaloides de 5% e 6%.
4. Como controle, pulverize um grupo de GFs com água.
5. Utilize pelo menos três repetições (unidade experimental) por tratamento, pulverizando uma após a outra.
6. Em um capô estéril, solte dois adultos CBB por GFs (um total de 60 CBBs são introduzidos nas caixas plásticas). Depois de 30 min, cubra as caixas.
7. Deixe as caixas plásticas com os GFs infestados em uma sala ou incubadora em condições controladas (escuras, 25 ± 2 °C, e umidade relativa 71% ± 5%).
8. Após 1, 7, 15 e 21 dias, conte o número de frutas borer e insetos vivos e mortos fora das frutas em cada caixa.
9. Em 20 dias pós-infestação, disseca cada GF sob um estereótipo, ampliação 10x.
10. Conte o número de sementes saudáveis ou sementes danificadas pelos insetos em cada fruta.
11. Conte os diferentes estágios biológicos da CBB²² observados e conte o número de insetos mortos em cada semente para determinar a mortalidade de insetos por unidade experimental.

5. Avaliação do efeito de um produto após a infestação da CBB (pós-infestação) (Figura 3)

1. Use grupos de 200 frutas por tratamento.
2. No capô asteril, solte adultos CBB (proporção 2:1 de adultos CBB para GFs) para os GFs anteriormente desinfetados, permitindo que a infestação prossiga por 3h a 21 °C.
3. Examine os GFs. Após 3h, a maioria deve estar infestada, com o abdômen dos CBBs ainda exposto (posição A²⁰), como mostrado na Figura 2.
4. Selecione 46 GFs infestados (posição A) e coloque-os em racks de plástico de 96 poços (unidade experimental). Os frutos devem permanecer nesta posição para que o tratamento possa ser pulverizado diretamente na CBB perfurando a fruta.
5. Pulverizar pelo menos três vezes (três racks) por tratamento, um após o outro, cobrindo os racks após 30 min.
6. Deixe os racks com os GFs infestados em uma sala ou incubadora em condições controladas (escuro, 25 ± 2 °C, e umidade relativa 71% ± 5%).
7. Após 20 dias, disseca os GFs sob um estereómico a 10x de ampliação.
8. Conte o número de sementes saudáveis ou sementes danificadas pelos insetos em cada fruta.
9. Conte os diferentes estágios biológicos da CBB²² e o número de insetos mortos em cada semente para determinar a mortalidade de insetos por unidade experimental.

6. Avaliação de um produto com efeito dissuasivo na CBB

1. Siga os passos 4.1-4.6 delineados para avaliar um produto com efeito protetor sobre as frutas.
2. Depois de liberar os adultos da CBB nas caixas plásticas, conte o número de CBBs que voam para longe das caixas e o número que infesta os GFs. Em seguida, siga os passos 4.7-4.11.
3. Siga os passos 5.1-5.5 delineados para avaliação do produto após a infestação da CBB.
4. Após pulverizar cada tratamento nos insetos na posição A, conte o número de CBBs que saíram do GF e/ou voaram para longe do GF. Em seguida, siga os passos 5.6-5.9.

7. Análise estatística

NOTA: As variáveis de resposta são percentuais de mortalidade ao longo do tempo e o percentual de sementes de café saudáveis não infestadas.

1. Estime o desvio médio e padrão de cada variável de resposta para cada tratamento.
2. Realize a análise de variância para cada variável de resposta com um modelo para um design completamente randomizado.
   NOTA: O teste de comparação de 5% de Dunnett é realizado para comparar os tratamentos com o controle absoluto (controle de água).
3. Quando os tratamentos forem significativamente diferentes do controle absoluto, use um teste de diferença 5% menos significativa (LSD) para comparar os tratamentos.
4. Avaliar o poder do teste; se for superior a 85%, os pressupostos de normalidade e homogeneidade das variâncias são atendidos.

Figura 1: Procedimento para avaliação dos efeitos de pré-infestação de inseticidas na CBB. Etapas para avaliar os efeitos de pré-infestação de inseticidas no Hypothenemus hampei (CBB) utilizando frutas verdes (GFs). (A) Seleção de frutas. (B) Pulverização dos inseticidas nas frutas do café. (C) Infestação de frutas de café cbb a uma proporção de 2:1 CBB por GF. (D) Frutas infestadas. (E) Incubação das frutas em condições controladas. (F) Dissecção de frutas. (G) Contando a população da CBB dentro das sementes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Processar a infestação da CBB das frutas do café. As frutas infestadas contêm adultos CBB com abdômen parcialmente exposto (posição A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Procedimento para avaliação dos efeitos posinfestation dos inseticidas na CBB. Etapas para avaliar os efeitos pós-infestação de inseticidas no CBB utilizando GFs. (A) Seleção de frutas. (B) Infestação das frutas com CBB em uma proporção de 2:1 CBB por GF. (C) Seleção de frutas infestadas. (D) Pulverização do inseticida nas frutas. (E) Incubação das frutas. (F) Dissecção de frutas. (G) Contando a população da CBB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados mostraram que as fêmeas da CBB reconheceram os frutos e, dependendo das características da superfície da fruta e dos odores emitidos, as fêmeas da CBB começaram a penetrar ou dar os frutos dentro de 3h a 21 °C.

O efeito de um inseticida na CBB quando aplicado às frutas do café (procedimento de pré-infestação) após 24h e ao longo do tempo é mostrado na Figura 4. Os dois inseticidas (emulsão alcaloide a 5% e 6%) causaram alta mortalidade por insetos no dia 20 (Tabela 1) e apresentaram diferenças significativas em relação ao controle absoluto da água (P < 0,001), de acordo com o teste de LSD. Quanto aos percentuais de sementes saudáveis não infestadas (Tabela 1), também houve diferenças entre o controle e os grupos de inseticidas, de acordo com o teste de Dunnett em 5% (P < 0,001). No grupo controle, 37% das sementes não estavam infestadas, enquanto a aplicação de inseticidas protegia as sementes, com 94% das sementes permanecendo saudáveis quando se utilizava inseticida 2 e 89% com inseticida 1.

Figura 4: Efeitos de pré-infestação de inseticidas no controle versus dois grupos de inseticidas. Efeitos de pré-infestação dos inseticidas. Percentual de mortalidadepor H. hampei adulto avaliado nos dias 1, 7, 15 e 21 após infestação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Efeito do tratamento de pré-infestação na CBB. Por cento de mortalidade e sementes percentesas de saúde após 20 dias. * Para cada variável, as diferenças em relação ao controle (água) de acordo com o teste de Dunnett em 5%.

Os resultados da pré-infestação após 21 dias são mostrados na Tabela 1, e os resultados ao longo do tempo correspondem à Figura 4. Neste caso, as frutas do café foram cobertas com uma substância tóxica que causa a mortalidade de insetos. Os insetos ficam impregnados quando caminham sobre as frutas, provam as frutas com suas palpas, ou começam a mastigar a epiderme das frutas. Além disso, as substâncias aplicadas sobre a superfície da fruta podem alterar ou alterar o odor natural da fruta, de modo que os indivíduos da CBB podem parar o processo de infestação, voando para longe ou preferindo ser separados da fruta sem tocá-la ou infestá-la. Dependendo do tempo de ação do produto, a mortalidade por insetos ou evitar o comportamento de infestação pode persistir por 24h ou mais.

Por outro lado, se os produtos forem aplicados após os insetos começarem a dar o presente (pós-infestação), os produtos podem penetrar na cutícula de insetos, causando mortalidade por insetos (Tabela 2 e Figura 5). A maior mortalidade ocorreu com inseticida 2 (P < 0,01). Se a mortalidade ocorrer rapidamente, o inseto morrerá antes de entrar na semente, e nenhum ovo ou população de insetos será encontrado dentro das sementes.

Figura 5: Efeitos pós-infestação de inseticidas. Percentual de mortalidade por H. hampei adulto avaliado nos dias 1, 7, 15 e 21 após infestação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2: Efeitos do tratamento pós-infestação na CBB. Por cento de mortalidade e por cento de sementes saudáveis após 20 dias. * Para cada variável, as diferenças em relação ao controle (água) de acordo com o teste de Dunnett em 5%. Para cada variável, letras diferentes indicam diferenças de acordo com LSD 5%.

Os efeitos dos inseticidas se refletem como o percentual de sementes saudáveis não infestadas no dia 20 de avaliação (Tabela 2). Devido à alta mortalidade de insetos, o inseto não penetrou nas sementes de café e as danificou. Aplicação dos produtos protegidos entre 79%-90% das sementes de café, apresentando diferenças em relação ao controle, em que 57% das sementes foram encontradas saudáveis (P < 0,01). Também foram observadas diferenças significativas entre os dois inseticidas (P < 0,01).

Em alguns casos, os insetos morreram muito rapidamente, mesmo antes de causar danos à semente. No entanto, se a morte do inseto demorou mais, o inseto poderia alcançar a semente e depositar alguns ovos, e mais tarde, o adulto morrerá. Neste caso, foi encontrada uma população reduzida de insetos dentro das sementes de café em comparação com a população de insetos encontrada no grupo controle pulverizado com água (Tabela 3).

Tabela 3: Efeitos pós-infestação após o tratamento com fungo entomopatômico e uma substância repelente. População de insetos dentro das sementes. Os GFs foram dissecados em 15 dias. * Para cada variável, as diferenças em relação ao controle (água) de acordo com o teste de Dunnett em 5%. Para cada variável, letras diferentes indicam diferenças de acordo com LSD 5%.

A Figura 6 mostra o efeito de um produto com efeitos pós-infestação, um entomopatógeno e o de uma substância repelente, bem como sua ação combinada.

Figura 6: Efeitos pós-infestação de um fungo entomopatômico e uma substância repelente. Por cento de mortalidade de adulto h. hampei e dano de sementes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Essas metodologias permitem a rápida determinação de diferentes efeitos de produtos tóxicos na CBB.

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.