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Artigo de método

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

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DOI:

10.3791/64566

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23 de junho de 2023

 ,  ,  , 
1Department of General Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Resumo

Os macrófagos têm importantes funções efetoras na homeostase e inflamação. Essas células estão presentes em todos os tecidos do corpo e têm a importante capacidade de alterar seu perfil de acordo com os estímulos presentes no microambiente. As citocinas podem afetar profundamente a fisiologia dos macrófagos, especialmente o IFN-γ e a interleucina 4, gerando os tipos M1 e M2, respectivamente. Devido à versatilidade dessas células, a produção de uma população de macrófagos derivados da medula óssea pode ser uma etapa básica em muitos modelos experimentais de biologia celular. O objetivo deste protocolo é auxiliar os pesquisadores no isolamento e cultivo de macrófagos derivados de progenitores da medula óssea. Progenitores de medula óssea de camundongos C57BL/6 livres de patógenos são transformados em macrófagos após exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) que, neste protocolo, é obtido do sobrenadante da linhagem de fibroblastos murinos L-929. Após a incubação, os macrófagos maduros estão disponíveis para uso do7º ao10º dia. Um único animal pode ser a fonte de aproximadamente 2 x 107 macrófagos. Portanto, é um protocolo ideal para a obtenção de grandes quantidades de macrófagos primários usando métodos básicos de cultura celular.

Introdução

Monócitos e macrófagos são fagócitos mononucleares que podem ser derivados de progenitores na medula óssea. Estudos recentes relataram que os macrófagos também se originam de progenitores eritromielóides derivados do saco vitelino1. Independentemente de sua derivação, esses leucócitos têm importantes funções efetoras na homeostase e inflamação 2,3. Os monócitos são células do sangue periférico que podem se diferenciar ainda mais em macrófagos no tecido 2,4, enquanto os macrófagos são células heterogêneas que exibem fenótipos e funções reguladas pela exposição local de fatores de crescimento e citocinas5. Como os macrófagos apresentam essa diversidade funcional, eles têm sido estudados em muitos modelos de doenças. Assim, o cultivo in vitro de macrófagos tornou-se uma importante ferramenta para a compreensão de sua fisiologia e seu papel em diferentes doenças. A medula óssea é uma importante fonte de células progenitoras, incluindo progenitores de macrófagos, que podem ser isoladas e multiplicadas, aumentando exponencialmente o número de macrófagos obtidos. Além disso, os macrófagos derivados da medula óssea são especialmente importantes para evitar os efeitos gerados pelo microambiente tecidual, uma vez que os macrófagos mudam seu fenótipo em resposta a diferentes estímulos nos tecidos 6,7. Os progenitores da medula óssea se transformam em macrófagos após a exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF)8. Os macrófagos derivados da medula óssea não podem ser distinguidos dos macrófagos derivados de monócitos por marcadores bioquímicos no tecido. Essas células representam uma população altamente homogênea de células primárias, que em muitos outros aspectos são comparáveis aos macrófagos peritoneais 6,9.

Devido ao seu conjunto heterogêneo de funções celulares, os macrófagos há muito são exaustivamente estudados pelos pesquisadores. Essas células podem ser utilizadas em diferentes modelos experimentais, incluindo doenças infecciosas e inflamatórias, pois estão presentes nesses processos10,11. Eles também podem ser úteis para investigar a polarização de macrófagos em resposta a vários estímulos microambientais12,13. Assim, um protocolo simples e confiável é fornecido aqui com o objetivo de obter um grande número de macrófagos primários da medula óssea de camundongos.

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Protocolo

Este protocolo foi realizado de acordo com o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (Concea) e com a aprovação do Comitê de Ética e Uso de Animais (CEUA). Camundongos C57BL/6 foram adquiridos da Biotério Central da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Equipamentos de proteção individual (EPI), como jalecos, luvas e proteção para os olhos, devem ser usados em todas as etapas descritas neste protocolo.

1. Preparação do sobrenadante da linhagem L-929 de fibroblastos como fonte de M-CSF

  1. Descongele as células da linhagem de fibroblastos L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) e inicie o processo de cultura imediatamente para preservar a viabilidade.
  2. Em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar, usando uma pipeta de 1.000 μL, transfira as células da linhagem de fibroblastos L-929 do frasco para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
  3. Use uma pipeta sorológica para adicionar 50 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), livre de cálcio e magnésio.
  4. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
  5. Ressuspenda o pellet em 20 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mL de penicilina/estreptomicina (P/S) (DMEM/F12-10) usando uma pipeta sorológica.
  6. Transferir as células ressuspensas para um balão de cultura de células T75.
  7. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 até a confluência completa.
    NOTA: Ao manipular o frasco, tenha cuidado para evitar molhar a tampa com solução, pois isso pode ser uma fonte de contaminação. Para obter uma quantidade conveniente de sobrenadante, é necessário replicar as células depois que elas cobrem toda a superfície do frasco de cultura de células. As células L-929 são inibidas pelo contato. Solução quente de tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), DMEM/F12-10 e PBS estéril a 37 °C para iniciar a expansão da cultura celular, conforme descrito nas etapas a seguir.
  8. Uma vez atingida a confluência total, rejeitar o sobrenadante do balão de cultura de células, dentro da cabina de biossegurança do fluxo laminar.
  9. Lavar o balão de cultura de células com 20 ml de PBS estéril com uma pipeta serológica e rejeitar a solução.
  10. Adicione 10 mL de tripsina / EDTA (solução a 0,05%) ao frasco de cultura de células contendo as células aderidas.
  11. Transfira o frasco de cultura celular do fluxo laminar para uma incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% e incube por 3 min.
  12. Agitar o balão de cultura de células para dissociar as células da superfície do balão de cultura e utilizar um microscópio para garantir que todas as células foram dissociadas.
  13. Inative a tripsina / EDTA (solução a 0,05%) com 10 mL de meio DMEM / F12-10.
  14. Transferir a solução utilizando uma pipeta serológica para um tubo de centrifugação estéril de 50 ml.
  15. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Descarte o sobrenadante.
  16. Ressuspenda o pellet em 10 mL de meio DMEM/F12-10.
  17. Adicionar 1 ml da suspensão celular a um balão de cultura de células T175 (cultura 1:10).
  18. Repetir o procedimento para obter dez balões de cultura de células T175.
  19. Adicionar 50 ml de DMEM/F12-10 a cada balão de cultura de células.
  20. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 até a confluência completa.
    NOTA: Essas etapas garantem 500 mL de sobrenadante de célula L-929. No dia 5, após as células terem coberto a superfície do frasco de cultura de células T175, o sobrenadante será enriquecido para M-CSF e deverá ser coletado14.
  21. Remova o frasco de cultura de células da incubadora no dia 5 após a inibição de contato.
  22. Transfira o meio para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
  23. Centrifugar a 3.200 x g, a 4 °C durante 10 min.
  24. Recolha o sobrenadante enriquecido com M-CSF e transfira a solução para um tubo de centrifugação estéril de 50 ml. Conservar no congelador a -20 °C.
    NOTA: A centrifugação é extremamente importante para remover células e detritos dos sobrenadantes.
  25. O sobrenadante L-929 é uma fonte conveniente e barata de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e normalmente contém 5 a 10 ng/mL de M-CSF8. Esses sobrenadantes também contêm vestígios de outras citocinas e fatores de crescimento, mas não exercem uma influência profunda na fisiologia dos macrófagos15. No entanto, o M-CSF purificado pode ser adquirido e usado como alternativa aos sobrenadantes L-929 em concentrações de 1 a 2 ng/mL8.

2. Remoção do fêmur e tíbia

  1. Proceder à eutanásia de camundongo macho C57BL-6 de 8 semanas de idade, por luxação cervical após asfixia por dióxido de carbono, de acordo com a resolução normativa número 18 do Conselho Nacional de Experimentação Animal (Concea) e com aprovação do Comitê de Ética e Uso de Animais (CEUA).
  2. Mergulhe o mouse com solução de etanol a 70% e use uma tesoura estéril para fazer uma incisão de 1 cm ao longo do abdômen.
  3. Remova a pele até que o músculo das patas traseiras esteja totalmente exposto.
  4. Remova as patas traseiras na altura do quadril, tomando cuidado para não quebrar o fêmur e a tíbia.
  5. Coloque as patas traseiras em um tubo de centrífuga cônico com solução de etanol a 70%.
    NOTA: Sempre use camundongos livres de patógenos. Certifique-se de coletar as duas pernas para obter um número maior de células. A etapa 2 é realizada em um ambiente não estéril (bancada). Por isso, é importante remover o fêmur e a tíbia com cuidado para que permaneçam intactos para evitar contaminação bacteriana. As demais etapas deste procedimento são realizadas em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar. O tempo de exposição das pernas à solução de etanol a 70% deve ser limitado a 10 min. Se o tempo for maior, os progenitores da medula óssea podem ser afetados.

3. Obtenha progenitores da medula óssea a partir do lúmen da tíbia e do fêmur

  1. Remova as pernas da solução de etanol a 70% e transfira-as para PBS estéril.
  2. Usando fórceps e lenços desinfetantes para remover todos os músculos e fáscias. O osso deve estar limpo após esta etapa.
  3. Use uma lâmina de bisturi cirúrgico estéril para cortar a epífise óssea em ambas as extremidades para expor a medula óssea.
  4. Encha uma seringa de 20 mL com 10 mL de PBS estéril suplementado com solução de penicilina/estreptomicina a 2% e conecte uma agulha de 26 G.
  5. Segure o osso usando uma pinça de dissecção anatômica com uma mão e use a outra para inserir a agulha na cavidade óssea. Tenha cuidado para não esmagar o osso com a pinça.
  6. Lave o interior do osso com o PBS e colete a medula óssea em um tubo de centrífuga cônico estéril. Após esta etapa, a cavidade óssea deve parecer branca.
  7. Centrifugue as células coletadas por 10 min a 300 x g a 4 °C.
  8. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 ml de DMEM/F12-10.
  9. Homogeneizar e adicionar mais 9 mL de meio DMEM/F12-10 para elevar as células a um total de 10 mL.

4. Cultura de macrófagos

  1. Adicionar 1 mL de progenitores celulares a cada uma das placas de Petri plásticas redondas de 100 mm x 20 mm (total de 10 placas), espalhando as células pelas placas com uma pipeta para obter uma distribuição uniforme. Não use placas tratadas com cultura de tecidos.
  2. Adicione 9 mL de DMEM / F12-10 suplementado com 20% do sobrenadante celular L-929 a cada placa.
  3. Incubar em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 .
  4. No3º dia, adicionar 10 mL de meio DMEM/F12-10 suplementado com 20% do sobrenadante de células L-929 a cada placa. Desta forma, as placas de cultura passam a ter um total de 20 mL de meio de cultura, suficiente para o crescimento das células até o final de sua maturação.
    NOTAS: As placas tratadas com cultura de tecidos não devem ser usadas porque os macrófagos, como células aderentes naturais marcadas por fortes interações com as superfícies, não se dissociam facilmente da placa posteriormente. Normalmente, os progenitores celulares de um camundongo (dois fêmures) podem ser semeados em 10 placas de cultura. Os progenitores celulares se transformarão em macrófagos, que podem ser usados do 7º ao 10º dia de incubação. A confirmação da maturação é identificada por alterações na morfologia dos macrófagos. Macrófagos maduros são aderentes e apresentam morfologia heterogênea, explicada pela emissão de pseudópodes em diferentes direções. Exemplos dessas células maduras são mostrados nos resultados representativos.

5. Colheita de macrófagos

  1. Descarte os sobrenadantes de todos os pratos de cultura.
  2. Lave cada placa de cultura com 10 ml de PBS quente (37 °C) estéril sem Mg2+ e Ca2+ .
  3. Descarte a solução de cada prato.
  4. Pré-aqueça a solução de dissociação celular não enzimática a 37 °C e adicione 3 ml a cada placa. Incubar por 10 min em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 . Use um microscópio invertido para visualizar se os macrófagos estão se dissociando das placas de cultura.
    NOTA: O uso de placas plásticas não tratadas com cultura de tecidos deve permitir a fácil dissociação das células e evitar a necessidade de raspar as células da placa.
  5. Lave a loiça com uma pipeta serológica com a solução de dissociação celular não enzimática repetidamente, realizando movimentos circulares para confirmar que todos os macrófagos estão dissociados da placa.
  6. Recolher a solução de todas as placas de cultura para um tubo de centrifugação cónico de 50 ml.
  7. Adicione 10 ml de PBS pré-aquecido estéril às placas de cultura vazias e proceda como no passo 5.4. Este procedimento é uma repetição do passo 5.4 e pretende garantir que todos os macrófagos sejam coletados.
  8. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min.
  9. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 1 ml de DMEM/F12-10. Homogeneizar lenta e cuidadosamente para cima e para baixo usando a pipeta para evitar danificar as células.
  10. Preparar uma alíquota de 10 μL de solução de macrófagos diluída com 10 μL de azul de tripano para contar as células utilizando o hemocitómetro.
    NOTA: No dia 7, cada prato produzirá aproximadamente 2 x 106 macrófagos. Isso significa que um camundongo pode produzir aproximadamente 2 x 107 macrófagos primários quando colhido em dez placas. Como o M-CSF apenas impulsiona a maturação dos macrófagos, o procedimento garante uma população de células que é essencialmente apenas macrófagos e livre de outros leucócitos contaminantes16.

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Resultados

Os macrófagos são células grandes e aderentes com características fisiológicas especiais. Eles mostram uma diversidade de apresentações morfológicas em cultura devido à capacidade de aderir ao vidro e ao plástico, e sua morfologia típica de espalhamento está relacionada à emissão de extensões citoplasmáticas (Figura 1). Uma vez que os progenitores da medula óssea são expostos ao M-CSF do sobrenadante da célula L-929 e iniciam a transformação em macrófagos maduros, eles se tornam aderentes à ...

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Discussão

A produção de uma população de macrófagos derivados da medula óssea é uma etapa básica em muitos modelos experimentais de biologia celular, especialmente quando é importante alcançar uma população homogênea de células primárias. Como mencionado, os progenitores celulares só podem se transformar em macrófagos na presença de M-CSF. Os sobrenadantes de células L-929 podem ser usados como a principal fonte de M-CSF. Além do custo, não há problema em usar o próprio M-CSF recombinante 8,17

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Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), por meio da Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) e Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 20 ccDESCARPACKSI100S4GSeringa estéril
Agulhas 26-GBD497AQDKT7Agulhas estéreis
Tubo de centrífuga cônico de 50 mlSARSTEDT62547254Tubos cônicos de plástico adequados para centrifugação
Solução de etanol a 70%EMFAL490Solução de etanol para esterilização
Dissecção anatômica fórceps3B SCIENTIFICW1670Manter em béquer estéril contendo solução de etanol a 70%
C57Bl/6 camundongo tipo selvagemComprado da Bioté Rio Central na Universidade Federal de Minas GeraisNão se aplicaCamundongos devem estar livres de patógenos específicos, com idade entre 6 e 10 semanas. Os ratinhos têm de ser acomodados pelo menos uma semana antes para recuperarem do stress do transporte
Balão de cultura de células T175GREINERC7481-50EAT-175 Balão, gargalo inclinado, superfície 75 cm2, com tampa filtrante, isento de DNase, isento de RNase
Balão de cultura celular T75GREINERC7231-120EABalão T-75, gargalo inclinado, superfície 75 cm2, com tampa filtrante, isento de DNase, Desinfetante sem RNase
ou lenços umedecidos?CLOROXNão aplicávelAjuda a limpar o osso
Água destiladaGIBCO15230Água destilada estéril
DMEM/F12-10Não aplicávelaplicávelAdicionar 10 ml de soro fetal bovino (FBS) e 1 ml de penicilina/estreptomicina (P/S) ao DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + sobrenadante de células L-929Não aplicávelaplicávelAdicionar 20% de sobrenadante da cultura de células L929 em DMEM/F-12-10
Dulbecco′ s Águia Modificada′ s Meio - F12 (DMEM/F12)GIBCO12500096DMEM: O meio F-12 contém 2,5 mM de L-glutamina, 15 mM de HEPES, 0,5 mM de piruvato de sódio e 1200 mg/L de bicarbonato de sódio. Ressuspenda o pó a 1 litro de água destilada
e adicione 3,7 g de bicarbonato de sódio. Ajustar o pH para 7,2 e filtrar com 0,22 µM. Armazenamento a 2 - 8 &graus; C freezer
Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor, Estados Unidos (FBS)GIBCO10082147Enriquecimento para DMEM-F12
HemocitômetroSIGMA-ALDRICHZ359629Usado para contar macrófagos em microscopia
Células L-929SIGMA-ALDRICHATCC # CCL-1L-929 é uma linhagem de células de fibroblastos de camundongo usadas como fonte de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF)
Eclipse da Nikon TI NIKON Não aplicávelNikon TI Eclipse é um microscópio de fluorescência e contraste de fase
Solução de dissociação celular não enzimáticaCELLSTRIPER (CORNING)25-056-CISolução de dissociação celular não enzimática remove macrófagos da placa sem danificá-los Placas de
cultura redondas não tratadas 100 &vezes; 20– mmCORNINGCLS430591Não use placas de Petri tratadas para cultura de tecidos ou qualquer placa tratada com cultura de tecidos
P3199 Penicilina G Sal de potássioUSBIOLÓGICO113-98-4Antibióticos
penicilina e estreptomicina (P/S)Use 0,26 gramas de penicilina e 0,40 gramas de estreptomicina. Misture com 40 mL de PBS estéril. Dentro de um gabinete de fluxo laminar horizontal, use um 0,22 µ M filtre e armazene alíquotas de 1,0 mL em tubos de microfuga de 1,5 ml no freezer (-20° C)
Solução salina tamponada com fosfato livre de cálcio e magnésio (PBS)MEDIATECH21-040-CMEstéril
S7975 Sulfato de estreptomicina, 650-850U / mgUSBIOLOGICAL3810-74-0Antibióticos
Pipetas sorológicas de 10mL ou 25 mLSARSTEDT861254001Pipetas sorológicas são usadas volumes superiores a 1 mL
Bicarbonato de sódioSIGMA-ALDRICH144-55-8Correção de pH para DMEM-F12
Software Nis Elements ViewerNIKONNão aplicávelO NIS-Elements Viewer é um programa autônomo gratuito para visualizar arquivos de imagem e conjuntos
de dados PBS estéril e 2% de solução P/SLABORCRIN590338Adicionar 1 mL de P/S em 40 mL de PBS estéril
Tesoura de íris retaKATENANão aplicávelManter em béquer estéril contendo solução de etanol a 70%
Sobrenadante de células L-929Não aplicávelNão aplicávelL-929 é uma linhagem de células de fibroblastos de camundongo usada como fonte de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O sobrenadante L-929 foi obtido a partir do protocolo
Lâmina de bisturi cirúrgico nº 24 de aço inoxidávelSWANN-MORTON311Usado para expor a epífise dos ossos
A solução de azul de tripano, 0,4%GIBCO15250061de azul de tripano, 0,4%, é usada rotineiramente como corante celular para avaliar a viabilidade celular usando o teste de exclusão de corante
Solução de tripsina / EDTA 0,05%GIBCO25300-062Usado para dissociar células da garrafa de cultura
Água para injeção (WFI) para cultura celularGIBCOA12873Água estéril e livre de endotoxinas
Não Não Solução de Solução

Referências

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