Um Protocolo de Limpeza Eficiente para o Estudo do Desenvolvimento de Sementes em Tomateiro (Solanum lycopersicum L.)

O tomate (S. lycopersicum L.) é uma das culturas vegetais mais importantes do mundo, com uma produção de 186,8 milhões de toneladas de frutos carnudos de 5,1 milhões de hectares em 2020¹. Pertence à grande família Solanaceae com cerca de 2.716 espécies², incluindo muitas culturas comercialmente importantes, como berinjela, pimenta, batata e tabaco. O tomateiro cultivado é uma espécie diploide (2n = 2x = 24) com um tamanho de genoma de aproximadamente 900 Mb³. Durante muito tempo, um grande esforço tem sido feito para a domesticação e reprodução do tomate, selecionando características desejáveis de Solanum spp selvagem. Existem mais de 5.000 acessos de tomate listados no Tomato Genetics Resource Center e mais de 80.000 germoplasma de tomates são armazenados em todo o mundo⁴. A planta de tomate é perene na estufa e se propaga por sementes. Uma semente de tomate madura consiste em três compartimentos principais: um embrião adulto, endosperma residual do tipo celular e um revestimento de sementes duras ^5,6 (Figura 1A). Após a dupla fertilização, o desenvolvimento de endospermas do tipo celular precede o desenvolvimento de zigotos. Em ~5-6 dias após a floração (DAF), o proembrião de duas células é observado pela primeira vez quando o endosperma consiste de seis a oito núcleos⁷. Em Solanum pimpinellifolium, o embrião se aproxima de seu tamanho final após 20 DAF, e as sementes são viáveis para germinação após 32 DAF⁸. À medida que o embrião se desenvolve, o endosperma é gradualmente absorvido e apenas uma pequena quantidade de endosperma permanece na semente. O endosperma residual consiste em endosperma micropilar ao redor da ponta da radícula e endosperma lateral no restante da semente ^9,10. O revestimento externo da semente é desenvolvido a partir da epiderme externa espessada e lignificada do tegumento e, com as camadas mortas de restos de tegumento, formam uma casca dura para proteger o embrião e o endosperma⁵.

Figura 1: Representação esquemática de uma semente madura em Solanum lycopersicum e Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia longitudinal de uma semente de tomateiro madura. (B) Anatomia longitudinal de uma semente madura de Arabidopsis. Uma semente de tomate madura é aproximadamente 70 vezes maior em tamanho do que uma semente de Arabidopsis. Barras de escala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A produção de sementes de tomate de alta qualidade depende da coordenação entre o embrião, o endosperma e os componentes maternos das sementes¹¹. Dissecar genes-chave e redes no desenvolvimento de sementes requer um registro fenotípico profundo e completo de sementes mutantes. Técnicas convencionais de embutimento-seccionamento, como a seção semifina e a seção de parafina, são amplamente aplicadas às sementes de tomateiro para observar as estruturas locais e mais finas do embrião^12,13,14,15. No entanto, a análise do desenvolvimento de sementes a partir de seções finas é geralmente trabalhosa e carece de resolução espacial do eixo z. Em comparação, a depuração tecidual é um método rápido e eficiente para identificar o estágio de desenvolvimento dos defeitos embrionários com maior probabilidade de ocorrer¹⁶. O método de clareamento reduz a opacidade do tecido interno homogeneizando o índice de refração com um ou mais agentes bioquímicos¹⁶. A limpeza de tecidos inteiros permite a observação de uma estrutura tecidual vegetal sem destruir sua integridade, e a combinação de tecnologia de clareamento e imagens tridimensionais tornou-se uma solução ideal para obter informações sobre a morfologia e o estado de desenvolvimento de um órgão vegetal^17,18. Ao longo dos anos, técnicas de limpeza de sementes têm sido utilizadas em várias espécies vegetais, incluindo Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare e Beta vulgaris^{19,20,21,22,23}. Dentre estas, a tecnologia de limpeza de óvulos de montagem completa tem sido uma abordagem eficiente para o estudo do desenvolvimento de sementes de Arabidopsis, devido ao seu pequeno tamanho, 4-5 camadas da célula do revestimento da semente e o endosperma do tipo nuclear^24,25. Com a atualização contínua de diferentes misturas de clareamento, como o surgimento da solução de Hoyer²⁶, as estruturas internas do óvulo de cevada foram fotografadas com alto grau de clareza, embora seu endosperma constitua a maior parte das sementes. A embriogênese da beterraba sacarina pode ser observada por limpeza combinada com tratamento a vácuo e amolecimento com ácido clorídrico¹⁹. No entanto, ao contrário das espécies mencionadas acima, observações embriológicas por protocolos de limpeza em sementes de tomate não foram relatadas. Isso evita uma investigação detalhada sobre o desenvolvimento embrionário e de sementes de tomates.

O hidrato de cloral é comumente utilizado como solução de clareamento que permite que os tecidos e células imersos sejam exibidos em diferentes planos ópticos, preserva substancialmente as células ou componentes teciduais^27,28,29. O protocolo de clareamento à base de hidrato de cloral tem sido utilizado com sucesso para a limpeza completa de sementes para observar o embrião e o endosperma de Arabidopsis^21,28. No entanto, esta solução de limpeza não é eficiente na limpeza de sementes de tomate, que são mais impermeáveis do que as sementes de Arabidopsis. As barreiras físicas incluem: (1) o tegumento do tomate tem quase 20 camadas celulares em 3 a 15 DAF 30,31, (2) o endosperma do tomate é do tipo celular, não do tipo nuclear 32, e (3) as sementes de tomate são cerca de 70 vezes maiores em tamanho^33,34 e (4) produzem grandes quantidades de mucilagem do revestimento da semente^, o que bloqueia a penetração de reagentes de limpeza e afeta a visualização das células embrionárias.

Portanto, este relato apresenta um método otimizado de clareamento à base de hidrato de cloral para limpeza integral de sementes de tomateiro em diferentes estágios, o que permite imagens profundas do processo de desenvolvimento embrionário (Figura 2).

1. Preparação de soluções

1. Preparar o fixador de FAA adicionando 2,5 mL de formaldeído a 37%, 2,5 mL de ácido acético glacial e 45 mL de etanol a 70% em um tubo de centrífuga de 50 mL. Vórtice e armazená-lo a 4 °C. Prepare recentemente o fixador FAA imediatamente antes de usar.
   CUIDADO: 37% de formaldeído é corrosivo e potencialmente cancerígeno se exposto ou inalado. O fixador deve ser realizado em um exaustor enquanto estiver usando o equipamento de proteção individual apropriado.
2. Prepare a solução de limpeza adicionando 5 mL de glicerol a 100%, 40 g de hidrato de cloral e 10 mL de água destilada em um frasco de vidro de 100 mL envolto com papel alumínio. Dissolva usando um agitador magnético durante a noite à temperatura ambiente. A solução preparada pode ser armazenada a 4 °C por até 6 meses.
   CUIDADO: O hidrato de cloral é cancerígeno e tem um cheiro pungente. Realize o experimento em um exaustor e use o equipamento de proteção individual apropriado. O hidrato de cloral é fácil de deliquesce no ar e não deve ser armazenado em grandes quantidades. A solução de limpeza pode se decompor quando exposta à luz e deve ser mantida longe da luz.
3. Prepare a solução desinfetante adicionando 10 mL de hipoclorito de sódio a 6%, 40 mL de água destilada e 50 μL Tween-20 em um tubo de centrífuga de 50 mL. Vórtice e armazená-lo à temperatura ambiente. Prepare recentemente a solução desinfetante imediatamente antes de utilizar.
   NOTA: O teor efetivo de cloro do hipoclorito de sódio que foi colocado por um longo tempo pode diminuir, e o teor de hipoclorito de sódio a 6% pode ser aumentado de acordo com a situação real.

2. Coleta de sementes

1. Semear sementes de tomate (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, ver Tabela de Materiais) em 8 cm × 8 cm × 8 cm bacias quadradas cheias com uma mistura 1:1 de solo e substrato de nutrientes florais (v/v) (ver Tabela de Materiais), e crescer numa sala de crescimento com períodos claros/escuros de 16/8 h a 24 ± 2 °C (dia) e 18 ± 2 °C (noite), 60%-70% de umidade relativa e uma intensidade de luz de 4.000 Lux. Aproximadamente 6 semanas depois, as plantas entraram no estágio de floração.
2. Marque a data de floração das flores independentes na antese (o ângulo de abertura das pétalas é de 90°) e registre o dia após a floração (DAF).
3. Colha os frutos de 3 a 23 plantas de tomate DAF e coloque-os imediatamente no gelo. Divida os frutos (sementes ou embriões) de 3 a 23 DAF em frutos precoces (3-10 DAF), médios (11-16 DAF) e tardios (17-23 DAF) (sementes ou embriões).
   NOTA: Não colete muitos frutos de cada vez e certifique-se de que as sementes em cada fruto sejam retiradas dentro de 1 h para tratamento adicional.
4. Para frutos precoces, quebre a fruta e coloque-a em uma lâmina e colete sementes frescas cuidadosamente com pinças de precisão sob o estereomicroscópio (veja Tabela de Materiais) com ampliação de 1x a 4x. Para frutos médios e tardios, quebre os frutos e colete diretamente sementes frescas usando pinça de precisão.

3. Limpeza de sementes à base de hidrato de cloral

NOTA: Protocolos convencionais³⁵ e otimizados foram comparados neste estudo quanto à sua eficiência de limpeza de sementes.

1. Limpeza usando um protocolo convencional
   1. Colocar imediatamente as sementes frescas (obtidas na etapa 2.4) num tubo de centrífuga de 2 ml contendo 1,5 ml de fixador FAA e incubar num agitador orbital (5 rpm, ver Tabela de Materiais) durante 4 h à temperatura ambiente.
   2. Desidratar essas sementes em uma série de etanol de 70%, 95% e 100% de etanol (v/v) por 1 h cada em um agitador orbital (5 rpm).
   3. Coloque as sementes em 3-5 gotas de solução de limpeza (~ 100 μL) na lâmina e cubra suavemente a amostra com uma folha de cobertura. Substitua o slide por um único slide côncavo (consulte Tabela de materiais) para sementes médias e tardias.
   4. Mantenha essas lâminas ou lâminas côncavas únicas à temperatura ambiente por 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 dia (9 DAF), 3 dias (12 DAF) ou 7 dias (14 a 22 DAF), dependendo dos estágios de desenvolvimento do material de semente (quanto mais jovens os materiais, mais rápida a velocidade de limpeza).
   5. Observe as amostras com um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) equipado com uma câmera digital (consulte Tabela de Materiais) na ampliação de 10x, 20x e 40x. Ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture imagens.
2. Limpando usando o protocolo otimizado
   1. Colocar as sementes frescas (obtidas no passo 2.4) directamente num tubo de centrifugação de 2 ml contendo 1,5 ml de solução desinfetante (passo 1.3).
      NOTA: O número de sementes coletadas no tubo de centrífuga de 2 mL varia de acordo com o estágio de desenvolvimento das sementes. Os detalhes estão listados na Tabela 1.
   2. Incubar as amostras num agitador orbital (30 rpm) à temperatura ambiente durante 3 a 50 minutos até que o contorno do revestimento mais interno das sementes seja claramente visível. Rejeitar a solução desinfetante.
      NOTA: O tempo de incubação necessário depende do estágio de desenvolvimento das sementes (quanto mais tarde as sementes, maior será o tempo de incubação). Os detalhes estão listados na Tabela 1.
   3. Para sementes médias e tardias, transfira as sementes para uma lâmina e remova a mucilagem da semente com fórceps e uma agulha dissecante sob um estereomicroscópio com ampliação de 1x a 4x. Transfira as sementes de volta para o tubo de centrífuga original usando pinças.
      NOTA: Esta etapa não é necessária para sementes precoces.
   4. Lave as sementes 5x com 1,5 mL de água deionizada, 10 s de cada vez. Descarte a água deionizada.
   5. Adicionar uma solução de limpeza de 2 × volume das sementes, seguida de tratamento a vácuo durante 0 a 50 min (Quadro 1) com uma bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais). O tratamento a vácuo intermitente é realizado com cada tratamento a vácuo por 10 minutos espaçados em intervalos de 10 minutos.
   6. Substitua por uma solução de limpeza fresca de 2 × o volume das sementes. Manter o tubo de centrífuga de 2 mL contendo as sementes em temperatura ambiente e protegido da luz por 30 min a 7 dias para facilitar a limpeza (Tabela 1). Durante a incubação, para embriões tardios, substitua a solução de limpeza diariamente por solução fresca e submeta as sementes ao tratamento a vácuo por 10 min.
   7. Prepare as sementes limpas em lâminas ou lâminas côncavas simples e observe com o microscópio DIC equipado com uma câmera digital de ampliação de 10x, 20x e 40x. Ajuste e otimize o brilho da luz transmitida, o controle deslizante DIC e a abertura do condensador em tempo real para cada amostra e capture imagens.

Quando as sementes de tomate foram limpas usando um método convencional como em Arabidopsis, os densos nódulos endospermáticos bloquearam a visualização de embriões de tomate precoces em 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A,B). À medida que o volume total do embrião aumentava, um embrião globular era quase indistinguível a 9 DAF (Figura 3C). No entanto, à medida que o tamanho da semente continuou a aumentar, sua permeabilidade diminuiu, resultando em um embrião cardíaco difuso a 12 DAF (Figura 3D). A partir de 13 DAF, a mucilagem e o revestimento das sementes tornaram-se gradualmente mais densos, impedindo a penetração dos agentes de compensação. O contorno do embrião dentro de 14-19 sementes DAF foi extremamente borrado mesmo quando o tempo de tratamento foi estendido para 7 dias (Figura 3E-G). Em 22 sementes DAF, a estrutura interna da semente era completamente invisível (Figura 3H).

Portanto, o procedimento convencional de clareamento à base de hidrato de cloral foi otimizado para permitir a limpeza eficiente de sementes de tomate. Os detalhes de todas as etapas estão listados na Tabela 1. Em primeiro lugar, as etapas de fixação e desidratação do etanol da FAA, que são frequentemente exigidas nos procedimentos convencionais de limpeza, foram omitidas do protocolo. Embora a fixação da FAA seja geralmente usada para preservar a estrutura morfológica e os componentes celulares da decomposição, verificou-se (neste estudo) que a estrutura interna das sementes de tomate não foi facilmente deformada e foi bem preservada, apesar da ausência de fixação da FAA e desidratação do etanol.

Em segundo lugar, a mucilagem do revestimento da semente produzida pelas células epidérmicas do revestimento da semente é muito proeminente a partir do 13º DAF (Figura 4). A mucilagem de sementes rica em polissacarídeos apresentou alta viscosidade e permeabilidade significativamente baixa35,36. Ensaios iniciais para removê-lo sem destruir o revestimento da semente usando pinça fina e agulhas sob um microscópio de dissecação infelizmente falharam. Isso ocorre porque o revestimento da semente é frágil e conectado firmemente à mucilagem. Além disso, a existência de pigmento no revestimento da semente leva ainda ao declínio na qualidade da imagem de campo brilhante37. Para superar esse problema, as sementes foram tratadas com solução desinfetante de hipoclorito de sódio a 1,2% e Tween a 0,1% 20. O efeito de branqueamento do hipoclorito de sódio permite uma identificação clara do revestimento interno da semente e cria um ambiente relativamente estéril que permitiu que as amostras fossem armazenadas por um longo tempo. O uso do detergente Tween 20 poderia diminuir a tensão superficial e aumentar a permeabilidade das sementes. Mais importante ainda, após essa etapa, a maior parte da mucilagem aderente pode ser destacada da semente sem danificar o revestimento da semente (Figura 4). A partir de então, as sementes tratadas foram agrupadas em um tubo de centrífuga de 2 mL e incubadas à temperatura ambiente em um agitador orbital (30 rpm).

Em terceiro lugar, o tratamento a vácuo foi usado para acelerar a penetração da solução de limpeza para os embriões nos estágios médio e tardio. Finalmente, como as sementes de tomate são especialmente maiores após 12 DAF, as lâminas convencionais foram substituídas por lâminas côncavas únicas quando da imagem DIC.

Após o tratamento de acordo com o protocolo de clareamento otimizado, as sementes de tomateiro apresentaram transparência satisfatória em todos os estágios de desenvolvimento testados (Figura 5A-L). Em contraste com os contornos de células difusas obtidos por meio de protocolos convencionais, camadas celulares distintas do revestimento da semente a 3 DAF foram visíveis (Figura 5A). Os endospermas foram mais distinguíveis aos 5 DAF (Figura 5B). O embrião em forma de bastão apareceu a 7 DAF e, em seguida, o embrião atingiu o estágio globular em 9 DAF e o estágio cardíaco a 11 DAF (Figura 5C-E). Durante esses estágios de desenvolvimento, os contornos das células dentro do embrião eram mais claramente visíveis. Em comparação com o método convencional, o protocolo otimizado produziu imagens de qualidade significativamente melhor do estágio cardíaco ao estágio embrionário maduro. Quando o desenvolvimento embrionário atingiu o estágio inicial de torpedo aos 13 DAF, o estágio de torpedo médio a 14 DAF, o estágio de torpedo tardio em 15 DAF, o estágio de cótilodones iniciais em 16 DAF, o estágio de cotilédones dobrados em 19 DAF e 21 DAF e o embrião maduro em 23 DAF, o grau de ondulação dos cotilédones e meristema apical da parte aérea foi muito facilmente capturado (Figura 5F-L ). No entanto, além de 23 DAF, não foi possível visualizar os detalhes no embrião, mesmo quando o tratamento de limpeza foi prolongado para mais de 1 semana.

Figura 2: Fluxograma do protocolo convencional e protocolo otimizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens de contraste de interferência diferencial de óvulos de S. lycopersicum tratados pelo método convencional de clareamento. (A) Um óvulo com saco embrionário difuso a 3 DAF. (B) Saco embrionário com células endospermianas visíveis (pontas de seta) a 6 DAF. (C) Embrião globular quase indistinguível a 9 DAF. Um embrião difuso em (D) 12, (E) 14, (F) 16 e (G) 19 DAF. (H) A estrutura interna da semente é completamente invisível a 22 DAF. Barras de escala = 25 μm; em = embrião; es = saco embrionário. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Desinfecção de sementes de S. lycopersicum em diferentes estágios de desenvolvimento. As imagens de topo (A1-F1) são as sementes listradas dos frutos em desenvolvimento em (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 e (F1) 21 DAF, enquanto as imagens de fundo (A2-F2) são sementes tratadas com solução desinfetante. Em A2-F2, o contorno interno do revestimento da semente pode ser identificado claramente. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens de contraste de interferência diferencial de embriões de S. lycopersicum eliminadas usando o protocolo otimizado. (A-L) imagens de microscopia DIC do óvulo de tomateiro com saco embrionário visível em (A) 3 DAF e (B) 5 DAF, (C) um embrião em forma de bastão a 7 DAF, (D) um embrião globular a 9 DAF, (E) um embrião cardíaco a 11DAF, (F) um embrião de torpedo precoce a 13 DAF, (G) um embrião de torpedo médio 14 DAF, (H) um embrião de torpedo tardio a 15 DAF, (I) um embrião de cótilo precoce a 16 DAF, um embrião de cotilédones dobrados a (J) 19 DAF e (K) 21 DAF e (L) um embrião maduro a 23 DAF. Barras de escala = 50 μm; em = embrião; sc = revestimento de sementes; pt = endosperma; es = saco embrionário; hy = hipocótilo; co = cotilédone; r = radícula; sa = parte aérea apical. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Otimização do protocolo para melhorar a eficácia da depuração em sementes de tomateiro. 1 = Operações em lote, observação de limpeza de um grande número de sementes de uma só vez; as sementes foram colocadas em tubo centrífugo de 2 mL. 2 = Desinfecção utilizando 6% de NaClO:dH2O:Tween-20, nas proporções de 200:800:1 (v/v); todas as etapas foram realizadas em um agitador orbital com agitação de 30 rpm. 3 = Todas as etapas foram realizadas em microscópio de dissecação com pinça e agulhas de dissecação, salvo especificação em contrário. 4 = As sementes foram lavadas com água destilada após cada etapa. 5 = Limpeza com 100% de glicerol:hidrato de cloral:dH 2 O, nas proporções de 1:8:2(v/p/v). 6 = Cada tratamento a vácuo durou 10 min e foi espaçado em intervalos de 10 min. 7 = Substitua por uma solução fresca de limpeza e guarde as sementes longe da luz à temperatura ambiente; para sementes de 17 DAF a 23 DAF, substituir a solução de limpeza por solução fresca e aspirar por 10 minutos todos os dias durante todo o período de incubação.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.