Um Protocolo de Limpeza Eficiente para o Estudo do Desenvolvimento de Sementes em Tomateiro (Solanum lycopersicum L.)

Summary

A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. Este protocolo é útil para a limpeza de sementes de tomate em diferentes estágios de desenvolvimento para observar a estrutura embrionária mais fina.

Abstract

O tomate (Solanum lycopersicum L.) é uma das principais culturas comerciais em todo o mundo. A semente de tomate é um modelo importante para o estudo da genética e biologia do desenvolvimento durante a reprodução das plantas. A visualização da estrutura embrionária mais fina dentro de uma semente de tomate é muitas vezes dificultada pela mucilagem do revestimento da semente, tegumento em camadas multicelulares e um endosperma de paredes espessas, que precisa ser resolvido por uma laboriosa seção de incorporação. Uma alternativa mais simples é empregar técnicas de limpeza de tecidos que tornam a semente quase transparente usando agentes químicos. Embora os procedimentos convencionais de limpeza permitam uma visão profunda de sementes menores com um revestimento de sementes mais fino, a limpeza de sementes de tomate continua a ser tecnicamente desafiadora, especialmente nos estágios finais de desenvolvimento.

Apresentamos aqui um protocolo de limpeza rápido e que economiza trabalho para observar o desenvolvimento de sementes de tomate de 3 a 23 dias após a floração, quando a morfologia embrionária está quase completa. Este método combina solução de limpeza à base de hidrato de cloral amplamente utilizada em Arabidopsis com outras modificações, incluindo a omissão de fixação de formalina-aceto-álcool (FAA), a adição de tratamento de hipoclorito de sódio de sementes, remoção da mucilagem de revestimento de sementes amolecida e lavagem e tratamento a vácuo. Este método pode ser aplicado para a limpeza eficiente de sementes de tomateiro em diferentes estágios de desenvolvimento e é útil no monitoramento completo do processo de desenvolvimento de sementes mutantes com boa resolução espacial. Este protocolo de limpeza também pode ser aplicado a imagens profundas de outras espécies comercialmente importantes nas Solanaceae.

Introduction

O tomate (S. lycopersicum L.) é uma das culturas vegetais mais importantes do mundo, com uma produção de 186,8 milhões de toneladas de frutos carnudos de 5,1 milhões de hectares em 2020¹. Pertence à grande família Solanaceae com cerca de 2.716 espécies², incluindo muitas culturas comercialmente importantes, como berinjela, pimenta, batata e tabaco. O tomateiro cultivado é uma espécie diploide (2n = 2x = 24) com um tamanho de genoma de aproximadamente 900 Mb³. Durante muito tempo, um grande esforço tem sido feito para a domesticação e reprodução do tomate, selecionando características dese....

Protocol

1. Preparação de soluções

1. Preparar o fixador de FAA adicionando 2,5 mL de formaldeído a 37%, 2,5 mL de ácido acético glacial e 45 mL de etanol a 70% em um tubo de centrífuga de 50 mL. Vórtice e armazená-lo a 4 °C. Prepare recentemente o fixador FAA imediatamente antes de usar.
   CUIDADO: 37% de formaldeído é corrosivo e potencialmente cancerígeno se exposto ou inalado. O fixador deve ser realizado em um exaustor enquanto estiver usando o equipamento de proteção individual apropriado.
2. Prepare a solução de limpeza adicionando 5 mL de glicerol a 100%, 40 g de hidrato de cloral e 10 mL de água destilada em um frasco de vidro de 100 m....

Results

Quando as sementes de tomate foram limpas usando um método convencional como em Arabidopsis, os densos nódulos endospermáticos bloquearam a visualização de embriões de tomate precoces em 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A,B). À medida que o volume total do embrião aumentava, um embrião globular era quase indistinguível a 9 DAF (Figura 3C). No entanto, à medida que o tamanho da semente continuou a aumentar, sua permeabilidade diminuiu, resultando .......

Discussion

Em comparação com o corte mecânico, a tecnologia de limpeza é mais vantajosa para imagens tridimensionais, pois mantém a integridade dos tecidos ou órgãos vegetais¹⁶. Os protocolos de limpeza convencionais são frequentemente limitados a pequenas amostras devido à penetração mais fácil de soluções químicas. A semente de tomate é uma amostra problemática para a limpeza de tecidos porque é cerca de 70 vezes maior do que uma semente de Arabidopsis em tamanho e tem mais barreiras de permeabili.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.000 µ Pipeta L	GILSON	FA10006M
1.000 µ Pontas de pipeta L	Corning	T-1000-B
tubo de centrífuga de 2 ml	Axygen	MCT-200-C
37% formaldeído	DAMAO	685-2013
5.000 µ Pipeta L	Eppendorf	3120000275
5.000 µ L pontas de pipeta	biosharp	BS-5000-TL
tubo de centrífuga de 50 ml	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Garrafa de vidro	Fisher	FB800-100
Hidrato de Cloral	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscópio	Zeiss	Axio Imager A1	Desinfetante de ampliação de 10x, 20x e 40x
	QIKELONGAN	17-9185
Agulha de dissecação	Bioroyee	17-9140
Solo nutriente de flores	FANGJIE
Fórceps	HAIOU	4-94
Ácido Acético Glacial	BOYUAN	676-2007
Agitador magnético Glycerol	Solarbio	G8190
	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Agitador orbital	QILINBEIER	QB-206
Substrato de semeadura	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Triagem:0-10 mm
Lâmina côncava simples	HUABODEYI
Slide	Leica	3800381
Estereomicroscópio	Leica	S8 APO	1x a 4x ampliação
Folha de estanho	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Bomba de vácuo	SHIDING	SHB-III
Medidor de vórtice	Silogex	MX-S