Reconstituindo a citoarquitetura e a função de tecidos epiteliais humanos em um chip de órgão de topo aberto

Summary

O presente protocolo descreve as capacidades e as modalidades de cultura essenciais do Open-Top Organ-Chip para o estabelecimento e maturação bem-sucedidos de culturas organ-on-chip de espessura total de tecidos primários (pele, alvéolo, vias aéreas e intestino), proporcionando a oportunidade de investigar diferentes aspectos funcionais da interface epitelial/mesenquimal e vascular humana in vitro.

Abstract

Quase todos os órgãos humanos são revestidos por tecidos epiteliais, compreendendo uma ou várias camadas de células fortemente conectadas organizadas em estruturas tridimensionais (3D). Uma das principais funções do epitélio é a formação de barreiras que protegem os tecidos subjacentes contra insultos físicos e químicos e agentes infecciosos. Além disso, os epitélios mediam o transporte de nutrientes, hormônios e outras moléculas sinalizadoras, muitas vezes criando gradientes bioquímicos que guiam o posicionamento celular e a compartimentalização dentro do órgão. Devido ao seu papel central na determinação da estrutura e função do órgão, os epitélios são importantes alvos terapêuticos para muitas doenças humanas que nem sempre são capturadas por modelos animais. Além das óbvias diferenças espécie-espécie, a realização de pesquisas sobre a função de barreira e as propriedades de transporte de epitélios em animais é agravada pela dificuldade de acesso a esses tecidos em um sistema vivo. Embora as culturas de células humanas bidimensionais (2D) sejam úteis para responder a perguntas científicas básicas, elas geralmente produzem previsões in vivo pobres. Para superar essas limitações, na última década, uma infinidade de plataformas biomiméticas microprojetadas, conhecidas como organs-on-a-chip, emergiram como uma alternativa promissora aos testes tradicionais in vitro e em animais. Aqui, descrevemos um Open-Top Organ-Chip (ou Open-Top Chip), uma plataforma projetada para modelar tecidos epiteliais específicos de órgãos, incluindo pele, pulmões e intestinos. Este chip oferece novas oportunidades para reconstituir a arquitetura multicelular e a função dos tecidos epiteliais, incluindo a capacidade de recriar um componente estromal 3D incorporando fibroblastos tecido-específicos e células endoteliais dentro de um sistema mecanicamente ativo. Este Open-Top Chip fornece uma ferramenta inédita para estudar interações epiteliais/mesenquimais e vasculares em múltiplas escalas de resolução, desde células únicas até construções de tecido multicamadas, permitindo assim a dissecção molecular do crosstalk intercelular de órgãos epitelizados na saúde e na doença.

Introduction

Historicamente, os cientistas têm confiado em testes pré-clínicos em animais para a descoberta de drogas, mas um número crescente desses métodos tem sido questionado devido à fraca correlação com o resultado humano¹. A implementação dos princípios dos "3Rs" para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal insta os cientistas a encontrar novos métodos alternativos in vitro para apoiar a avaliação pré-clínica de risco toxicológico de drogas e produtos químicos². No entanto, muitos modelos in vitro desenvolvidos até o momento carecem da arquitetura biológica, complexidade celular e ambiente mecânico necessários para recapitular a natureza dinâmica dos órgãos vivos humanos ^3,4.

Os sistemas pré-clínicos in vitro convencionais tipicamente empregam monoculturas 2D de células humanas cultivadas em uma superfície plástica rígida. Esses métodos fornecem uma ferramenta para a realização de estudos mecanísticos simples e permitem a triagem rápida de candidatos a drogas. Devido ao seu custo relativamente baixo e alta robustez, os modelos 2D são frequentemente emparelhados com sistemas automáticos de alto rendimento e usados para a rápida identificação de potenciais candidatos a fármacos durante a fase inicial do processo de desenvolvimento de fármacos ^5,6. No entanto, tais modelos 2D não fornecem uma abordagem translacional para modelar respostas em nível de tecido, órgão ou sistêmica a candidatos terapêuticos, o que é necessário para previsões precisas de segurança e eficácia de medicamentos durante o estágio pré-clínico de seu desenvolvimento. As culturas de células planas não recapitulam o microambiente do tecido nativo, incluindo a complexa interação multicelular, as propriedades biomecânicas e a arquitetura tridimensional (3D) dos tecidos humanos⁷. As células que crescem em uma superfície plana muitas vezes não adquirem um fenótipo maduro e, portanto, não podem responder aos estímulos farmacológicos como responderiam no tecido nativo. Por exemplo, células epiteliais alveolares humanas primárias cultivadas in vitro exibem um fenótipo escamoso e perdem marcadores fenotípicos chave, incluindo as proteínas C e B do surfactante (SP-C e SP-B)⁸. Além da diferenciação insuficiente, as células primárias frequentemente tornam-se insensíveis a estressores biológicos in vitro, à medida que certas vias bioquímicas associadas à inflamação tecidual tornam-se não^funcionais9. Essa perda da função celular parece estar primariamente associada ao uso de substratos rígidos, bem como à falta de fatores solúveis liberados naturalmente pelas células estromais tecido-específicas, como fibroblastos pulmonares e células musculares^lisas10,11.

A compreensão de que a falta de complexidade físico-química e biológica limita o comportamento fisiológico das células in vitro tem fomentado o desenvolvimento de modelos multicelulares mais sofisticados, que têm demonstrado captar melhor a complexidade dos tecidos humanos fora do organismo^12,13. Desde a criação dos primeiros modelos de co-cultura no início da década de 1970¹⁴, a introdução de hidrogéis sintéticos e naturais melhorou significativamente a capacidade de mimetizar microambientes de tecidos nativos e tornou-se uma ferramenta inestimável para impulsionar a diferenciação celular, orientar a auto-organização das células em estruturas semelhantes a tecidos e restaurar as funções dos tecidos nativos^15,16. Por exemplo, quando cultivadas no arcabouço 3D apropriado, as células humanas podem se auto-organizar em estruturas funcionais, como esferoides ou organoides, expressando marcadores de células-tronco, e são capazes de se auto-renovar¹⁷. Em contraste, as células humanas (incluindo células-tronco), quando cultivadas em substratos 2D tradicionais, envelhecem rapidamente e sofrem senescência após algumas passagens¹⁸. Além disso, os hidrogéis podem ser "adaptados" para corresponder a propriedades específicas do tecido, como porosidade, tamanho dos poros, espessura da fibra, viscoelasticidade, topografia e rigidez, ou ainda projetados com componentes celulares derivados do tecido e/ou moléculas bioativas, permitindo a emulação das condições fisiológicas ou patológicas^19,20. Apesar de seu enorme potencial para testes de fármacos, os modelos 3D baseados em hidrogel utilizados em pesquisas farmacêuticas não recapitulam completamente a complexa citoarquitetura dos tecidos in vivo e carecem de importantes estímulos hemodinâmicos e mecânicos normalmente presentes no corpo humano, incluindo pressão hidrostática, estiramento cíclico e cisalhamento de fluidos²¹.

Sistemas microfisiológicos (MPSs) como os Organs-on-chips (OOCs) têm emergido recentemente como ferramentas capazes de captar respostas fisiológicas complexas in vitro^22,23. Esses modelos frequentemente empregam o uso de plataformas microfluídicas, que permitem a modelagem do microambiente dinâmico de órgãos vivos.

Combinamos os princípios da bioengenharia de tecidos 3D e da mecanobiologia para criar um modelo Open-Top Chip de tecido epitelial humano complexo. Isso nos permitiu recapitular de perto o microambiente multicelular e dinâmico dos tecidos epiteliais. Isso inclui pistas bioquímicas e biomecânicas tecido-específicas naturalmente presentes em órgãos vivos, mas frequentemente negligenciadas pelos modelos in vitro tradicionais²⁴. O Open-Top Chip incorpora dois compartimentos: um compartimento vascular (Figura 1A) e um compartimento estromal (Figura 1B) separados por uma membrana porosa, permitindo a difusão de nutrientes entre as duas câmaras (Figura 1C). O compartimento vascular é exposto ao fluxo contínuo de fluido para recapitular a tensão fisiológica de cisalhamento, enquanto o desenho esticável da câmara estromal permite a modelagem do estiramento mecânico associado aos movimentos respiratórios ou peristaltismo intestinal. O compartimento estromal abriga o arcabouço de hidrogel 3D ajustável projetado para suportar o crescimento fisiológico de fibroblastos específicos do tecido. Possui tampa removível que facilita o estabelecimento de uma interface ar-líquido, condição que permite maior emulação da fisiologia humana dos tecidos mucosos e acesso direto ao tecido para administração de fármacos diretamente na camada epitelial. A Figura 1 Suplementar captura alguns dos principais componentes do projeto do Open-Top Chip, incluindo dimensões e compartimentos biológicos (Figura Suplementar 1A-D), bem como as principais etapas técnicas descritas neste protocolo (Figura 1E Suplementar).

A perfusão do Open-Top Chip é realizada com bomba peristáltica programável (Figura 1D). A configuração da bomba peristáltica permite que 12 chips de topo aberto sejam perfundidos simultaneamente. A maioria das incubadoras pode abrigar duas configurações que permitem a cultura de até 24 chips por incubadora. O alongamento mecânico é obtido usando um regulador de pressão de vácuo programável sob medida (Figura 1E). Consiste em um regulador de vácuo eletropneumático controlado eletronicamente por um conversor digital-analógico. Em outras palavras, o regulador de vácuo eletropneumático gera um perfil de vácuo senoidal com amplitude e frequência determinadas pelo usuário. A deformação cíclica que varia de 0% a 15% é gerada pela aplicação de pressão negativa no canal de vácuo do Open-Top Chip em uma amplitude que varia de 0 a -90 kPa e uma frequência de 0,2 Hz. Trata-se de um sistema sob medida, equivalente à Unidade de Deformação Flexcell disponível comercialmente anteriormente adotada e descrita em outros trabalhos²⁵. Para mimetizar a deformação mecânica do tecido associada, por exemplo, ao movimento respiratório do pulmão ou ao peristaltismo do intestino, o atuador pneumático aplica ondas de vácuo/deformação sinusoidais cuja magnitude e amplitude podem ser ajustadas para corresponder ao nível fisiológico de deformação e frequência que as células humanas experimentam em seu tecido nativo.

Aqui, descrevemos um método eficiente e reprodutível para engenharia e cultivo de equivalentes de epitélio organotípico em um protótipo de plataforma Open-Top Chip. Permite a geração de modelos complexos de órgãos, como pele, alvéolo, vias aéreas e cólon, integrando fluxo de fluido vascular e alongamento mecânico. Descreveremos os principais aspectos técnicos que devem ser considerados na implementação dos princípios da engenharia de tecidos para a geração de modelos epiteliais complexos. Discutiremos as vantagens e possíveis limitações do desenho atual.

Uma visão geral das principais etapas utilizadas para alcançar a maturação dos tecidos e órgãos, incluindo os parâmetros de fluxo e estiramento, é relatada em: Figura 2 para a pele, Figura 3 para o alvéolo, Figura 4 para a via aérea e Figura 5 para o intestino. Informações adicionais sobre a composição dos meios e os reagentes utilizados para a cultura dos diferentes modelos de órgãos estão incluídas nas tabelas complementares (Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 3 para via aérea e Tabela Suplementar 4 para intestino).

Protocol

Os colonoides humanos foram obtidos de ressecções intestinais de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Biossegurança do Hospital Infantil de Cincinnati (IBC 2017-2011).

1. Ativação de superfície

1. Preparação do buffer de ativação
   1. Coloque o reticulante e os reagentes tampão de solvente sob a cabine de biossegurança (BSC) e deixe-os se equilibrar à temperatura ambiente (TR) por 10 minutos antes do uso.
   2. Reconstituir 5 mg de reticulante em 5 mL do tampão de solvente usando um recipiente estéril impermeável à luz ou um tubo cônico transparente de 15 mL envolto em folha de alumínio para proteger a solução de reticulante da exposição direta à luz.
   3. Vórtice a solução por 1 min para remover todos os aglomerados e, em seguida, pipete 50 μL da solução reticulante diretamente no canal inferior do cavaco e 150 μL na câmara de topo aberto.
   4. Remova qualquer excesso de solução de reticulação da superfície do cavaco usando um aspirador. Em seguida, pipetar 50 μL adicionais da solução de reticulação diretamente no canal inferior do cavaco e 150 μL na câmara de topo aberto para remover qualquer bolha de ar restante.
2. Ativação com máquina de reticulação UV
   1. Retire delicadamente a tampa do cavaco sob o BSC e guarde-a em um recipiente estéril.
   2. Transfira os cavacos que contêm a solução de reticulante para uma placa de Petri, feche a placa de Petri para evitar contaminação e coloque a placa com os cavacos sob a máquina de reticulação UV.
      NOTA: Remova a tampa da placa de Petri para maximizar a exposição aos raios UV.
   3. Ajuste a máquina de reticulação UV com um comprimento de onda de pico de 365 nm a uma intensidade de 100 μJ/cm² e ligue a luz UV por 20 minutos.
      NOTA: Após 20 minutos de tratamento UV, a solução de reticulante ficará mais escura (marrom).
   4. Traga os cavacos de volta sob o BSC e aspirar a solução de reticulante oxidado. Em seguida, enxágue todos os cavacos três vezes com o tampão de solvente e deixe os cavacos secar sob o BSC por 5-10 min para completar a funcionalização química da superfície do polidimetilsiloxano (PDMS).

2. Preparação do equivalente do estroma

1. Preparo de tampão de reconstrução 10x (100 mL)
   1. Dissolver 2,2 g de bicarbonato de sódio em 75 mL de NaOH 0,067 M em água bidestilada.
   2. Adicionar 4,76 g de HEPES e elevar o volume para 100 mL com água bidestilada.
   3. Filtrar estéril a solução sob o BSC usando um filtro estéril descartável com membrana de 0,22 μm.
      NOTA: A solução é estável durante cerca de 6 meses quando armazenada a 4 °C.
2. Estimativa do volume da solução pré-gel
   1. Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 150 μL (volume interno da câmara central de topo aberto) para estimar a quantidade de solução pré-gel necessária para o experimento:
      Volume necessário = (Número de cavacos x 150) μL
   2. Preparar a solução pré-gel de colagénio no gelo misturando: 1 volume de EMEM 10x contendo as células de escolha, 1 volume de tampão de reconstrução 10x (ver passo 2.1), 8 volumes de solução de colagénio I (10 mg/ml) e 1 μL de solução de NaOH 1 N para cada mg de colagénio I.
      NOTA: Recomenda-se preparar um volume extra de +15% para contabilizar erros experimentais; O exemplo descrito na secção 2.2 fornece um procedimento passo a passo detalhado para preparar uma solução de pré-gel suficiente para 12 chips e um volume extra de 15%.
3. Preparação de solução de pré-gel para o equivalente estroma (para 12 chips)
   1. Traga as seguintes soluções sob o BSC no gelo: 10x EMEM; 10x Buffer de reconstrução (ver passo 2.1); Solução de colágeno I (10 mg/mL); e solução estéril de NaOH 1 N.
   2. Cultivar células mesenquimais tecido-específicas conforme indicado pelos provedores até 80%-90% confluentes e, em seguida, dissociar as células usando tripsina ou outros métodos, conforme recomendado pelo provedor de células. Recolher as células num pellet por centrifugação a 250 x g durante 5 min a 24 °C.
   3. Ressuspender o pellet de células em 225 μL de EMEM 10x gelado e adicionar 225 μL de tampão de reconstrução 10x gelado (ver passo 2.1). Misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo e, em seguida, adicione 1.800 μL de solução de colágeno I gelada.
   4. Pipetar para cima e para baixo 5-6 vezes, evitando bolhas para misturar a solução de pré-gel enquanto estiver no gelo.
4. Incorporação do equivalente estroma no cavaco (para 12 chips)
   1. Neutralizar a solução pré-gel com 18 μL de NaOH 1N. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo 5-6 vezes e, em seguida, pipete 150 μL de hidrogel carregado de células para a câmara central do Open-Top Chip evitando bolhas.
      NOTA: Se a micropadronização for necessária, passe para a próxima etapa (seção 3).
   2. Agrupar os cavacos em placas de Petri separadas, incluindo uma tampa de tubo de centrífuga preenchida com 2 mL de ddH 2 O estéril em cada placa de Petri, e incubar a(s) placa(s) de Petri na incubadora a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Após 90 min, o hidrogel carregado de células será completamente polimerizado.

3. Micropadronização de superfície (opcional)

1. Realizar micropadronização de superfície do hidrogel estromal após pipetar o hidrogel de colágeno neutralizado (ainda em seu estado líquido) usando carimbos impressos em 3D.
   NOTA: Os selos impressos em 3D podem ser obtidos em vários desenhos personalizáveis, conforme descrito anteriormente em outro artigo²⁴.
2. Pipetar 20 μL da solução pré-gel de colágeno I neutralizado na superfície padronizada de um carimbo estéril impresso em 3D e inserir o carimbo dentro (em cima) da câmara de topo aberto enquanto o hidrogel estromal ainda estiver na forma líquida.
3. Remova qualquer resíduo do hidrogel que possa derramar do topo da câmara aberta usando um aspirador (ou uma pipeta). Agrupe todos os chips em placas de Petri separadas e inclua uma tampa de tubo cônico de 15 mL de centrífuga preenchida com 2 mL de ddH₂O estéril em cada placa de Petri.
4. Incubar todas as placas de Petri a 37 °C, 5% CO₂ por 90 min, e então trazer os cavacos de volta sob o BSC e remover suavemente os carimbos usando pinças de precisão para reduzir o risco de danificar o hidrogel.

4. Revestimento da superfície epitelial e vascular com proteínas tecido-específicas da MEC

1. Revestimento da câmara microfluídica vascular com proteínas da matriz extracelular
   1. Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 20 μL (volume do canal vascular) para estimar o volume de solução de revestimento de ECM vascular necessário para o experimento:
      Volume necessário = (Número de chips x 20) μL
      NOTA: Recomenda-se preparar um volume extra de 15% para contabilizar erros experimentais.
   2. Prepare a solução de revestimento vascular ECM para todos os chips (por exemplo, 300 μL por 12 chips) usando PBS ou HBSS gelados.
      NOTA: Consulte a tabela de protocolo de órgão específico na seção de materiais complementares (Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 2 para via aérea e Tabela Suplementar 4 para intestino) para identificar os reagentes específicos e a composição recomendada da MEC.
   3. Pipetar 20 μL da solução de revestimento vascular da MEC para o canal vascular de cada chip.
2. Revestimento da superfície apical do equivalente estromal com proteínas da matriz extracelular
   1. Multiplique o número de chips necessários para o experimento por 50 μL (volume do canal vascular) para estimar o volume de solução de revestimento epitelial de MEC necessário para o experimento:
      Volume necessário = (Número de cavacos x 50) μL
      NOTA: recomenda-se preparar um volume extra de 15% para contabilizar erros experimentais.
   2. Prepare solução de revestimento ECM suficiente para todos os cavacos (por exemplo, 750 μL por 12 chips) em PBS ou HBSS gelado e transfira 50 μL de solução de revestimento ECM epitelial diretamente sobre a superfície do hidrogel.
      NOTA: Consulte a tabela de protocolo de órgão específico na seção de materiais complementares (Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 2 para via aérea e Tabela Suplementar 4 para intestino) para identificar os reagentes específicos e a composição recomendada da MEC.
   3. Agrupar os cavacos em placas de Petri separadas, incluindo uma tampa de tubo cônico de 15 mL de centrífuga preenchida com 2 mL de ddH 2 O estéril em cada placa de Petri, e incubar a(s) placa(s) de Petri na incubadora a 37 °C, 5% CO 2 por₂h antes de prosseguir com a semeadura de células epiteliais.

5. Semeando células epiteliais no equivalente estromal

1. Cultura de células epiteliais
   1. Cultura de células epiteliais tecido-específicas conforme orientação dos profissionais até 80%-90% confluentes.
   2. Dissociar as células usando procedimentos enzimáticos proteolíticos conforme recomendado pelo provedor de células.
      NOTA: Para melhores resultados, colher células epiteliais em baixa passagem (P1-P2) durante a fase de crescimento ativo quando atingem entre 70%-90% de confluência.
   3. Uma vez dissociadas, centrifugar as células e coletá-las como um pellet.
   4. Ressuspender as células epiteliais até a densidade de células/fragmentos apropriada, conforme indicado na tabela de protocolos de órgãos específicos.
      OBS: Neste estudo, utilizou-se solução celular na densidade de 3 x 10 6 células/mL para a pele, 1 x 10 6 células/mL para o alvéolo, 6 x 10 6 células/mL para a via aérea e 8 x 10 ⁶ fragmentos/mL para o intestino.
2. Semeadura de células epiteliais
   1. Transfira os cavacos da incubadora para o BSC. Aspirar a solução de revestimento do canal vascular e lavar o canal microfluídico vascular três vezes com 50 μL de meio de cultura de células endoteliais fresco.
   2. Aspirar a solução de revestimento da superfície do hidrogel e enxaguar a superfície do estroma três vezes com 100 μL de meio de cultura de células epiteliais fresco para remover qualquer excesso de solução de revestimento.
   3. Aspirar o meio ascendente e semear a superfície do hidrogel com 50 μL da suspensão de células epiteliais usando densidade celular apropriada, conforme indicado nas tabelas suplementares, e então transferir os cavacos de volta para a incubadora por 2 h (ou durante a noite para colonoides).
   4. Enxaguar suavemente a superfície do hidrogel com o meio de cultura celular duas vezes para remover os detritos celulares. Finalmente, renove o meio autoclavando em recipientes autoclaváveis selados e conecte os cavacos à bomba peristáltica.

6. Conectando chips ao fluxo

1. Preparação das peças fluídicas
   1. Corte 2 polegadas de tubulação de transferência de elastômero termoplástico (TPE) à base de polipropileno biocompatível (Tabela de Materiais) para preparar a tubulação microfluídica curta necessária para conectar os cavacos aos reservatórios de mídia.
   2. Corte 7,5 polegadas de tubo de transferência TPE biocompatível para produzir a tubulação microfluídica longa.
   3. Prepare conectores metálicos suficientes de 18 G e 19 G (Tabela de Materiais).
      NOTA: Recomenda-se preparar e esterilizar a tubulação e os conectores descritos nas etapas 6.1.1 e 6.1.2 pelo menos 1 dia antes de conectar os chips de topo aberto às bombas peristálticas.
   4. Perfurar a tampa de cada reservatório médio com uma agulha hipodérmica de 4 polegadas (Tabela de Materiais).
2. Desgaseificação média
   1. Permitir que o meio de cultura celular se equilibre à temperatura ambiente (TR).
   2. Transfira o volume de meio necessário para um tubo de filtragem cônico.
   3. Aplicar uma pressão de vácuo negativa de -20 PSI para desgaseificar o meio (filtração a vácuo).
      NOTA: Se um vácuo não estiver disponível, o meio de cultura celular pode ser deixado para se equilibrar na incubadora durante a noite para alcançar resultados semelhantes.
3. Prepare o Chip de topo aberto para o fluxo de fluido
   1. Traga os cavacos e as peças fluídicas estéreis sob o BSC e alinhe a tampa (parte superior) do Open-Top Chip para selar o protótipo do Open-Top Chip antes de iniciar o fluxo de fluido.
   2. Pipetar 200 μL do meio de cultura celular desgaseificado (ver tabelas específicas de órgãos) para a porta de entrada dos canais superior e inferior do chip, prestando atenção para evitar bolhas.
   3. Pipetar 300 μL do meio de cultura para dentro da tubulação microfluídica curta para preparar a superfície interna dos tubos e conectar a tubulação curta às entradas dos canais superior e inferior do cavaco.
4. Conecte e prima as superfícies microfluídicas
   1. Posicione os reservatórios médios no rack da fazenda, conecte a agulha hipodérmica à entrada inferior dos cavacos e, finalmente, acomode todos os cavacos no(s) portador(es) da carcaça dentro da incubadora.
   2. Conecte os chips à bomba peristáltica e, em seguida, inspecione todos os conectores para garantir que todos os chips estejam conectados corretamente e que não haja vazamento visível de mídia de cultura celular.
   3. Use o botão Purge na bomba e segure-o por cerca de 15 s ou até que as gotículas do meio de cultura celular apareçam no final da tubulação de saída.
   4. Use o sistema de controle na bomba para definir a vazão de chip de órgão apropriada (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5).

7. Manutenção de cavacos

1. Manutenção de chips de órgãos
   1. Preparar meio de cultura de células frescas para o epitélio e/ou endotélio e realizar as etapas de desgaseificação (conforme descrito anteriormente na etapa 6.2).
   2. Pause a bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente os cavacos da bomba e extraia o(s) portador(es) da carcaça do chip. Transfira os cavacos da incubadora para o BSC e retire o volume de meio deixado nos reservatórios.
   3. Substitua o meio de cultura celular para os reservatórios de entrada superior e inferior por 5 mL de meio de cultura de células fresco e coloque o(s) carcaça(s) de cavaco de volta na incubadora. Conecte os cavacos à bomba peristáltica e reinicie o fluxo.
      NOTA: Recomenda-se usar a função Purge para refrescar rapidamente o meio para o compartimento vascular e reduzir o risco de bolhas de ar.
   4. Repita as etapas 7.1.1-7.1.3 a cada dois dias, conforme Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5.
2. Estabelecimento de interface ar-líquido (ALI)
   1. Pause a bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente os cavacos da bomba e extraia o(s) portador(es) da carcaça do chip. Transfira os cavacos da incubadora para o gabinete de biossegurança e retire o volume de meio deixado no reservatório superior.
   2. Aspirar suavemente todo o meio do canal microfluídico superior e prender o tubo microfluídico curto conectado às entradas superiores usando clipes aglutinantes para reduzir a evaporação do meio e a manutenção do ALI.
   3. Coloque o Chip Open-Top no(s) portador(es) da carcaça de volta para a incubadora e reconecte os chips à bomba peristáltica.
      NOTA: Recomenda-se usar a função Purge para refrescar rapidamente o meio para o compartimento vascular e reduzir o risco de bolhas de ar.
   4. Retome o fluxo ligando a bomba peristáltica.
3. Alongamento (Opcional)
   1. Pause a bomba peristáltica e conecte as portas de vácuo dos chips ao módulo de vácuo usando dois longos tubos microfluídicos por chip.
   2. Use o módulo de vácuo para ajustar o ajuste de alongamento à condição recomendada para cada órgão, conforme especificado nas tabelas de protocolo do órgão: Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 2 para via aérea; e Tabela Suplementar 4 para o intestino.
   3. Inspecione visualmente as conexões do tubo para se certificar de que todos os chips estão conectados corretamente e não há gotículas visíveis de gotejamento médio.
   4. Retome o fluxo ligando a bomba peristáltica.

8. Semeando células endoteliais no compartimento vascular

1. Preparar células e chips para semeadura de células vasculares
   1. Cultivar as células endoteliais tecido-específicas conforme orientação dos profissionais até 80%-90% confluentes. Dissociar as células usando um procedimento enzimático proteolítico (conforme recomendado pelo provedor) e, finalmente, ressuspender as células endoteliais em uma solução de 3 x 10⁶ células/mL.
      NOTA: Para melhores resultados, colher as células endoteliais em baixa passagem (P2-P4) durante a fase de crescimento ativo quando atingirem entre 70%-90% de confluência.
   2. Pause a bomba peristáltica. Transfira os cavacos da incubadora para o BSC, desconecte os cavacos dos reservatórios de mídia e de qualquer tubulação conectada e, em seguida, agrupe os cavacos em placas de Petri separadas.
   3. Atualizar o meio de cultura celular do compartimento epitelial com meio de cultura de células epiteliais fresco. Enxaguar o canal vascular com meio de cultura de células endoteliais fresco duas vezes e, em seguida, aspirar o meio do compartimento vascular.
2. Semeadura de células endoteliais
   1. Semeando o canal inferior (vascular) com 25 μL de suspensão de células endoteliais (3 x 10⁶ células/mL), vire os chips de cabeça para baixo para permitir que as células endoteliais se fixem à superfície superior da câmara microfluídica.
      NOTA: Adicionar 50 μL da suspensão celular por chip (600 μL por 12 chips).
   2. Agrupe as batatas fritas em placas de Petri. Colocá-los novamente na incubadora a 37 °C, 5% CO_2, e deixar as células endoteliais se fixarem por 1 h.
   3. Após 1 h, transfira os cavacos da incubadora para o BSC. Enxaguar o canal vascular com meio de cultura de células endoteliais duas vezes para remover debris celulares.
   4. Repetir os passos 8.2.1-8.2.2 para semear novamente o canal vascular com células endoteliais e colocar os chips planos para facilitar a adesão das células endoteliais à superfície inferior do canal vascular.
3. Reconecte o chip ao fluxo
   1. Preencher o reservatório do meio vascular com o meio de cultura de células vasculares desgaseificado sob o BSC.
   2. Coloque os cavacos de volta dentro da(s) carcaça(s) de cavacos e reconecte os chips aos reservatórios médios de uma extremidade à bomba peristáltica na outra extremidade.
      NOTA: Recomenda-se usar a função Purge para refrescar rapidamente o meio para o compartimento vascular e reduzir o risco de bolhas de ar.
   3. Inspecione visualmente as conexões microfluídicas para se certificar de que todos os chips estão conectados corretamente e não há gotículas visíveis de gotejamento médio. Em seguida, retome o fluxo de fluido ligando a bomba peristáltica.

9. Ensaios de desfechos comuns

1. Desconectar chips para ensaios de endpoint
   1. Pause a bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente os cavacos da bomba e extraia o(s) portador(es) da carcaça do chip. Transfira o(s) portador(es) da carcaça do chip da incubadora para o BSC e libere os chips.
   2. Lavar suavemente a câmara central do Open-Top Chip com o meio de cultura de células epiteliais e o canal vascular com o meio de cultura endotelial duas vezes para remover quaisquer debris celulares.
   3. Remova a tampa do chip de topo aberto para acessar o compartimento apical do chip usando uma pinça.
2. Imunomarcação para microscopia de fluorescência
   1. Proceder com a fixação convencional da amostra, permeabilização e bloqueio.
      OBS: Neste estudo, as amostras foram fixadas em 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% por 1 h seguido de enxágue com PBS, permeabilização em Triton X-100 0,1% por 40 min e bloqueio em albumina de soro bovino a 1% por 1 h.
   2. Incubar os chips com anticorpos primários (Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite. e, em seguida, lavar os compartimentos epitelial e endotelial dos chips com 200 μL de PBS duas vezes. Em seguida, prossiga com os anticorpos secundários apropriados por 2 h.
      NOTA: Diluir os anticorpos primários e os anticorpos secundários em PBS + 1% BSA numa diluição de 1:100 (anticorpo primário) e 1:200 (anticorpo secundário).
3. Imuno-histoquímica
   1. Extrair os equivalentes estromais da câmara principal do Open-Top Chip usando uma pinça, coletá-los em um tubo de 1,5 mL preenchido com formalina tamponada neutra a 10% e incubar por pelo menos 24 horas.
   2. Transfira o estroma fixo equivalente ao processador de tecido e siga as etapas abaixo para obter a desidratação ideal da amostra.
      1. Submergir o hidrogel em etanol 70% por 90 min.
      2. Retire o etanol 70% e submerja o hidrogel em etanol 80% por 90 min.
      3. Retire o etanol 80% e submerja o hidrogel em etanol 95% por 90 min.
      4. Retire o etanol 95% e submerja o hidrogel em etanol 100% por 90 min duas vezes.
      5. Retire o etanol 100% e submerja o hidrogel em uma solução de xileno por 120 min duas vezes.
      6. Remover a solução de xileno e infiltrar os equivalentes estromais processados em cera de parafina por 120 min (~2 h) duas vezes.
   3. Incorpore os equivalentes estromais infiltrados em blocos de parafina seccionados.
   4. Nesse ponto, os equivalentes estromais podem ser seccionados como blocos de parafina em micrótomo e processados de acordo com técnicas histológicas^{convencionais26}.

Results

Micropadronização de superfície
A micropadronização da matriz extracelular (MEC) pode ser usada para replicar a configuração espacial da interface das criptas intestinais. A configuração do Open-Top Chip pode ser modificada para integrar carimbos micropadronizados projetados especificamente para mimetizar a topografia natural da interface epitélio-estroma colônico (Figura 6A,B) e as criptas intestinais em escala micrométrica (Figura 6C-E<...

Discussion

O Open-Top Chip representa uma plataforma capacitadora para investigar a complexa interação celular que ocorre entre endotélio, estroma e epitélio em um microambiente controlado, em tempo real. Essa tecnologia oferece vantagens críticas sobre as culturas organotípicas e organoides convencionais, como a integração de pistas físicas e bioquímicas relevantes para a reconstituição do microambiente tecidual humano, incluindo cisalhamento fluídico (fluxo), estiramento cíclico e reconstrução da topografia da superfície epitelia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x EMEM	Lonza	12-684F	Médio; Agulha Stroma
18 Gauge	MicroGroup	316H18RW	Tubo de aço inoxidável 316 soldado, 18RW Totalmente Duro
Agulha de calibre 19	MicroGroup	316H19RW	Tubo de aço inoxidável 316 soldado, 19RW Totalmente Rígido
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tubo, 0,25 mm, 12/pacote
70% etanol e lenços umedecidos	-	-	Para esterilização de superfícies
8-Bromoadenosina 3′,5′-sal de sódio monofosfato cíclico (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Suplemento médio
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Células Epiteliais das Vias Aéreas	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Folha de alumínio	-	-	-
Células Alveolares	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Anticorpo monoclonal de camundongo [3C9]
Anti-Aquaporina5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Anticorpo monoclonal de coelho [EPR3747]
Anti-Aquaporina5	ABCAM	ab92320	Anticorpo monoclonal de coelho [EPR3747]
Tubulina anti-beta IV	ABCAM	ab11315	Anticorpo monoclonal de camundongo [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Anticorpo monoclonal de camundongo [JC/70A]
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Coelho monoclonal recombinante [AY1E6]
Anti-Citoqueratina 10	ThermoFisher	MA5-13705	Anticorpo monoclonal de camundongo (DE-K10)
Anti-citoqueratina 14	ABCAM	ab7800	Anticorpo monoclonal de camundongo
Anti-E-Caderina	ABCAM	ab1416	Anticorpo monoclonal de camundongo
Anti-filagrina	ThermoFisher	PA5-79267	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-HTI-56	Terraço Biotech	TB-29AHT1-56	Anticorpo monoclonal de camundongo (IgG1)
Anti-HTII-280	Terraço Biotech	TB-27AHT2-280	Anticorpo monoclonal de camundongo (IgM)
Anti-Involucrina	ThermoFisher	MA5-11803	Anticorpo monoclonal de camundongo (SY5)
Anti-Isoformas TA p63-&alfa;, -β, -&gama;	Biolengend	618902	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Anticorpo monoclonal de camundongo [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090;	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-Maduro SP-B	Sete Colinas	WRAB-48604	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Anticorpo monoclonal de camundongo (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Anticorpo monoclonal de camundongo p63 Protein (Dako Omnis)  Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-Podoplanina (AT-1&alfa;)	ABCAM	ab128994	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-Pro + Surfactante Maduro Proteína B	ABCAM	ab40876	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-Surfactante C	Sete Colinas	WRAB-9337	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-Uteroglobina/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Anticorpo monoclonal de camundongo [AY1E6]
Anti-VE-caderina	ABCAM	ab33168	Anticorpo policlonal de coelho
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Anticorpo monoclonal de camundongo [1A12]
Ácido ascórbico	Sigma	A4544
Pipetas de aspiração	Corning / Falcon	357558	2 mL, poliestireno, embalado individualmente
Pontas de aspiração	-	-	Estéril (autoclavado)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) em solução PBS	ThermoFisher	37525	Agente bloqueador
Cloreto de Cálcio	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Colágeno I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Estroma)
Colágeno I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (ECM Vascular)
Colágeno IV	Sigma	C5533
Colágeno-IV	Sigma	C5533-5MG	Colágeno da placenta humana, 5 mg em pó, reconstitui em 1 mg/mL
Fibroblastos colônicos	Cell Biologics	H6231
Células endoteliais microvasculares do cólon	Cell Biologics	H6203
Tubos cônicos	-	-	15 mL e 50 mL  polipropileno, estéril
Reticulador (ER-1)	Emular	10461	5 mg em pó
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dilactato)	ThermoFisher	D3571	Sonda de DNA
Fibroblastos dérmicos	ATCC	PCS-201-010
Células endoteliais microvasculares dérmicas	ATCC	CRL-3243
Dexametasona	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Meio basal para meio ALI
Burro Anti-Rato IgG H& L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Anticorpo secundário Anti-Rato de Burro
Burro Anti-Rato IgG H& L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Anticorpo secundário Anti-Rato de Burro
Burro Anti-Rato IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Anticorpo secundário Anti-Rato de Burro
Burro Anti-Coelho IgG H& L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Anticorpo secundário Anti-Rato de Burro
Burro Anti-Coelho IgG H& L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Anticorpo secundário Anti-Rato de Burro
Burro Anti-Coelho IgG H& L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Anticorpo secundário Anti-Rato de Burro
Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (sem Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) humano, recombinante em E. coli	PromoCell	C-60170	Suplemento médio
Presunto F-12' s	Invitrogen	21700-108	Para ECM vascular
FibriCol	BioMatrix Avançada	5133-20ML	Solução de colágeno-I (10 mg/mL)
Fibronectina	Corning	356008
Fibronectina, Humana, Natural,	Corning	47743-654	fibronectina plasmática humana
Pinças de precisão de ponta fina	Aven	18056USA	Pinças de aço inoxidável de precisão Technik Style 5B-SA
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen
IgG H& do Anti-rato da cabra L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra
Cabra Anti-Rato IgG H & L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115;	Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra
Cabra Anti-Rato IgG H & L (FITC)	ABCAM	ab6785	Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra
Anti-Rato de Cabra IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Anticorpo secundário IgG1 anti-camundongo de cabra
IgM Anti-Rato de Cabra Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Anticorpo secundário IgM anti-camundongo de cabra
Aspirador de pó portátil	Corning	4930	-
Soro HyClone FetalClone II Inativado por Calor (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocitômetro	-	-	-
Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] - Gastrina	Sigma	G9145
Colonoides humanos	Obtidos de ressecções		Obtidos de ressecções clínicas
Proteína recombinante EGF humana	Thermo	PHG0311L
fator de crescimento epitelial humano	Termo
HyClone FetalClone II Serum (EUA)	GE Healthcare	SH30066.02HI	FBS estéril  inativado pelo calor
Sal de sódio de hidrocortisona 21-hemisuccinato	Sigma	H4881
Hidrocortisona	PromoCell	C-64420	Suplemento médio
Balde de gelo	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	; q24-Channel (1 por 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Fator de Crescimento de Queratinócitos (KGF), também conhecido como Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos 7 (FGF-7), humano, recombinante em HEK	PromoCell	C-63821
Queratinócitos	ATCC	PCS-200-010
Laminina	Biolamina	CT521-0501
Laminina, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	laminina recombinante humana 521
Células de Fibroblastos de Pulmão	Celulares Biologics	H6013
de Vida	Fibroblastos de Pulmão	FC-0049
Células endoteliais microvasculares de pulmão	Lonza	CC-2527
Células de músculo liso de	pulmão Tecnologia de Célula de Linha de Vida	FC-0046
Contador manual	-	-	-
Tubo de Transferência Masterflex (TPE)	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Médio 199, sem vermelho de fenol	Thermo
Tubo de microcentrífuga	-	-	1,5 mL, estéril
Microscópio (com câmera)	-	-	Para imagens de campo claro
N2	Sigma	17502001
N-acetilcisteína	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T meio condicionado)	Sigma	N17001
Soro de Cabra Normal	ThermoFisher	50062Z	Solução de bloqueio
O-fosforiletanolamina	Sigma	P0503
(4% em peso/vol)	EMS	15710	Agente de fixação
Penicilina estreptomicina	GIBCO	15140122
Penicilina-estreptomicina	Sigma	P4333	10.000 U/mL; 10 mg/mL
Ponteiras de pipeta	-	-	P20, P200 e P1000  Pipeta estéril e de baixa adesão
	Gilson	F167380	P20, P200 e P1000
Substituição de Soro PluriQ (ou alternativamente substituição de Soro KO)	AMSBIO (ou Thermo)	N/A (ou C1910828010)
Lâminas de vidro de microscópio revestidas com Poli-L-Lisina	Sigma	P0425	Lâminas de vidro
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterona	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	Pág. 36931	Montagem Antidesbotamento com DAPI
Ácido Retinóico	Inibidor de ROCK Sigma	R2625
(Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (meio condicionado HEK293T)	Suplementos Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots	Lonza	CC-4124
SAGMTM Pequenas Vias Aéreas Crescimento de Células Epiteliais Médio BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Suplementos médios
SB2001190	Tocris	1264/10
	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL e 25 mL de baixa endotoxina, estéril
Meio de crescimento de células epiteliais de pequenas vias aéreas (SAGM)	Lonza	CC-4124
Tampão de solvente (ER-2)	Emular	10462	Garrafa de 25 mL
Steriflip-HV	Tubo cônico de filtragem estéril	Millipore	SE1M003M00
Placas de Petri quadradas Sterilin 100 mm	Thermo	103	Estéril, 1 por 6 chips
Frascos T25	-	-	-
Frascos T75	-	-	-
Tri-iodotironina	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Agente de permeabilização
Azul tripano	Sigma	93595	Solução a 0,4%
Solução TrypEE	Sigma	12604013	Solução de desprendimento de células
TWEEN-20	Sigma	Pág.	Agente de permeabilização
Forno de luz UV (frequência de pico 365nm, intensidade de 100 e micro; J/cm2)	VWR	21474-598	UVP, UV de longo alcance, 365 nm 60Hz Modelo CL-1000L
Configuração de vácuo	-	-	Pressão mínima: -70 kPa
Fator de Crescimento Endotelial Vascular 165 (VEGF-165) humano, recombinante em E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Suplemento médio
Fator de Von Willebrand conjugado FITC	ABCAM	ab8822	Anticorpo policlonal de ovelha
Banho-maria (ou contas)	-	-	Definido como 37 &graus; C
Wnt3A (meio condicionado L-Wnt3A)	ATCC	CRL-2647