Ensaios In vitro padronizados para visualizar e quantificar interações entre neutrófilos humanos e biofilmes de Staphylococcus aureus

Summary

O presente protocolo descreve o estudo das interações neutrófilo-biofilme. Os biofilmes de Staphylococcus aureus são estabelecidos in vitro e incubados com neutrófilos humanos derivados do sangue periférico. A resposta de explosão oxidativa dos neutrófilos é quantificada e a localização dos neutrófilos dentro do biofilme é determinada por microscopia.

Abstract

Os neutrófilos são a primeira linha de defesa implantada pelo sistema imunológico durante a infecção microbiana. In vivo, os neutrófilos são recrutados para o local da infecção, onde usam processos como fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS, RNS, respectivamente), NETosis (armadilha extracelular de neutrófilos) e degranulação para matar micróbios e resolver a infecção. Interações entre neutrófilos e micróbios planctônicos têm sido extensivamente estudadas. Tem havido interesses emergentes no estudo de infecções causadas por biofilmes nos últimos anos. Os biofilmes exibem propriedades, incluindo tolerância à matança por neutrófilos, distintas de suas contrapartes cultivadas em plâncton. Com o estabelecimento bem-sucedido de modelos de biofilme in vitro e in vivo , as interações entre essas comunidades microbianas com diferentes células imunes podem agora ser investigadas. Aqui, técnicas que usam uma combinação de modelos tradicionais de biofilme e ensaios de atividade de neutrófilos bem estabelecidos são adaptadas especificamente para estudar interações de neutrófilos e biofilmes. A microscopia de fluorescência de campo amplo é usada para monitorar a localização de neutrófilos em biofilmes. Esses biofilmes são cultivados em condições estáticas, seguidos pela adição de neutrófilos derivados do sangue periférico humano. As amostras são coradas com corantes apropriados antes da visualização ao microscópio. Além disso, a produção de EROs, que é uma das muitas respostas de neutrófilos contra patógenos, é quantificada na presença de um biofilme. A adição de células imunes a esse sistema estabelecido expandirá a compreensão das interações hospedeiro-patógeno, garantindo o uso de condições padronizadas e otimizadas para medir esses processos com precisão.

Introduction

Um biofilme é uma comunidade de micróbios associados à superfície ou agregados não ligados envoltos em uma substância polimérica extracelular (EPS)^1,2. Essas comunidades protegem os microrganismos envolvidos de estressores ambientais, incluindo a tolerância a agentes antimicrobianos e ao sistema imunológico³. Várias espécies microbianas patogênicas formam biofilmes que têm sido associados a infecções crônicas⁴. O desenvolvimento de biofilmes é um processo intrincado que envolve a fixação a superfícies, a produção de EPS, a proliferação celular, a estruturação do biofilme e o descolamento celular⁵. Uma vez que as células se dispersam para formar um biofilme, elas permanecem planctônicas ou se translocam para um novo substrato e reiniciam o desenvolvimento do biofilme⁶.

Staphylococcus aureus, um patógeno oportunista, segue um esquema geral de desenvolvimento de biofilme, incluindo fixação, proliferação, maturação e dispersão⁷. O processo de fixação em biofilmes de S. aureus é ditado por interações hidrofóbicas, ácidos teicóicos e componentes da superfície microbiana que reconhecem moléculas de matriz adesiva (MSCRAMMs)^8,9. À medida que a proliferação de S. aureus começa, a EPS, que consiste principalmente em polissacarídeos, proteínas, DNA extracelular e ácidos teicóicos, é produzida⁵. À medida que os componentes da EPS são produzidos, várias exoenzimas e pequenas moléculas também são produzidas, contribuindo para a estrutura tridimensional do biofilme e auxiliando no descolamento⁵. S. aureus aproveita esse estilo de vida altamente coordenado para estabelecer várias infecções crônicas, incluindo infecções devido à permanência de dispositivos médicos¹⁰.

O S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é uma das principais causas de infecções relacionadas a dispositivos médicos de demora, como cateteres venosos e urinários centrais, próteses articulares, marcapassos, valvas cardíacas mecânicas e dispositivos intrauterinos¹¹. Durante essas infecções, os neutrófilos são as primeiras células imunes hospedeiras recrutadas para o local da infecção para combater patógenos por meio de múltiplas estratégias¹². Estes incluem fagocitose, degranulação, produção reativa de espécies de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS) ou liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) para eliminar patógenos¹³.

A geração de EROs na fagocitose de micróbios é uma das principais respostas antimicrobianas exibidas pelos neutrófilos¹⁴. A fagocitose é aumentada se os micróbios forem revestidos de opsoninas, particularmente imunoglobulinas e componentes do complemento encontrados no soro¹⁵. Os micróbios opsonizados são então reconhecidos pelos receptores da superfície celular nos neutrófilos e engolfados, formando um compartimento chamado fagossomo¹⁵. Os neutrófilos geram e liberam EROs no fagossomo através da NADPH-oxidase associada à membrana¹⁶. Esse complexo enzimático multicomponente gera ânions superóxidos pela transferência de elétrons para oxigênio molecular¹⁶. Além disso, os neutrófilos também geram RNS através da expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS)¹⁷. Esses radicais de alto superóxido e óxido nítrico dentro do fagossomo têm amplas atividades antimicrobianas. Podem interagir com centros metálicos em enzimas e danificar ácidos nucleicos, proteínas e membranas celulares do patógeno 18,19,20,21. Numerosos micróbios adotam um estilo de vida biofilme e empregam diferentes estratégias para evitar a morte por ROS^22,23. Assim, ensaios padronizados que acoplam biofilmes com neutrófilos para quantificar ROS são benéficos para resultados consistentes.

Embora os ensaios, como a quantificação da produção de ROS de neutrófilos, forneçam informações sobre as respostas dos neutrófilos aos biofilmes, a capacidade de visualizar as interações dos neutrófilos dentro de um biofilme também pode servir como uma ferramenta poderosa. O uso de corantes fluorescentes para microscopia geralmente requer otimização para obter imagens de alta qualidade que podem ser usadas para análise de imagens microscópicas. A flexibilidade para otimizar algumas condições é limitada, pois os neutrófilos podem sofrer morte celular pós-isolamento. Além disso, os biofilmes são tipicamente lavados para remover a população planctônica da configuração experimental antes da adição de neutrófilos. Durante a lavagem, a variabilidade entre os biofilmes replicados pode surgir devido à perda de biomassa parcial se os biofilmes forem fracamente aderidos à superfície.

Em linhas gerais, os métodos atuais no campo para analisar as interações entre neutrófilos e biofilmes incluem principalmente microscopia, citometria de fluxo e enumeração de unidades formadoras de colônias (UFC)^24,25,26,27. A microscopia envolve o uso de corantes que mancham diretamente os neutrófilos e biofilmes, ou visam várias respostas de neutrófilos contra micróbios, como formação de NET, degranulação e morte celular^25,28. Um subconjunto dessas respostas, como morte celular de neutrófilos e degranulação, também pode ser analisado por citometria de fluxo, mas requer que os neutrófilos sejam preferencialmente não associados a grandes agregados de micróbios em um biofilme^28,29. A citometria de fluxo também pode quantificar alguns parâmetros do biofilme, como a viabilidade celular²⁷. Esses processos, no entanto, requerem ruptura da biomassa do biofilme e não seriam úteis para visualizar outras interações importantes, como a distribuição espacial dos neutrófilos e seus componentes dentro de um biofilme^27,29,30.

O presente protocolo se concentra na adaptação de alguns dos métodos tradicionalmente utilizados para estudar as interações neutrófilo-biofilme em biofilmes que foram otimizados para fornecer variabilidade mínima durante o manuseio. Este protocolo, portanto, fornece métodos padronizados para cultivar e quantificar biofilmes, isolar neutrófilos humanos primários do sangue periférico, quantificar a produção de ROS e visualizar interações biofilme-neutrófilo via microscopia. Este protocolo pode ser adaptado a diferentes sistemas para entender as interações biofilme-neutrófilo, considerando a heterogeneidade entre os grupos de doadores.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores para coleta de sangue periférico para isolamento primário de neutrófilos humanos. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)³¹ foi utilizado como organismo modelo para a realização dos experimentos. Os experimentos foram realizados com equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados devido à exposição potencial a um patógeno transmitido pelo sangue.

1. Preparação de biofilme in vitro

1. Obter colônias isoladas de S. aureus de um estoque criopreservado³¹ usando uma técnica de placa de estrias^32,33 em uma placa de ágar rica em nutrientes^, como o ágar de soja tríptico (ver Tabela de Materiais).
2. Revestir poços individuais de uma placa de 96 poços com 100 μL de poli-L-lisina (PLL) a 0,001% (v/v) diluídos em H₂O estéril e incubar à temperatura ambiente por 30 min. Asseticamente, aspirar a solução PLL usando um purgador de aspiração assistida por vácuo. Deixe os poços secarem durante a noite à temperatura ambiente.
   NOTA: Todas as etapas de aspiração no protocolo são realizadas usando um purgador de aspiração assistida por vácuo, salvo indicação em contrário.
3. Preparar uma cultura noturna inoculando uma colônia de S. aureus em meio essencial alfa mínimo (MEMα) suplementado com glicose a 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm por 16-18 h.
4. Diluir a cultura noturna transferindo 50 μL a 5 mL de MEMα fresco suplementado com glicose a 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm, até a fase logarítmica média, geralmente entre densidade óptica 600 (OD_600nm) de 0,5-0,8. Use MEMα para normalizar a cultura logarítmica média para uma OD de_{600nm de} 0,1.
5. Transfira 150 μL de cultura normalizada para cada poço da placa de 96 poços tratada com LLC. Incubar estaticamente durante 18-20 h numa câmara humidificada a 37 °C.
   NOTA: Os biofilmes também podem ser cultivados em outros formatos, como slides de canal μ (consulte Tabela de materiais).
6. Aspirar o sobrenadante para remover as células planctônicas. Lave suavemente a biomassa restante com 150 μL de Solução Sal Balanceada de Hanks (HBSS) para remover as células desligadas. Adicione HBSS dropwise para evitar interromper o biofilme.
   NOTA: Ao aspirar o sobrenadante e o HBSS durante as lavagens, deixe apenas líquido suficiente (sobrenadante ou HBSS) nos poços que contêm biofilme, de modo que o biofilme ainda esteja imerso. Isso evita a ruptura da estrutura do biofilme quando o HBSS é adicionado gota a gota para lavar o biofilme.
7. Repita a etapa 1.6 pelo menos mais duas vezes para remover todas as células planctônicas. Neste ponto, os biofilmes estão prontos para experimentos imediatos a jusante.
   NOTA: Se os biofilmes não forem usados para experimentos com neutrófilos, o HBSS pode ser substituído por solução salina tamponada com fosfato (PBS). O HBSS é preferido ao PBS, pois o HBSS contém componentes, incluindo glicose, que fornecem condições ótimas para a ativação de neutrófilos³⁴.

2. Quantificação da biomassa de biofilme

1. Preparar um estoque de solução de Violeta Cristal (CV) a 0,1% (p/v) (ver Tabela de Materiais) dissolvendo em etanol a 20% (v/v) e 80% (v/v) H 2 O. Certifique-se de que o CV está completamente dissolvido em etanol antes de adicionar H₂O. Filtre-esterilize a solução.
2. Adicionar 150 μL de solução CV a 0,1% ao biofilme lavado e incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Use pelo menos três poços vazios como controles somente de mídia.
3. Aspirar a solução CV a 0,1% dos biofilmes e lavar os biofilmes corados com 200 μL de PBS 1x. Repita este processo para um total de três lavagens para remover qualquer excesso de CV dos poços.
4. Adicionar 150 μL de ácido acético glacial a 33% (v/v) diluído com H₂O. Incubar à temperatura ambiente num balancim a 50 rpm durante 30 min para permitir que o CV ligado à biomassa se dissolva completamente.
   CUIDADO: Execute esta etapa em um exaustor de fluxo laminar com EPI apropriado, pois o ácido acético glacial é um produto químico corrosivo.
5. Enquanto isso, configure o leitor de microplacas (consulte Tabela de Materiais) para ler os valores de coloração CV. Após o tratamento com ácido acético glacial, leia a placa no comprimento de onda de 595 nm.
   NOTA: O comprimento de onda usado para medir o OD do CV pode variar de 500-600 nm³⁵.

3. Isolamento de neutrófilos

NOTA: Os neutrófilos foram isolados seguindo um método previamente publicado com pequenas alterações³⁶. Este protocolo de isolamento combina primeiro a centrifugação do gradiente de densidade, seguida pela sedimentação de dextrano a 3%. Esta seção cobre apenas o protocolo geral de isolamento de neutrófilos, concentrando-se nas alterações feitas no protocolo publicado. Além disso, o protocolo descrito abaixo é um dos muitos métodos que podem isolar neutrófilos e podem ser substituídos conforme necessário. Outros métodos para isolar neutrófilos incluem o uso de meios de separação celular ou separação celular de anticorpos magnéticos³⁷.

1. Extrair sangue de um doador adulto via punção venosa, de acordo com o protocolo descrito no IRB institucional. Antes da colheita de sangue, certifique-se de que a seringa tem heparina sem conservantes suficiente, de modo a que a concentração final de heparina seja de 20 U/ml.
2. Diluir o sangue heparinizado com 3/4 do volume de NaCl a 0,9% livre de endotoxinas (ver Tabela de Materiais) em H₂O à temperatura ambiente.
3. Para cada 20 ml da amostra de sangue diluído, alíquota de 14 ml de um meio de gradiente de densidade comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) num tubo cónico fresco de 50 ml. Coloque cuidadosamente a amostra de sangue diluída sobre o meio de gradiente de densidade.
4. Centrifugar a amostra de sangue em camadas a 400 x g durante 40 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que a centrífuga tenha uma ruptura lenta para evitar perturbar a camada uma vez que a centrifugação esteja concluída.
   NOTA: A amostra de sangue terá cinco camadas contendo uma mistura de solução salina e plasma, uma camada de células mononucleares, meio de gradiente de densidade, neutrófilos e eritrócitos.
5. Usando uma pipeta sorológica, aspirar todas as camadas acima dos neutrófilos e do pellet eritrocitário, seguido de uma suave ressuspensão do pellet em NaCl frio a 0,9% livre de endotoxinas em H₂O. Para cada pellet gerado a partir de uma amostra de sangue de 20 mL, ressuscite o pellet de volta para 20 mL de volume total. Adicionar 1:1 volume de 3% de dextrano (ver Tabela de Materiais). Incube o tubo ereto por 18-20 min no gelo.
   NOTA: Certifique-se de que o dextrano a 3% é feito com NaCl 0,9% livre de endotoxinas em H₂O.
6. Remova 20 mL da camada superior que contém neutrófilos e alguns eritrócitos em um novo tubo cônico de 50 mL e centrifuga-o a 355 x g por 10 min a 4 °C. Despeje o sobrenadante deixando para trás uma pelota vermelha.
7. Ressussuscite suavemente o pellet em 10 mL de H₂O frio e estéril por 30 s para lisar os eritrócitos restantes. Adicione imediatamente 10 mL de solução salina a 0,9% livre de endotoxinas frias à mistura para restaurar a tonicidade. Centrifugar a solução a 233 x g durante 3 min a 4 °C.
8. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet contendo 95%-97% de neutrófilos em 1 mL de HBSS frio por 20 mL da amostra de sangue.
9. Transfira 10 μL dos neutrófilos ressuspensos em 90 μL de corante de exclusão azul de tripano a 0,4% e conte as células usando um hemocitômetro (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: As células não viáveis são coradas de azul, uma vez que o corante de exclusão azul de tripano é impermeável em células viáveis. Esse protocolo proporciona >99% de viabilidade celular^37,38.
10. Adicione HBSS adicional de tal forma que a concentração final de neutrófilos seja de 4 x 10⁶ células/mL.
    NOTA: Para casos com <99% de viabilidade celular, a concentração final de 4 x 10⁶ células/mL ainda pode ser alcançada; no entanto, o volume total de solução contendo 4 x 10⁶ células/mL obtido diminuirá. A concentração final de neutrófilos pode ser ajustada de acordo com as necessidades experimentais do usuário. Os neutrófilos foram ressuspensos na concentração final de 4 x 10⁶ células/mL para todos os experimentos descritos a seguir. Para explicar a variabilidade doador-doador, é altamente recomendável que todos os experimentos envolvidos com neutrófilos sejam realizados com pelo menos três doadores diferentes.

4. Medição de ROS produzidas por neutrófilos

1. Adicionar 100 μL de soro humano 20% normal (diluído em HBSS) gota a gota ao biofilme lavado (passo 1.6) e incubar a 37 °C em condições estáticas durante 30 minutos para opsonizar o biofilme.
2. Aspirar a solução sérica a 20% e lavar os biofilmes gota a gota com 150 μL de HBSS uma vez. Aspirar o HBSS, deixando para trás poços com biofilmes opsonizados.
   NOTA: Para interpretação do experimento, recomenda-se um mínimo de quatro grupos: (A) Neutrófilos + Biofilme, (B) Neutrófilos + PMA (controle positivo, ver Tabela de Materiais), (C) Somente neutrófilos e (D) Somente Biofilme.
3. Adicionar luminol (ver Tabela de Materiais) aos neutrófilos ressuspensos em HBSS a uma concentração de 4 x 10⁶ células/ml de modo a que a concentração final de luminol seja de 50 μM. Esta solução está pronta para uso para os grupos (A) e (C). Adicionar 4 x 10⁵ neutrófilos misturados com luminol aos poços com biofilmes opsonizados.
4. Num tubo separado, preparar uma solução de luminol 50 μM em HBSS sem neutrófilos e adicioná-la ao biofilme que contém o poço (grupo D).
5. Aliquot 350 μL de neutrófilos misturados com luminol e adicionar 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA) a uma concentração final de 500 ng/mL à mistura. Para o grupo (B), adicionar 4 x 10⁵ neutrófilos desta mistura em poços sem biofilme. Isso serve como um controle positivo.
   NOTA: A concentração de PMA indicada nesta etapa é relativamente alta para garantir uma resposta robusta à explosão, pois os neutrófilos estimulados pelo PMA são um controle positivo. O PMA pode ser usado em uma concentração mais baixa para ativar neutrófilos, dependendo do experimento.
6. Centrifugar a placa a 270 x g durante 30 s a 4 °C.
7. Certifique-se de que o leitor de placas está ajustado para 37 °C, juntamente com a configuração para luminescência e leitura cinética por 60 minutos com intervalos de 3 minutos. Coloque a placa no leitor de placas para medir a produção de ROS por neutrófilos por 60 min.
   NOTA: Para este ensaio, os biofilmes foram cultivados em placas brancas utilizadas para ensaios de luminescência. A PMA é um agonista conhecido para a resposta oxidativa à explosão³⁹. Ao realizar estudos envolvendo PMA, certifique-se de que o PMA é adicionado na etapa final, enquanto a solução contendo neutrófilos está fria, uma vez que o PMA inicia imediatamente a resposta de explosão.

5. Interações biofilme-neutrófilo por imagem

1. Configure um biofilme usando as etapas 1.2-1.6. Para facilitar a imagem do biofilme, empregar uma cepa fluorescente de S. aureus, como a USA300 expressando proteína fluorescente verde (GFP)^40,41, para aumentar a facilidade da microscopia.
   NOTA: Uma lâmina de 6 μ canais (ver Tabela de Materiais) foi usada em vez de uma placa de 96 poços para demonstrar o modelo de biofilme in vitro (etapa 1).
2. Incubar 4 x 10⁶ células/ml de neutrófilos com 100 μM de Corante CMAC Azul (7-amino-4-clorometilcumarina) (BCD, ver Tabela de Materiais) durante 30 min num balancim a 37 °C e 5% de CO₂. Certifique-se de que as amostras estão incubadas no escuro e limite a exposição à luz para as etapas restantes.
3. Para lavar o excesso de BCD, centrifugar neutrófilos a 270 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender os neutrófilos em HBSS fresco. Neste ponto, adicione homodímero etídio-1 (ver Tabela de Materiais) aos neutrófilos corados com BCD a uma concentração final de 4 μM para monitorar a morte de neutrófilos e bactérias.
4. Adicione 150 μL de neutrófilos ao biofilme de S. aureus que foi cultivado em lâminas de μ, de modo que a proporção de neutrófilos/bactérias seja de 1:30 (neutrófilo: bactérias). Incubar as lâminas de μ em câmara umidificada por 30 min. O número de células bacterianas é baseado nas contagens de células obtidas a partir do revestimento de um biofilme de 18 h.
5. Fotografe a interação neutrófilo-biofilme usando canais fluorescentes correspondentes aos comprimentos de onda de excitação e emissão dos corantes/proteínas fluorescentes.
   NOTA: Para o presente estudo, a BCD é de 353/466 nm, o homodímero etídio-1 é de 528/617 nm e a GFP é de 395/509 nm. Limitar a exposição da amostra ao laser ou à luz para evitar o fotobranqueamento das amostras.
6. Analise as imagens usando software de análise de imagens de microscopia ou programas como FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ e BAIT, entre muitos outros^42,43,44,45.
   NOTA: Ao trabalhar com manchas, é importante considerar a especificidade dos corantes em uso. Algumas manchas funcionam em células procarióticas e eucarióticas, enquanto outras funcionam apenas em uma. Se neutrófilos e biofilmes forem corados separadamente usando corantes que possam manchar ambos os tipos de células, certifique-se de lavar qualquer corante restante antes de combinar neutrófilos e biofilmes para evitar a coloração cruzada.

Results

Os meios utilizados para o cultivo de biofilmes bacterianos influenciam a sobrevivência dos neutrófilos. Diferentes meios foram testados para reduzir o efeito dos meios isolados sobre a viabilidade dos neutrófilos para o estudo das interações neutrófilo-biofilme (Figura 1). Meios de crescimento bacteriano, como o caldo de soja tríptico, minimizam a viabilidade dos neutrófilos, de modo que ~60% dos neutrófilos estão vivos após um período de incubação de 30 minutos a 37 °C com 5% de CO₂. Meios de cultura de células de mamíferos, como o MEMα, não afetam a viabilidade dos neutrófilos e apoiam o crescimento de biofilmes de S. aureus. De fato, o meio mínimo promove o crescimento robusto de biofilmes em outras bactérias^46,47.

Para avaliar o efeito do meio sobre o crescimento do biofilme e a variabilidade na quantificação da biomassa de biofilme após a lavagem da biomassa para eliminar células planctônicas, um biofilme de S. aureus de 18 h foi cultivado em uma placa de 96 poços, com poços tratados ou não com poli-L-lisina. Um meio rico em nutrientes (Caldo de Soja Tríptico (TSB)) e mínimo (MEMα) foi utilizado como está ou suplementado com glicose a 2%. A biomassa de biofilme corada com CV revelou que o biofilme de S. aureus cultivado em MEMα suplementado com glicose a 2% produziu o biofilme mais robusto entre todos os meios testados (Figura 2A). Além disso, os biofilmes cultivados em poços pré-tratados com PLL contendo MEMα + 2% de glicose apresentaram menor variabilidade do que os biofilmes em poços não tratados com PLL contendo MEMα + glicose a 2%. Esses biofilmes apresentaram menor variabilidade na quantificação via ensaio CV³⁵ e UFC/mL quando banhados após o manuseio preciso de biofilmes para quantificação de biomassa. Esses biofilmes contiveram, em média, 1 x 10⁸ UFC/mL, como demonstrado pelo revestimento dos biofilmes em 3 dias distintos (Figura 2B). Este número é útil para determinar o número de neutrófilos a serem adicionados aos biofilmes para ensaios de funcionalidade de neutrófilos.

Para medir a produção de ROS por neutrófilos em resposta a biofilmes, os biofilmes de S. aureus foram cultivados estaticamente por 18-20 h em uma placa de 96 poços. Biofilmes foram então opsonizados e neutrófilos foram adicionados. A produção de EROs foi então medida por 60 min (Figura 3A). A área sob a curva é calculada a partir da curva cinética para quantificar a produção total de ROS por neutrófilos. Neutrófilos tratados com um agonista, como o PMA, usado como controle, mostram um aumento na produção de EROs. Na ausência de biofilmes, os neutrófilos tratados com PMA apresentaram produção robusta de EROs. Na presença de biofilme de S. aureus , a produção global de EROs por neutrófilos tratados com PMA diminuiu. Na ausência de PMA, os neutrófilos dependem exclusivamente de sua interação com o biofilme, o que reduz ainda mais a quantidade de EROs produzidas (Figura 3B).

Para visualizar as interações neutrófilo-biofilme usando microscopia de fluorescência, foi utilizada uma cepa de S. aureus que expressa GFP, corante Blue CMAC e homodímero etídio-1, que cora o citoplasma de células vivas e o DNA de células mortas, respectivamente. O biofilme de S. aureus foi cultivado por 18 h em um slide de 6 μ canais. Neutrófilos marcados com corante CMAC azul foram adicionados juntamente com homodímero de etídio-1 aos biofilmes lavados e incubados por 30 min a 37 °C com 5% de CO₂ antes da imagem. A microscopia fluorescente de campo amplo revelou que muitos neutrófilos estavam localizados na superfície dos biofilmes de S. aureus, enquanto alguns estão dentro do biofilme (Figura 4A). A interação entre as células de S. aureus dentro dos neutrófilos também foi aparente (Figura 4C). A maioria das células de S. aureus que interagiam com neutrófilos (ciano) estava morta (magenta), enquanto algumas permaneciam vivas (amarelo), conforme determinado pela coloração de mortos-vivos (Figura 4C). Para comparação, os biofilmes de S. aureus que expressam GFP foram corados com homodímero etídio-1, o que revelou uma fração da população morta de S. aureus dentro do biofilme (Figura 4B). Neutrófilos não viáveis que foram positivos para homodímero de etídio-1 foram quantificados usando software de análise (ver Tabela de Materiais) após incubação com biofilmes de S. aureus. Aproximadamente 48% dos neutrófilos já estavam mortos dentro de 30 minutos da incubação com biofilme de S. aureus. Durante a otimização do protocolo de microscopia, avaliou-se também o efeito da lavagem do biofilme e dos neutrófilos após 30 min de incubação para remoção de neutrófilos não aderidos, revelando cerca de 33% de neutrófilos mortos ainda aderidos ao biofilme (Figura 4D).

Figura 1: O ensaio LIVE-DEAD compara a sobrevivência de neutrófilos entre os meios de crescimento bacterianos e mamíferos. Os neutrófilos foram isolados e incubados em HBSS, MEMα, TSB ou SDS a 0,1% por 30 min. A coloração LIVE-DEAD foi realizada usando Calcein AM (vivo) e homodímero etídio-1 (morto). A porcentagem de neutrófilos vivos foi determinada, onde os neutrófilos incubados com HBSS foram tratados como neutrófilos 100% vivos. Os resultados representam uma média de dois experimentos independentes realizados em triplicata, com neutrófilos obtidos de dois doadores diferentes. Os dados são apresentados como DP médio ± (*p < 0,05, ****p < 0,0001. ANOVA unidirecional). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação da biomassa de biofilme em diferentes condições e contagem de viabilidade bacteriana de biofilmes cultivados nas condições otimizadas. (A) S. aureus foi semeado em uma placa de 96 poços revestida ou não revestida com poli-L-lisina (PLL). Os biofilmes foram cultivados em TSB, MEMα ou qualquer um dos meios suplementados com glicose a 2% em condições estáticas por 18 h. A coloração violeta cristal (CV) foi realizada para corar a biomassa do biofilme. A coloração CV eluída foi diluída à 1:10 e lida em um leitor de microplacas. Os resultados representam uma média de três experimentos independentes realizados em triplicado. Os dados são apresentados como média ± DP. O DP para cada grupo é mostrado na parte inferior para demonstrar a variabilidade das diferentes condições de crescimento do biofilme. (B) As contagens bacterianas de UFC foram obtidas a partir de biofilmes cultivados em meio otimizado (MEMα + glicose a 2%). Os biofilmes estáticos de 18 h foram submetidos ao mesmo número de lavagens seguidas de uma sonicação de 10 min para soltar a biomassa do biofilme e passaram por uma agulha 22G para interromper os agregados antes do revestimento. Os resultados representam três repetições realizadas em triplicata. Os dados são apresentados como média ± DP (ns = não significativo. ANOVA unidirecional). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificação da produção de EROs por neutrófilos via ensaio de quimioluminescência. (A) Os neutrófilos (PMN) foram incubados com biofilmes de S. aureus (BF) lavados com HBSS, seja na presença (triângulo cinza fechado) ou ausência (triângulo invertido cinza aberto) de PMA para medir a produção de ROS por neutrófilos. O luminol foi utilizado para detectar EROs a cada 3 min por 60 min em um leitor de microplacas. Enquanto os neutrófilos tratados com PMA na ausência de um biofilme (círculo preto fechado) serviram como um controle positivo, apenas os grupos neutrófilos (círculo preto aberto) e biofilme apenas (triângulo cinza aberto) serviram como controles negativos. Os dados representam uma média de dois experimentos independentes realizados em triplicado com neutrófilos obtidos de dois doadores diferentes. Os dados são apresentados como média ± DP. (B) A área sob a curva de (A) foi calculada para quantificar as EROs totais geradas pelos neutrófilos. Os dados são representados como média ± DP. (***p < 0,0001. ANOVA unidirecional). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visualização da interação entre o biofilme de S. aureus e neutrófilos utilizando microscopia de fluorescência de campo amplo. Neutrófilos marcados com corante CMAC azul (ciano) foram suplementados com homodímero-1 de etídio (magenta; morto) antes da incubação com um biofilme de S. aureus de 18 h (amarelo). As interações biofilme-neutrófilo foram fotografadas usando microscopia fluorescente de campo amplo e as imagens processadas usando um software de análise de imagens. Foram realizados experimentos com três doadores diferentes. Imagens representativas são apresentadas como (A) visão 3D do biofilme de S. aureus com neutrófilos vivos (cianos) e mortos (magenta; alguns indicados com setas brancas), (B) visão 3D de um biofilme de S. aureus na ausência de neutrófilos com S. aureus vivo expressando GFP (amarelo) ou S. aureus morto corado com homodímero-1 (magenta), (C) uma visão ortogonal de S. aureus e interação com neutrófilos, conforme representado pelos planos xy, yz e xz, e (D) quantificação da viabilidade dos neutrófilos na presença de biofilme de S. aureus após 30 minutos imediatamente (não lavado) ou após três rodadas de lavagens com HBSS para remover neutrófilos não aderidos (lavados). A morte celular de neutrófilos é apresentada como média ± DP (teste t de Student). A barra de escala indica 50 μm em (A) e (B) e 10 μm em (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Tem havido inúmeros esforços para cultivar biofilmes robustos e reprodutíveis de S. aureus para experimentos a jusante in vitro^48,49,50. É delineado um protocolo padronizado que aproveita a natureza catiônica do PLL, bem como a suplementação do meio com glicose para o crescimento de biofilmes robustos de S. aureus in vitro. A adição de PLL permite uma melhor fixação da célula bacteriana carregada negativamente às superfícies revestidas de PLL carregadas positivamente. É importante notar que a LLC em uma concentração de 10 μg/mL tem atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e S. aureus quando incubada por 24 h⁵¹. A mesma concentração é usada para revestir superfícies; no entanto, o excesso de PLL é aspirado, tornando a concentração de PLL inferior a 10 μg/mL ao semear para o crescimento do biofilme.

É importante ressaltar que a LPA tem atuado apenas em meios de crescimento específicos, como o MEMα com glicose a 2%, onde foi observado que S. aureus produziu biofilmes robustos com variabilidade mínima (Figura 2A). A concentração de PLL a ser usada em conjunto com outros tipos de meios exigiria otimização adicional, como o uso de uma concentração aumentada de PLL para revestir os poços. Além disso, essas condições foram otimizadas para um biofilme de S. aureus monoespécie. Embora os biofilmes de feridas crônicas sejam frequentemente polimicrobianos, a padronização de ensaios para estudar o biofilme de monoespécies e suas interações com neutrófilos e outras células imunes é fundamental para entender sua contribuição para a patogênese⁵². Esses protocolos padronizados podem ser otimizados ainda mais para sustentar e estudar biofilmes polimicrobianos e suas interações com neutrófilos.

Observou-se também que meios de cultura bacteriana ricos, como o TSB, levaram à perda da viabilidade dos neutrófilos (Figura 1). Portanto, as condições de crescimento dos biofilmes de S. aureus em MEMα, utilizados para culturas de células de mamíferos, foram otimizadas. Para estudos envolvendo neutrófilos, este meio suporta a viabilidade dos neutrófilos e promove o crescimento de S. aureus. Embora tenha sido observado que a mídia afeta a viabilidade dos neutrófilos, também é importante considerar que os neutrófilos isolados do sangue humano periférico sofrem apoptose ex vivo com aproximadamente 70% de neutrófilos apoptóticos até 20 h⁵³. Isso requer manuseio adequado, como armazenar os neutrófilos no gelo ao se preparar para experimentos, usar reagentes livres de endotoxinas e prevenir a ativação de neutrófilos, evitando o vórtice de amostras com neutrófilos.

A avaliação da explosão oxidativa em neutrófilos é realizada rotineiramente para determinar o efeito de morte dos neutrófilos sobre o patógeno^14,54,55. Esses estudos são frequentemente realizados com bactérias planctônicas, onde os neutrófilos são adicionados, e a resposta de explosão oxidativa é quantificada usando quimioluminescência amplificada por luminol que detecta ânions superóxido produzidos por neutrófilos. O presente protocolo é modificado pela substituição de bactérias planctônicas por biofilme de S. aureus de 18 h cultivado estaticamente. Como tal, os neutrófilos podem ser adicionados diretamente ao biofilme para avaliar sua ativação. Por outro lado, bactérias em biofilmes produzem enzimas, como catalase e superóxido dismutase para desintoxicar ROS^23,56. Os biofilmes de Staphylococcus epidermidis produzem maior catalase do que sua contraparte planctônica sob estresse⁵⁷. A quimioluminescência total de neutrófilos estimulados por PMA em um biofilme de S. aureus é significativamente menor do que a dos neutrófilos estimulados por PMA, onde o biofilme está ausente (Figura 2). Isso pode ser devido à atividade dessas enzimas desintoxicantes. Além disso, os biofilmes de S. aureus produzem várias toxinas formadoras de poros chamadas leucocidinas que matam os neutrófilos⁵⁸. A resposta reduzida à explosão também é provavelmente devido à viabilidade reduzida de neutrófilos na presença de biofilme de S. aureus. Embora este estudo utilize luminol que detecta as EROs totais produzidas dentro e fora das células, outros reagentes, como o CM-H 2 DCFDA (5-(e-6)-_{clorometil-2'7}'-diacetato de diclorodihidrofluoresceína) ou o isoluminol, precisam ser considerados se o objetivo do trabalho é estudar a produção de ERO intracelular ou extracelular^14,53,54 especificamente.

A capacidade de visualizar interações neutrófilo-biofilme via microscopia pode ser informativa sobre o comportamento de neutrófilos e biofilmes na presença um do outro. Os espectros de excitação e emissão dos corantes e proteínas fluorescentes representam um instantâneo da interação entre um biofilme de S. aureus de 18 h e neutrófilos após uma incubação de 30 minutos. Para capturar efetivamente os sinais das células coradas, é importante limitar a exposição das amostras a fontes de luz ao configurar as amostras para microscopia. Durante a imagem, o fotobranqueamento rápido das amostras foi evitado, diminuindo a intensidade da fonte de luz ao ajustar todos os parâmetros, como a altura da pilha Z e o tempo de exposição para diferentes canais.

Essas práticas simples permitiram a microscopia adequada, onde foi observado que poucos neutrófilos estão localizados dentro do biofilme (Figura 4A). Isso pode ser devido aos espaços presentes no biofilme, pois o biofilme de 18 h de S. aureus cultivado em MEMα com glicose a 2% não cobre uniformemente a superfície (Figura 4B). No entanto, o uso de meios ricos por outros estudos mostrou um gramado uniforme de crescimento de biofilme de S. aureus e leucócitos penetrando através do biofilme^30,58. Além disso, observa-se também que houve morte celular de neutrófilos após 30 min de incubação com biofilmes de S. aureus devido a leucocidinas produzidas por biofilme de S. aureus que lisam neutrófilos⁵⁸ (Figura 4A,D). A adição de uma etapa de lavagem para remoção de neutrófilos não aderidos após incubá-los com biofilme por 30 min removeu ~15% dos neutrófilos mortos do sistema em comparação com o grupo não lavado, no qual a microscopia foi realizada imediatamente após 30 min de incubação (Figura 4D). Neutrófilos interagindo com S. aureus também foram observados (Figura 4C). Mais experimentos são necessários para avaliar se o S. aureus é engolido por neutrófilos ou ligado à superfície celular dos neutrófilos⁵⁴. A imagem de neutrófilos e biofilmes é o primeiro passo para avaliar várias funcionalidades de neutrófilos a jusante, como fagocitose e NETosis^54,59. O efeito dos neutrófilos sobre os biofilmes também pode ser avaliado quantificando a biomassa do biofilme, as mudanças estruturais do biofilme e a viabilidade do biofilme, entre muitas outras, utilizando ferramentas de análise de imagens listadas na etapa 5.6. Por último, existe uma variabilidade doador-doador nos neutrófilos; assim, recomenda-se que pelo menos três doadores diferentes sejam utilizados para estudos envolvendo neutrófilos.

No geral, ensaios in vitro padronizados foram combinados para avaliar as interações entre neutrófilos e biofilmes. Embora esses ensaios utilizem S. aureus, os protocolos descritos podem ser facilmente adaptados para estudar outros patógenos. Embora existam vários modelos in vivo para estudar as interações hospedeiro-patógeno, eles podem ser caros e trabalhosos, especialmente se as condições não forem otimizadas. Trabalhar com ensaios in vitro padronizados permite otimizar as condições experimentais e confirmar as observações antes de passar para um sistema in vivo. Finalmente, vários modelos de infecção animal têm sido usados para estudar as interações biofilme-neutrófilo in vivo. No entanto, é importante considerar as diferenças imunológicas entre humanos e modelos animais^60,61,62,63. Isso requer o uso de neutrófilos derivados de humanos para estudar essas complexas interações hospedeiro-patógeno.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Irrigação com cloreto de sódio a 0,9%, USP	Baxter	2F7124	Livre de endotoxinas; Usado para isolamento de neutrófilos
Unidade de filtro de fluxo rápido de 150 mL	Thermo Scientific	565-0020
Etanol de 200 provas	VWR	89125-188
Seringa de 3 mL	BD	309657	Usado para coleta de sangue
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL
	BD	309653	Usado para coleta de sangue
Ágar	Fisher Biorreagentes	BP1423-2
Cotonete com álcool	BD		Usado para coleta de sangue
Band-aids			Usado para coleta de sangue
BD Caldo de soja Bacto Tryptic	BD	DF0370-07-5	Combine com 1,5% de ágar para fazer contador de células de ágar de soja tríptica
	Bal Saupply	202C
CellTracker azul CMCH	Invitrogen	C2111	Blue CMAC Dye (BCD)
Placas de poliestireno de fundo plano de 96 poços	Costar	3370
Gaze de algodão	Fisherbrand	13-761-52	Usado para coleta de sangue
Cristal violeta	Acros Organic	40583-0250
Tubos de cultura	Fisherbrand	14-961-27	Vidro de borosilicato 13 x 100 mm
D-(+)- glicose	Sigma	G-8270
Dextran de Leuconostoc spp.	Sigma	31392-250G	Usado para isolamento de neutrófilos
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) 1x	Gibco	14190-144
Etídio homodímero-1	Invitrogen	L3224 B
Ficoll-Paque mais	Cytiva	17144003	Usado para isolamento de neutrófilos (meio gradiente de densidade)
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	sem Hemacitômetro vermelho de cálcio, magnésio e fenol
	Heparina Bright Line
Heparina	Novaplus	NDC 63323-540-57	1000 unidades USP/mL, Usado para coleta de sangue
IMARIS 9.8	Oxford Instruments		Microscopia software de análise de imagem
Luminol	Sigma	A8511-5G
Minimal mídia essencial (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
Agulha (23 G1)	BD	305145	Usado para coleta de sangue
Nikon Eclipse Ti2	Nikon
NIS-Elements	Nikon		Quantificação de neutrófilos mortos Soro
humano normal	Tecnologia de complemento	NHS
Placa de Petri (100 x 15 mm)	VWR	25384-342
solução de poli-L-lisina
Phorbol 12-miristato 13
	Dispositivos Moleculares Leitor		microplacas
Água estéril para irrigação, USP	Baxter	2F7114	Livre de endotoxinas; Usado para isolamento de neutrófilos
Conjunto de infusão com asas Surflo	Terumo	SC*19BLK	19 G x 3/4", usado para coleta de sangue
Mancha azul de tripano (0,4%)	Gibco	15250-061
Turnicado			Usado para coleta de sangue
Água destilada UltraPure	Invitrogen	10977015
Placas opacas brancas de 96 poços	Falcon	353296	Placa de fundo plano e tratada para cultura
de tecidosμ-Slide VI 0,4	Ibidi	80601	μ-canal