Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Monócitos e macrófagos são fagócitos mononucleares que podem ser derivados de progenitores na medula óssea. Estudos recentes relataram que os macrófagos também se originam de progenitores eritromielóides derivados do saco vitelino¹. Independentemente de sua derivação, esses leucócitos têm importantes funções efetoras na homeostase e inflamação ^2,3. Os monócitos são células do sangue periférico que podem se diferenciar ainda mais em macrófagos no tecido ^2,4, enquanto os macrófagos são células heterogêneas que exibem fenótipos e funções reguladas pela exposição local de fatores de crescimento e citocinas⁵. Como os macrófagos apresentam essa diversidade funcional, eles têm sido estudados em muitos modelos de doenças. Assim, o cultivo in vitro de macrófagos tornou-se uma importante ferramenta para a compreensão de sua fisiologia e seu papel em diferentes doenças. A medula óssea é uma importante fonte de células progenitoras, incluindo progenitores de macrófagos, que podem ser isoladas e multiplicadas, aumentando exponencialmente o número de macrófagos obtidos. Além disso, os macrófagos derivados da medula óssea são especialmente importantes para evitar os efeitos gerados pelo microambiente tecidual, uma vez que os macrófagos mudam seu fenótipo em resposta a diferentes estímulos nos tecidos ^6,7. Os progenitores da medula óssea se transformam em macrófagos após a exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF)⁸. Os macrófagos derivados da medula óssea não podem ser distinguidos dos macrófagos derivados de monócitos por marcadores bioquímicos no tecido. Essas células representam uma população altamente homogênea de células primárias, que em muitos outros aspectos são comparáveis aos macrófagos peritoneais ^6,9.

Devido ao seu conjunto heterogêneo de funções celulares, os macrófagos há muito são exaustivamente estudados pelos pesquisadores. Essas células podem ser utilizadas em diferentes modelos experimentais, incluindo doenças infecciosas e inflamatórias, pois estão presentes nesses processos^10,11. Eles também podem ser úteis para investigar a polarização de macrófagos em resposta a vários estímulos microambientais^12,13. Assim, um protocolo simples e confiável é fornecido aqui com o objetivo de obter um grande número de macrófagos primários da medula óssea de camundongos.

Este protocolo foi realizado de acordo com o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (Concea) e com a aprovação do Comitê de Ética e Uso de Animais (CEUA). Camundongos C57BL/6 foram adquiridos da Biotério Central da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Equipamentos de proteção individual (EPI), como jalecos, luvas e proteção para os olhos, devem ser usados em todas as etapas descritas neste protocolo.

1. Preparação do sobrenadante da linhagem L-929 de fibroblastos como fonte de M-CSF

1. Descongele as células da linhagem de fibroblastos L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) e inicie o processo de cultura imediatamente para preservar a viabilidade.
2. Em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar, usando uma pipeta de 1.000 μL, transfira as células da linhagem de fibroblastos L-929 do frasco para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
3. Use uma pipeta sorológica para adicionar 50 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), livre de cálcio e magnésio.
4. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet em 20 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mL de penicilina/estreptomicina (P/S) (DMEM/F12-10) usando uma pipeta sorológica.
6. Transferir as células ressuspensas para um balão de cultura de células T75.
7. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ até a confluência completa.
   NOTA: Ao manipular o frasco, tenha cuidado para evitar molhar a tampa com solução, pois isso pode ser uma fonte de contaminação. Para obter uma quantidade conveniente de sobrenadante, é necessário replicar as células depois que elas cobrem toda a superfície do frasco de cultura de células. As células L-929 são inibidas pelo contato. Solução quente de tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), DMEM/F12-10 e PBS estéril a 37 °C para iniciar a expansão da cultura celular, conforme descrito nas etapas a seguir.
8. Uma vez atingida a confluência total, rejeitar o sobrenadante do balão de cultura de células, dentro da cabina de biossegurança do fluxo laminar.
9. Lavar o balão de cultura de células com 20 ml de PBS estéril com uma pipeta serológica e rejeitar a solução.
10. Adicione 10 mL de tripsina / EDTA (solução a 0,05%) ao frasco de cultura de células contendo as células aderidas.
11. Transfira o frasco de cultura celular do fluxo laminar para uma incubadora de CO₂ a 37 ° C e 5% e incube por 3 min.
12. Agitar o balão de cultura de células para dissociar as células da superfície do balão de cultura e utilizar um microscópio para garantir que todas as células foram dissociadas.
13. Inative a tripsina / EDTA (solução a 0,05%) com 10 mL de meio DMEM / F12-10.
14. Transferir a solução utilizando uma pipeta serológica para um tubo de centrifugação estéril de 50 ml.
15. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
16. Ressuspenda o pellet em 10 mL de meio DMEM/F12-10.
17. Adicionar 1 ml da suspensão celular a um balão de cultura de células T175 (cultura 1:10).
18. Repetir o procedimento para obter dez balões de cultura de células T175.
19. Adicionar 50 ml de DMEM/F12-10 a cada balão de cultura de células.
20. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ até a confluência completa.
    NOTA: Essas etapas garantem 500 mL de sobrenadante de célula L-929. No dia 5, após as células terem coberto a superfície do frasco de cultura de células T175, o sobrenadante será enriquecido para M-CSF e deverá ser coletado¹⁴.
21. Remova o frasco de cultura de células da incubadora no dia 5 após a inibição de contato.
22. Transfira o meio para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
23. Centrifugar a 3.200 x g, a 4 °C durante 10 min.
24. Recolha o sobrenadante enriquecido com M-CSF e transfira a solução para um tubo de centrifugação estéril de 50 ml. Conservar no congelador a -20 °C.
    NOTA: A centrifugação é extremamente importante para remover células e detritos dos sobrenadantes.
25. O sobrenadante L-929 é uma fonte conveniente e barata de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e normalmente contém 5 a 10 ng/mL de M-CSF⁸. Esses sobrenadantes também contêm vestígios de outras citocinas e fatores de crescimento, mas não exercem uma influência profunda na fisiologia dos macrófagos¹⁵. No entanto, o M-CSF purificado pode ser adquirido e usado como alternativa aos sobrenadantes L-929 em concentrações de 1 a 2 ng/mL⁸.

2. Remoção do fêmur e tíbia

1. Proceder à eutanásia de camundongo macho C57BL-6 de 8 semanas de idade, por luxação cervical após asfixia por dióxido de carbono, de acordo com a resolução normativa número 18 do Conselho Nacional de Experimentação Animal (Concea) e com aprovação do Comitê de Ética e Uso de Animais (CEUA).
2. Mergulhe o mouse com solução de etanol a 70% e use uma tesoura estéril para fazer uma incisão de 1 cm ao longo do abdômen.
3. Remova a pele até que o músculo das patas traseiras esteja totalmente exposto.
4. Remova as patas traseiras na altura do quadril, tomando cuidado para não quebrar o fêmur e a tíbia.
5. Coloque as patas traseiras em um tubo de centrífuga cônico com solução de etanol a 70%.
   NOTA: Sempre use camundongos livres de patógenos. Certifique-se de coletar as duas pernas para obter um número maior de células. A etapa 2 é realizada em um ambiente não estéril (bancada). Por isso, é importante remover o fêmur e a tíbia com cuidado para que permaneçam intactos para evitar contaminação bacteriana. As demais etapas deste procedimento são realizadas em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar. O tempo de exposição das pernas à solução de etanol a 70% deve ser limitado a 10 min. Se o tempo for maior, os progenitores da medula óssea podem ser afetados.

3. Obtenha progenitores da medula óssea a partir do lúmen da tíbia e do fêmur

1. Remova as pernas da solução de etanol a 70% e transfira-as para PBS estéril.
2. Usando fórceps e lenços desinfetantes para remover todos os músculos e fáscias. O osso deve estar limpo após esta etapa.
3. Use uma lâmina de bisturi cirúrgico estéril para cortar a epífise óssea em ambas as extremidades para expor a medula óssea.
4. Encha uma seringa de 20 mL com 10 mL de PBS estéril suplementado com solução de penicilina/estreptomicina a 2% e conecte uma agulha de 26 G.
5. Segure o osso usando uma pinça de dissecção anatômica com uma mão e use a outra para inserir a agulha na cavidade óssea. Tenha cuidado para não esmagar o osso com a pinça.
6. Lave o interior do osso com o PBS e colete a medula óssea em um tubo de centrífuga cônico estéril. Após esta etapa, a cavidade óssea deve parecer branca.
7. Centrifugue as células coletadas por 10 min a 300 x g a 4 °C.
8. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 ml de DMEM/F12-10.
9. Homogeneizar e adicionar mais 9 mL de meio DMEM/F12-10 para elevar as células a um total de 10 mL.

4. Cultura de macrófagos

1. Adicionar 1 mL de progenitores celulares a cada uma das placas de Petri plásticas redondas de 100 mm x 20 mm (total de 10 placas), espalhando as células pelas placas com uma pipeta para obter uma distribuição uniforme. Não use placas tratadas com cultura de tecidos.
2. Adicione 9 mL de DMEM / F12-10 suplementado com 20% do sobrenadante celular L-929 a cada placa.
3. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ .
4. No^3º dia, adicionar 10 mL de meio DMEM/F12-10 suplementado com 20% do sobrenadante de células L-929 a cada placa. Desta forma, as placas de cultura passam a ter um total de 20 mL de meio de cultura, suficiente para o crescimento das células até o final de sua maturação.
   NOTAS: As placas tratadas com cultura de tecidos não devem ser usadas porque os macrófagos, como células aderentes naturais marcadas por fortes interações com as superfícies, não se dissociam facilmente da placa posteriormente. Normalmente, os progenitores celulares de um camundongo (dois fêmures) podem ser semeados em 10 placas de cultura. Os progenitores celulares se transformarão em macrófagos, que podem ser usados do 7º ao 10º dia de incubação. A confirmação da maturação é identificada por alterações na morfologia dos macrófagos. Macrófagos maduros são aderentes e apresentam morfologia heterogênea, explicada pela emissão de pseudópodes em diferentes direções. Exemplos dessas células maduras são mostrados nos resultados representativos.

5. Colheita de macrófagos

1. Descarte os sobrenadantes de todos os pratos de cultura.
2. Lave cada placa de cultura com 10 ml de PBS quente (37 °C) estéril sem Mg²⁺ e Ca²⁺ .
3. Descarte a solução de cada prato.
4. Pré-aqueça a solução de dissociação celular não enzimática a 37 °C e adicione 3 ml a cada placa. Incubar por 10 min em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ . Use um microscópio invertido para visualizar se os macrófagos estão se dissociando das placas de cultura.
   NOTA: O uso de placas plásticas não tratadas com cultura de tecidos deve permitir a fácil dissociação das células e evitar a necessidade de raspar as células da placa.
5. Lave a loiça com uma pipeta serológica com a solução de dissociação celular não enzimática repetidamente, realizando movimentos circulares para confirmar que todos os macrófagos estão dissociados da placa.
6. Recolher a solução de todas as placas de cultura para um tubo de centrifugação cónico de 50 ml.
7. Adicione 10 ml de PBS pré-aquecido estéril às placas de cultura vazias e proceda como no passo 5.4. Este procedimento é uma repetição do passo 5.4 e pretende garantir que todos os macrófagos sejam coletados.
8. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min.
9. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 1 ml de DMEM/F12-10. Homogeneizar lenta e cuidadosamente para cima e para baixo usando a pipeta para evitar danificar as células.
10. Preparar uma alíquota de 10 μL de solução de macrófagos diluída com 10 μL de azul de tripano para contar as células utilizando o hemocitómetro.
    NOTA: No dia 7, cada prato produzirá aproximadamente 2 x 10⁶ macrófagos. Isso significa que um camundongo pode produzir aproximadamente 2 x 10⁷ macrófagos primários quando colhido em dez placas. Como o M-CSF apenas impulsiona a maturação dos macrófagos, o procedimento garante uma população de células que é essencialmente apenas macrófagos e livre de outros leucócitos contaminantes¹⁶.

Os macrófagos são células grandes e aderentes com características fisiológicas especiais. Eles mostram uma diversidade de apresentações morfológicas em cultura devido à capacidade de aderir ao vidro e ao plástico, e sua morfologia típica de espalhamento está relacionada à emissão de extensões citoplasmáticas (Figura 1). Uma vez que os progenitores da medula óssea são expostos ao M-CSF do sobrenadante da célula L-929 e iniciam a transformação em macrófagos maduros, eles se tornam aderentes à placa de Petri.

A Figura 2 mostra a cinética da transformação de progenitores da medula óssea em macrófagos maduros. No dia 3, alguns macrófagos imaturos aparecem, a maioria mostrando uma morfologia típica de forma redonda com poucas projeções de membrana (Figura 3). Embora se transformem ao longo de todo o processo, geralmente são necessários 7 dias para atingir um número e maturidade adequados para garantir a máxima eficiência do presente protocolo.

Além disso, os macrófagos são fagócitos (macro = grande; phagos = eat) capazes de fagocitar grandes quantidades de partículas antigênicas ou não antigênicas. Fenotipicamente, eles são caracterizados pela expressão das moléculas de superfície F4/80 e CD11b. A análise por citometria de fluxo mostra que os macrófagos obtidos através do presente protocolo representam uma população homogênea em termos de tamanho e granularidade (Figura 4). Além disso, 100% da população expressou F4/80 e CD11b, formando uma única população de células bem definida. Além disso, a análise da fagocitose de parasitas de Leishmania major mostrou uma enorme capacidade de fagocitose, comprovando que são macrófagos maduros e bem diferenciados (Figura 5).

Os dados microscópicos apresentados neste trabalho foram obtidos por meio de microscopia de fluorescência e contraste de fase no Centro de Aquisição e Processamento de Imagens (CAPI-ICB/UFMG).

Figura 1: Cultura de macrófagos derivados de progenitores da medula óssea, mostrando diferentes morfologias quando aderidos à placa, no dia 5. Os macrófagos emitem longas extensões citoplasmáticas que lhes permitem mover-se e fagocitar. O brilho e o contraste foram ajustados após a aquisição das imagens usando um filtro de contraste de interferência diferencial (DIC) 20x. Bar = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Cinética de transformação de progenitores da medula óssea em macrófagos maduros nos dias 1, 3, 5 e 7. O brilho e o contraste foram ajustados após a aquisição das imagens usando um filtro DIC 20x. Bar = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Presença de macrófagos imaturos levemente aderentes no dia 3 com uma morfologia típica de forma redonda com poucas projeções de membrana. O brilho e o contraste foram ajustados após a aquisição das imagens usando um filtro DIC 20x. Bar = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de citometria de fluxo de macrófagos derivados da medula óssea. Os macrófagos foram destacados das placas de prato (removedor de células) e corados com anti-F4/80 FITC e anti-CD11b PE-Cy7. (A) O aspecto das células com base no tamanho e granularidade (FSC x SSC). (B) A expressão dos marcadores celulares F4 / 80 e CD11b. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise de microscopia de fluorescência após fagocitose de parasitas de Leishmania major. Os macrófagos foram destacados das placas e semeados em lamínulas redondas de vidro, às quais foram adicionados parasitas de Leishmania major. A figura mostra os parasitas fagocitados dentro dos macrófagos. Os parasitas de Leishmania major foram corados com anticorpos anti-Leishmania FITC e os núcleos celulares (macrófagos e Leishmania major) foram contracorados com iodeto de propídio. (A) 20x; (B) 40x. Bar = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.