Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

A microscopia de reflexão total-interna -fluorescência (TIRF) é comumente empregada para a visualização de moléculas fluorescentes únicas. Comparado com a imagem de epifluorescência, o TIRF consegue uma supressão de fundo superior, permitindo a localização e o rastreamento de fluoroforos de alta resolução. Por essa razão, o TIRF é o método preferido para visualizar proteínas fluorescentes com microtúbulos e é frequentemente usado para imagens de microtúbulos ^1,2.

Para investigar a regulação da dinâmica dos microtúbulos pelos MAPs, muitas vezes é necessário a imagem de microtúbulos e MAPs simultaneamente. A maioria dos métodos existentes para este fim são caros ou sofrem de desvantagens técnicas. TIRF de duas cores simultânea, por exemplo, requer dois lasers de excitação e duas câmeras. Além do alto custo, a necessidade de câmeras separadas coloca problemas de sincronização de quadros e registro de imagem. Essa necessidade pode ser contornada se um cubo de filtro rotativo for usado para alternar fisicamente entre lasers de excitação em quadros consecutivos³. Em tal configuração, um único chip de câmera pode ser usado, e os quadros alternam entre imagens de microtúbulos e MAPs. Essa técnica, no entanto, é limitada pela velocidade da mudança do filtro, que normalmente restringe a taxa de quadros a menos de 0,5 quadros por segundo³ (fps). Tal taxa de quadros é insuficiente para resolver processos dinâmicos rápidos, como o encolhimento de um microtúbulo que ocorre a uma velocidade de até 500 nm/s, a caminhada de uma quinase a uma velocidade na ordem de 800 nm/s, ou a difusão de um MAP ocorrendo com coeficientes de difusão superiores a 0,3 μm²/s⁴. Isso é particularmente problemático ao rastrear as posições relativas de dois alvos móveis em cada canal, como a posição de um MAP em relação à posição de uma ponta de microtúbulo⁵ em movimento.

Além dessas restrições ópticas, a microscopia TIRF de duas cores requer que MAPs e microtúbulos sejam rotulados com diferentes fluoroforos cujos espectros de emissão são suficientemente separados. A rotulagem fluorescente de tubulina pode alterar a dinâmica do microtúbulo⁶, e o fotobleaching de fluoroforos limita a velocidade de imagem⁷. Por causa dessas questões, técnicas de imagem sem rótulos foram desenvolvidas para visualizar microtúbulos. Estes incluem microscopia de dispersão interferométrica (iSCAT)^8,9, microscopia de dispersão coerente rotativa (ROCS)¹⁰, microscopia de interferência de luz espacial (SLIM)¹¹ e microscopia de reflexo de interferência (IRM)^12,13. Essas técnicas permitem imagens rápidas sem rótulos de microtúbulos sem as desvantagens da imagem de fluorescência, mas não podem ser usadas para visualizar maps únicos.

Dessas técnicas sem rótulos, a IRM se destaca por seu baixo custo e suas modestas demandas de instrumentação. Recentemente apresentamos um protocolo para combinar IRM com um microscópio TIRF comercial, permitindo que microtúbulos e MAPs fluorescentes sejam imagens em quadros alternados ^3,13. Este artigo apresenta um protocolo para modificar esta configuração para capturar simultaneamente imagens TIRF e IRM em um único chip de câmera. Isso envolve a adição de um divisor de feixe barato no caminho de excitação para iluminar simultaneamente a amostra com um laser TIRF e uma fonte de luz LED IRM. Um divisor de imagens comercial modificado é usado para separar espectralmente os sinais TIRF e IRM e projetá-los em metades separadas do mesmo chip de câmera. Também empregamos um sistema microfluido que permite a rápida troca de reagentes durante a imagem. Este protocolo descreve como essa configuração pode ser usada para imagens dinâmicas de microtúbulos e MAPs. A capacidade do aparelho é demonstrada apresentando a primeira visualização de proteínas cinesina-1 andando sobre microtúbulos de encolhimento, que é capturado a uma taxa de quadros de 10 ^s-1.

1. Preparação de câmaras de fluxo

NOTA: As câmaras de fluxo microfluidas serão construídas adingerindo microcanais de polidimetilatilaxitano (PDMS) a um vidro de cobertura limpo e funcionalizado. Os microcanais serão lançados em um molde mestre.

1. Preparação de canais PDMS
   1. Prepare óculos de cobertura limpos e/ou funcionais com química superficial adequada ao ensaio específico que está sendo imagedo.
      NOTA: Para ensaios de motilidade de quinase, são utilizados óculos de cobertura silanizados limpos com piranha. Estes são preparados como descrito em Gell et. ^al.1 Alternativamente, um procedimento mais simples é sonicar óculos de cobertura em isopropanol seguido de metanol para ciclos de 3x 20 min.
   2. Para preparar um molde mestre, corte as tiras de fita estacionária unilateral para o tamanho do canal de fluxo desejado. Adere as tiras ao fundo de uma placa de Petri de 10 cm, organizando-as lado a lado com pelo menos 1 cm de espaçamento entre as tiras.
      NOTA: Se forem necessárias dimensões precisas do canal, o molde pode ser fabricado em wafers de silício usando fotolitografia¹⁴.
   3. Para preparar o polímero PDMS, combine o agente de cura e o elastômero base em uma proporção de massa de 1:10. Misture por 2 minutos.
      NOTA: Esta razão de mistura pode ser variada para ajustar a rigidez do polímero. Uma maior proporção de base para agente de cura resulta em um polímero mais macio.
   4. Desgas a mistura em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas desapareçam.
   5. Despeje a mistura sobre o molde mestre em uma camada de ~0,5 cm de espessura, tomando cuidado para evitar criar bolhas.
   6. Asse a mistura em forno pré-aquecido a 70 °C por 40 min.
      NOTA: Um tempo de cura mais longo pode ser necessário se o bloco PDMS for espesso (>1 cm). Continue aquecendo em incrementos de 5 minutos até que esteja totalmente curado.
   7. Corte as regiões estruturadas do polímero. Faça furos em cada extremidade do canal usando um perfurador PDMS.
      NOTA: Neste protocolo, o diâmetro do furo é ajustado para 0,75 mm e pode ser ajustado de acordo com as taxas de fluxo exigidas. Os canais PDMS podem ser armazenados em ambientes secos por longos períodos, mas devem ser limpos antes do uso.
   8. Limpe o lado estruturado do bloco PDMS. Use fita estacionária para remover partículas grandes. Enxágüe com isopropanol e depois metanol. Repita estas enxágües 3x, enxágue com água ultrauso e seque a superfície.
   9. Limpar o PDMS usando oxigênio ou plasma de ar.
      NOTA: Neste protocolo, é usado plasma de ar de 18 W.
   10. Coloque o PDMS limpo de plasma em um vidro de cobertura apropriadamente limpo e aqueça em uma placa quente a 80 °C por 15 minutos.
       NOTA: A resina Epóxi pode ser aplicada nas laterais do bloco PDMS para aderir melhor ao vidro de cobertura.
   11. Insira tubos de polietileno de baixa densidade (LDPE) de tamanho adequado nos orifícios. Conecte a tubulação de saída a uma seringa de 0,5 mL.
       NOTA: Neste protocolo, tubos com diâmetro interno de 0,023 em estão conectados ao PDMS através de um adaptador metálico de diâmetro externo de 0,025.
   12. Escorraça soluções nos microcanais imergindo o tubo de entrada na solução e desenhando o volume necessário com a seringa.

2. Configuração óptica

1. Modificação do microscópio (Figura 1)
   1. Modifique um microscópio TIRF para ativar a imagem IRM¹³. Substitua o divisor de feixe 50/50 (Reflectance (R)/Transmission (T)) usado na roda do filtro do microscópio por um divisor de feixe de 10/90 (R/T).
   2. Insira um divisor de imagens entre a câmera e o microscópio.
   3. No cubo de filtro do divisor de imagens, insira um divisor de feixe 10/90 (R/T). Coloque um filtro de passagem longa de 600 nm na frente do feixe refletido e um filtro apropriado de emissão de fluorescência na frente do feixe transmitido.
      NOTA: Os divisores de feixe com diferentes proporções de R/T podem ser usados para ajustar as frações da luz de emissão IRM e TIRF coletadas.
   4. Alinhe o divisor de imagens de acordo com as especificações do fabricante para separar espacialmente os sinais DE TIRF e IRM no chip da câmera.
      NOTA: A separação espacial dos sinais é necessária porque o sinal de TIRF de fluoroforos típicos é muito mais fraco que o sinal IRM de um microtúbulo e não seria detectável se os dois sinais fossem sobrepostos.

3. Microtúbulos dinâmicos de imagem e moléculas únicas de Quinasina

1. Funcionalização e passivação de superfície
   1. Flow BRB80 buffer (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, titulado para pH 7.8 com NaOH) na câmara de reação.
   2. Solução de antibiotina de fluxo diluída a 0,025 mg/mL no BRB80 e incubada à temperatura ambiente por 10 minutos.
   3. Lave o canal com BRB80.
   4. Fluxo na solução F-127 (1% Pluronic F-127 (w/v) dissolvido no BRB80 durante a noite) e incubar por pelo menos 20 min para a passivação da superfície.
      NOTA: Se os óculos de cobertura de fácil limpeza forem usados em vez de óculos de cobertura silanizados, passivate usando caixa de 2 mg/mL em BRB80 por >20 min à temperatura ambiente.
   5. Lave o canal com BRB80.
2. Preparação para imagens
   1. Se for necessário controlar a temperatura, use um aquecedor objetivo e ajuste-o à temperatura correta.
      NOTA: Neste protocolo, todos os experimentos são realizados a 28 °C.
   2. Coloque a amostra no estágio do microscópio e ligue a fonte de luz de epiilluminação (>600 nm) para imagens IRM.
      NOTA: Neste protocolo, uma fonte de luz LED branca é usada com um filtro de passagem longa de 600 nm.
   3. Concentre o microscópio na superfície da amostra. Procure o plano focal correto perto da interface de solução PDMS.
      NOTA: No IRM, o interior aquoso do canal deve parecer muito mais brilhante que o polímero PDMS.
   4. Escolha um campo de visão perto do centro do canal.
   5. Prepare uma solução de microesferas fluorescentes de 0,1 μm em BRB80 (densidade: 10⁹ contas/mL, correspondente a uma diluição de 200 vezes para as contas utilizadas neste protocolo).
   6. Flua em pelo menos um volume de canal da solução de microesferas.
   7. Monitore a reação via IRM. Aguarde que as microesferas gradualmente "aterrissem" na superfície. Quando a densidade desejada de microesferas for alcançada, lave o excesso com BRB80.
3. Cultivo biotiningilado guanylyl 5'-α,β-metilenediphosphonato (GMPCPP)-sementes de microtúbulos estabilizadas
   1. Em um tubo de centrífugas de 0,6 mL, prepare 50 μL de uma solução contendo 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl₂ e 2 μM de tubulina biotinilada (5-10% de stoichiometria de rotulagem) no BRB80.
      NOTA: A rotulagem correta pode ser alcançada combinando tubulina biotiningada de alta densidade com tubulina bovina sem rótulo na razão correta.
   2. Incubar a solução no gelo por 5 minutos e incubar a 37 °C por 12,5 min.
      NOTA: O comprimento das sementes pode ser controlado afinando o tempo de polimerização.
   3. Pare a polimerização adicionando 100 μL de temperatura ambiente BRB80.
   4. Gire a solução em uma ultracentrifugação à temperatura ambiente (126.000 x g, 5 min). Descarte o supernatante usando uma pipeta para remover tubulina não imersa.
      NOTA: Neste protocolo, é usado um ultracentrifuuge acionado pelo ar.
   5. Adicione 200 μL de temperatura ambiente BRB80 à pelota. Resuspenque a pelota pipetando suavemente, mas completamente. Use uma pipeta de 200 μL com uma ponta de corte para reduzir a tesoura dos microtúbulos.
4. Crescente difosfato dinâmico guanosina (PIB)-extensões tubulinas
   NOTA: As sementes serão imobilizadas na superfície antibiotina do canal de fluxo. As "extensões" dinâmicas de GTP/PIB serão cultivadas a partir das extremidades das sementes imobilizadas.
   1. Diluir as sementes 20x em BRB80. Flua as sementes diluídas na câmara de reação.
   2. Monitore a reação via IRM. Espere que as sementes gradualmente "aterrissem" na superfície e se liguem a ela. Quando a densidade desejada de sementes for alcançada, lave o excesso com BRB80.
   3. Prepare uma mistura de extensão de microtúbulo: 12 μM tubulin sem rótulo, 1 mM GTP, 5 mM dithiothreitol (DTT) no buffer BRB80.
   4. Flua em pelo menos um volume de canal da mistura de extensão. Certifique-se de que a temperatura de reação é de 28 °C.
   5. Aguarde que as extensões dos microtúbulos cresçam a partir das sementes ao longo do tempo.
      NOTA: O comprimento de estado estável é geralmente alcançado em menos de 20 minutos.
   6. Use os microtúbulos dinâmicos para imagens. Adicione e visualize maps fluorescentes nos microtúbulos, conforme descrito na etapa 3.5 para a cinesina-1.
      NOTA: Como os microtúbulos são ligados à superfície, eles são facilmente visíveis pela TIRF.
5. Ensaio de motilidade de cinesina
   NOTA: Esta etapa descreve um protocolo para visualizar a proteína fluorescente verde motile (GFP) rotulada de cinesina-1 em microtúbulos de encolhimento. Uma construção de kinesina-1 de rato truncada fundida ao eGFP (rKin430-eGFP) foi expressa e purificada, como descrito anteriormente^15,16.
   1. Prepare o tampão de motilidade: 1 mM ATP e 0,2 mg/mL de casein no BRB80.
   2. Diluir a kinesina-eGFP no tampão de motilidade para 10 nM.
   3. Prepare uma solução de catalase de oxigênio 2x para neutralizar fotobleaching oxidativo (glicose de 80 mM, 80 mg/mL de glicose oxidase, 32 mg/mL catalase, 0,2 mg/mL de caseína, 20 mM DTT) suplementada com ATP de 2 mM.
   4. Combine 10 partes de carniceiro de oxigênio, 9 partes de BRB80 e 1 parte de 10 nM cinesina-eGFP para uma concentração final de quinase de 0,5 nM.
      NOTA: O volume total deve ser pelo menos 1,5 vezes maior que o volume do canal.
   5. Defina as configurações de imagem no software do microscópio.
      NOTA: Neste protocolo, os vídeos são gravados a 10 fps com tempo de exposição de 100 ms. A intensidade do laser é de ~0,05 kW/cm².
   6. Comece a imagem e flua a solução de cinesina para a câmara.
   7. Após a medição ser concluída, grave um vídeo curto (~5 s) no qual o estágio é lentamente traduzido em um movimento circular ou lateral. Use a projeção mediana deste vídeo como uma imagem de fundo e subtraia-o das medições brutas.

4. Processamento e análise de imagens

NOTA: O processamento de imagens foi realizado utilizando-se o NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). Uma macro foi desenvolvida para automatizar a divisão e alinhamento dos canais TIRF e IRM. Esta macro requer que o plugin GaussFit_OnSpot seja instalado (disponível no repositório de plugins ImageJ).

1. A partir da gravação de fundo, crie uma projeção mediana no ImageJ clicando em Imagem | Pilhas | Projeto Z.
2. Subtraia a projeção de fundo mediana dos dados de imagem bruta clicando em Process | Calculadora de imagens.
   NOTA: Certifique-se de verificar a opção "resultado de 32 bits (flutuar).
3. Para registro de imagens, escolha uma coleção de microesferas perto do microtúbulo de interesse e use-as para alinhar as imagens TIRF e IRM.
4. Para cada conta desta coleção, use a ferramenta de seleção de vários pontos para marcar a localização aproximada no canal TIRF e, em seguida, a localização correspondente no canal IRM.
   NOTA: Por exemplo, se houver duas contas (1 e 2), a seleção de vários pontos teria quatro pontos na seguinte ordem: (1) bead 1 em TIRF, (2) bead 1 em IRM, (3) contas 2 em TIRF, (4) contas 2 em IRM.
5. Execute a macro ImageJ fornecida (ImageSplitterRegistration.ijm).
   NOTA: Isso automatiza as seguintes etapas: i) estimar a localização central de cada pérola por se encaixar em um gaussiano; ii) para cada pérola, computando o vetor de deslocamento que separa o centro no canal TIRF do centro no canal IRM; iii) uma média desse vetor de deslocamento em todas as contas; iv) dividir os canais TIRF e IRM em imagens separadas; v) traduzir a imagem TIRF pelo vetor de deslocamento médio computado em iii; vi) sobrepor as imagens TIRF e IRM em um arquivo multicanal .tiff.

A configuração óptica é esquematizada na Figura 1. Tanto a iluminação IRM quanto a luz de excitação TIRF são direcionadas para a abertura traseira do objetivo (100x, NA: 1.49) através de um divisor de feixes de 10/90 (R/T) (BS1). O sinal emitido passa pelo mesmo divisor de feixe (BS1) e é refletido no divisor de imagens através de um espelho (M1). Os componentes do divisor de imagens (incluídos com linhas tracejadas na Figura 1) separam os sinais IRM e TIRF através de um divisor de feixes 90/10 (R/T) (BS2) juntamente com filtros espectrais apropriados. Finalmente, as imagens divididas são projetadas no chip da câmera para visualização. O alinhamento do divisor de imagens é tal que os sinais TIRF e IRM são projetados em metades separadas do chip.

Em um microscópio bem alinhado, a imagem da câmera deve exibir uma imagem meio dividida, como apresentado na Figura 2. Os microtúbulos ligados à superfície devem ser facilmente visíveis no canalIRM 13, e a cinesina fluorescente deve ser visível no canal TIRF.

As microesferas usadas para alinhar e registrar os dois canais aparecem como pontos brilhantes nas imagens da TIRF e manchas escuras nas imagens do IRM. Embora as contas sejam visíveis nos dados brutos, a subtração em segundo plano melhora significativamente o contraste (Figura 2). A imagem de fundo usada para a subtração é a mediana temporal de um vídeo gravado com um estágio móvel. Conforme descrito no protocolo, o alinhamento da imagem foi realizado selecionando uma coleção de contas próximas à região de interesse e executando a macro fornecida (imageSplitterRegistration.ijm). A macro se encaixa nos pontos aos gaussianos e alinha as imagens minimizando a distância média entre os pontos centrais dos ajustes em cada canal. Esse processo está representado na Figura 2, que mostra um bom alinhamento das microesferas fluorescentes (verde no canal TIRF, preto no canal IRM).

Finalmente, as capacidades desta configuração simultânea de imagem são demonstradas observando moléculas únicas de cinesina caminhando em direção às extremidades de encolhimento dos microtúbulos. A Figura 3 mostra um kymograph de moléculas de cinesina rotuladas por eGFP (verde) andando em um microtúbulo encolhendo (cinza). Também é apresentado uma série de instantâneos da gravação a partir da qual o kymograph foi gerado.

Figura 1: Representação esquemática da configuração óptica para imagem simultânea de IRM e TIRF de motilidade de cinesina. A epiilluminação de uma fonte de luz LED passa pelo diafragma de abertura e atinge o divisor de feixes de 10/90 (R/T) (BS1). O divisor de feixe reflete parcialmente a luz de iluminação irm vermelha e a luz de excitação TIRF de 488 nm até o objetivo de iluminar a amostra. O sinal da amostra é coletado pelo mesmo objetivo e direcionado para o conjunto de divisão de imagens onde as imagens IRM e TIRF são separadas espacialmente pelo divisor de feixes 90/10 (R/T) (BS2). Os sinais são então filtrados espectralmente antes de atingir o chip da câmera. Abreviaturas: IRM = microscopia de reflexão de interferência; TIRF = total-reflexão interna-fluorescência; LED = diodo emissor de luz; ITIRF = Iluminação TIRF; IGFP = Fluorescência GFP; Iinc = Iluminação IRM; Iref = luz dispersa na interface vidro/água; Iscat = luz dispersa do microtúbulo; IIRM = sinal IRM (Interferência de Iref escat); R/T = refletido/transmitido; LP600: filtro de passagem longa (600 nm); DM = espelho dicrómico; BS1 e BS2 = divisores de feixe 1 e 2; M1, M2, M3, M4 = espelhos; BP535/50 = passe de banda (535/50 nm); GFP = proteína fluorescente verde; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-metilenediphosphonate; PIB = difosfato de guanosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Subtração de fundo e alinhamento de imagem. As imagens TIRF (metade esquerda) e IRM (metade direita) aparecem simultaneamente em duas metades do mesmo chip de câmera (imagem da câmera). A subtração de fundo temporal aumenta o contraste das contas (imagem subtraída em segundo plano), que aparecem escuras em IRM e brilhantes em imagens DE TIRF. As imagens IRM e TIRF são alinhadas por tradução (à direita) com base na localização de contas selecionadas (retângulos brancos). Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Kymograph e instantâneos do movimento de Kinesins durante o encolhimento do microtúbulo. O kymograph (à esquerda) mostra eGFP-kinesin-1 (verde) caminhando em direção à extremidade mais alta do microtúbulo (cinza escuro). Instantâneos da série temporal correspondente são mostrados (à direita). Flechas brancas mostram moléculas de kinesina-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo de registro de imagens: Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.