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Artigo de método

Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G e ensaio de morte espontânea in vitro

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DOI:

10.3791/65132

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12 de maio de 2023

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1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children's Hospital, Dana-Farber /Harvard Cancer Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha a preparação do CLON-G para estender a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias e fornece um procedimento confiável para avaliar a morte de neutrófilos com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência confocal.

Resumo

O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 horas, o que limita a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos com neutrófilos. Nossa pesquisa anterior indicou que múltiplas vias poderiam mediar a morte espontânea de neutrófilos. Um coquetel foi desenvolvido visando simultaneamente essas vias, caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-necroptose inibição mais fator estimulador de colônias de granulócitos (CLON-G), que prolongou a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias sem comprometer significativamente a função dos neutrófilos. Concomitantemente, um protocolo confiável e estável para avaliação e avaliação da morte de neutrófilos também foi desenvolvido. Neste trabalho, mostramos que o CLON-G pode prolongar a vida útil dos neutrófilos in vitro para mais de 5 dias, e exibimos o prolongamento da vida útil dos neutrófilos com FACS e microscopia de fluorescência confocal. Este relato introduz procedimentos para a preparação de CLON-G e mostra um ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos, que pode ser usado para o estudo de neutrófilos e para subsequentemente interrogar a morte de neutrófilos, fornecendo assim um recurso confiável para a comunidade de neutrófilos.

Introdução

Os neutrófilos são conhecidos por compreender um arsenal de grânulos citoplasmáticos abundantes, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, enzimas antimicrobianas e várias organelas que defendem contra micróbios invasores; Além disso, são altamente móveis e são as primeiras células recrutadas para o local da inflamação, ou seja, os neutrófilos são a primeira linha de defesa do sistema imune inato 1,2. A terapia de transfusão de granulócitos tornou-se, portanto, um tratamento clínico promissor para infecções relacionadas à neutropenia para aumentar transitoriamente a imunidade neutrofílica 3,4,5. Descobertas recentes têm mostrado claramente que os neutrófilos também funcionam como efetores multifacetados em muitos cenários fisiopatológicos6. O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 h e, portanto, a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos de neutrófilos são tremendamente difíceis devido às limitações relacionadas à manipulação genética estável e ao armazenamento a longo prazo 7,8,9,10,11 . Existem algumas linhagens celulares que podem apresentar parcialmente algumas funções neutrófilas, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 e células-tronco pluripotentesinduzidas12. Essas linhagens celulares podem alcançar edição gênica e criopreservação; no entanto, eles ainda diferem imensamente dos neutrófilos primários e, portanto, não podem recapitular fielmente as funções dos neutrófilos13. Assim, a maior parte da pesquisa nesse campo ainda se baseia em neutrófilos primários recém-isolados. O campo ainda depende da geração de camundongos knock-out condicionais caros e demorados para investigar funções gênicas específicas em neutrófilos, mas nenhum modelo humano existe atualmente.

Tendo nos empenhado em explorar os processos heterogêneos envolvidos na morte de neutrófilos e as múltiplas vias que regulam esses processos14,15, um novo tratamento denominado CLON-G (caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-inibição da necroptose mais fator estimulador de colônias de granulócitos) foi recentemente relatado 16. O CLON-G consiste em Q-VD-oph (quinolil-valil-O-metilaspartil-[-2,6-difluorofenoxi]-metil cetona), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) e G-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos). A morte espontânea dos neutrófilos é mediada por múltiplas vias, incluindo apoptose, necroptose e piroptose. A Q-VD-OPH inibe a apoptose de neutrófilos como inibidor da pan-caspase, tendo como alvo a caspase 1, caspase 3, caspase 8 e caspase9 17. A necroptose neutrofílica é dependente de uma via de sinalização envolvendo a proteína quinase-1 de interação com o receptor (RIPK1) e a proteína de domínio semelhante ao domínio da linhagem mista de linhagem quinase (MLKL)18. Como um inibidor de RIPK1, Nec-1s inibem a necroptose de neutrófilos. Hsp70 e DFO podem inibir a permeabilização da membrana lisossômica (LMP), o que poderia induzir apoptose neutrofílica19 e piroptose20. As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham papéis vitais na morte de neutrófilos, mediando LMP19 e apoptose21 e inibindo sinais de sobrevivência22. Como um antioxidante que pode reduzir o acúmulo de EROs, NAC retarda a morte de neutrófilos. Como fator de crescimento, o G-CSF ativa sinais de sobrevivência de neutrófilos e inibe a apoptose induzida pela calpaína23,24. Ao visar simultaneamente múltiplas vias de morte espontânea de neutrófilos, o tempo de vida dos neutrófilos pode ser efetivamente estendido para mais de 5 dias sem comprometer sua função. O tratamento com CLON-G amplia as possibilidades de preservação, transporte e manipulação gênica de neutrófilos, o que pode acelerar a pesquisa na comunidade de neutrófilos. Enquanto isso, com base no conhecimento da morte de neutrófilos, os protocolos atualmente aprovados para ensaios de morte celular podem causar danos inesperados aos neutrófilos14, de modo que esses protocolos foram refinados para serem mais apropriados para estudos com neutrófilos. Este relatório fornece protocolos detalhados para cultura de neutrófilos com CLON-G e um ensaio in vitro de morte celular de neutrófilos de camundongos usando citometria de fluxo e imagem de fluorescência. O CLON-G é eficaz em neutrófilos humanos e de camundongos; no entanto, as amostras de camundongos são demonstradas aqui para simplificar esse protocolo. A concentração de NAC é de 1 mM para neutrófilos de camundongos e 10 μM para neutrófilos humanos. A Hsp70 é espécie-específica e, portanto, deve ser utilizada de acordo com a fonte do neutrófilo. Para este protocolo, não importa se os neutrófilos são isolados do sangue periférico ou da medula óssea e como são isolados.

Para o presente estudo, os neutrófilos foram isolados da medula óssea de camundongos para obter neutrófilos suficientes para os experimentos, pois cerca de 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrófilos podem ser obtidos da medula óssea, enquanto apenas 1 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados do sangue periférico de um único camundongo C57BL/6 de 8-12 semanas de idade (de ambos os sexos). A centrifugação por gradiente foi realizada para evitar possíveis danos e ativação a partir da estimulação mecânica da classificação FACS ou MACS.

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Protocolo

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) aprovou e monitorou todos os procedimentos. A Figura 1 apresenta o fluxograma da cultura de neutrófilos com CLON-G e o ensaio de morte in vitro .

1. Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G

NOTA: Todas as operações e materiais mencionados devem ser estéreis. Certifique-se de que todas as soluções estejam bem misturadas e distribuídas uniformemente.

  1. Preservação dos componentes do CLON-G
    1. Dissolver 50 mg de Q-VD-oph (ver Tabela de Materiais) para uma concentração final de 100 mM, adicionando 973,7 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), e pipetar o líquido até que a mistura fique clara. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a -20 °C.
      CUIDADO: O DMSO é um líquido químico nocivo. Use jaleco, óculos e máscara para evitar contato com a pele, contato visual e inalação.
    2. Descongelar a Hsp70 (ver Tabela de Materiais) a 4 °C e girar o conteúdo no frasco para injetáveis. Alíquota 1 μL de Hsp70 por tubo sobre gelo e conservar a -80 °C.
      NOTA: Hsp70 é uma proteína; O armazenamento ultrafrio é necessário para mantê-lo estável. Evite o ciclo de congelamento-descongelamento.
    3. Dissolver 1 mg de DFO (ver Tabela de Materiais) com 7,61 mL RPMI 1640 para obter um estoque de 200 μM. Alíquota 500 μL por tubo e conservar a -20 °C.
    4. Dissolver 0,1 g de NAC (ver Tabela de Materiais) com 2,5 mL de RPMI 1640 em um tubo de centrífuga de 15 mL e ajustar o pH para 7-7,4 com NaOH. Adicione RPMI 1640 a um volume final de 3,06 mL para fazer um estoque NAC de 200 mM. Filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 μm. Alíquota 500 μL por tubo e conserva a -20 °C.
      NOTA: Dissolver NAC nesta alta concentração não é fácil, e vórtice pode ajudar a dissolvê-lo. O vermelho de fenol no RPMI 1640 é uma indicação perfeita do pH; quando o NAC é apenas dissolvido, a cor é amarelada; ajustá-lo até que fique rosado. As soluções de estoque NAC são estáveis por até 1 mês a -20 °C.
    5. Dissolver 10 mg de Nec-1s (ver Tabela de Materiais) para 20 mM com 1,8 ml de DMSO e pipetar a mistura até ficar clara. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a -20 °C. Proteger da luz.
    6. Dissolver 250 μg de G-CSF (ver Tabela de Materiais) para 200 μg/mL com 1,25 mL de RPMI 1640. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a 4 °C.
  2. Preparo de meio de cultura 2x CLON-G
    1. Prepare o meio básico. Adicionar 39,5 mL de RPMI 1640, 10 mL de soro fetal bovino (SFB) e 0,5 mL de pen-strep (antibióticos) a um tubo de 50 mL para fazer RPMI 1640 com 20% de SFB e 1% de PS como meio básico.
      NOTA: Esta alta concentração de FBS é usada para fornecer a cultura prolongada de neutrófilos, que pode ser superior a 5 dias. Se o tempo de cultivo for de 1-2 dias, 10%-15% FBS é suficiente.
    2. Descongele todas as soluções de estoque dos componentes CLON-G no gelo.
    3. Diluir 1 μL de Hsp70 a 20 μM adicionando 606 μL do meio básico. Diluir 1 μL de 200 μg/mL G-CSF para 20 μg/mL adicionando 9 μL do meio básico.
    4. Adicionar 976 μL de meio básico a um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 1 μL de Q-VD-oph (100 mM), 10 μL de DFO (200 μM), 1 μL de Hsp70 (20 μM), 10 μL de NAC (200 mM), 1 μL de Nec-1s (20 mM) e 1 μL de G-CSF (20 μg/mL) para fazer 1 mL de meio 2x CLON-G.
      NOTA: O meio CLON-G 2x deve ser usado imediatamente após o seu preparo. Pode-se armazenar o 2x CLON-G temporariamente a 4 °C. Restos de 20 μM Hsp70 devem ser descartados.
  3. Cultura de neutrófilos
    1. Isolar neutrófilos de camundongos por centrifugação por gradiente seguindo relato anterior25. Ressuspender os neutrófilos isolados de camundongos no meio básico (1 milhão de células/100 μL).
      NOTA: Evite ativar os neutrófilos manuseando-os suavemente. Evite espuma durante todo o processo.
    2. Adicionar 500 μL de 2x meio CLON-G, 400 μL do meio básico e 100 μL da suspensão celular a placas de cultura não cultivadas em tecidos de 24 poços (ver Tabela de Materiais) e pipetar suavemente três a quatro vezes.
      NOTA: Altas concentrações dos componentes no meio 2x CLON-G podem danificar os neutrófilos; evite adicioná-los sem o meio básico. A placa de cultura não cultivada em tecidos é necessária para evitar a adesão de neutrófilos.
    3. Colocar a placa de cultura numa incubadora a 37 °C e a 5 % de CO2 sem problemas.
      NOTA: É desnecessário trocar o meio celular dentro de 7 dias. As concentrações finais da composição do CLON-G são 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s e 10 ng/mL G-CSF.
    4. Colorir os neutrófilos cultivados com o composto Wright Giemsa (ver Tabela de Materiais) e analisar com microscópio de luz (Figura 2A-D). Alternativamente, corar com os anticorpos APC-CD11b e PE-Cy7-Ly6G e analisar com citometria de fluxo (Figura 2E-I), conforme descrito anteriormente26.

2. Ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos

  1. Análise por citometria de fluxo
    1. A cultura isolou neutrófilos a uma densidade de 1 milhão de células/mL no meio básico a 37 °C e 5% CO2. A placa de cultura de 24 poços é não cultivada em tecidos. Adicionar 1 mL de meio celular por poço.
    2. Dissolver 1 g de CaCl 2 com 45 mL de solução salina para produzir 200 mM de CaCl2. Filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
    3. Prepare a mistura de coloração. Adicionar 7 μL de solução salina por amostra a um tubo de 1,5 ml e adicionar 0,4 mg/ml de FITC-Anexina-V, 0,5 mg/ml de iodeto de propídio (PI) e 200 mM de solução de CaCl2 a 1 μL cada por amostra. Misture bem. Use a solução imediatamente após a preparação.
    4. Pipetar suavemente o meio celular cinco a sete vezes para misturar bem, seguido de transferir 100 μL para um tubo de citometria de fluxo nos pontos de tempo desejados.
      OBS: Evite espuma durante todo o processo.
    5. Contas de contagem de vórtices (consulte Tabela de Materiais) para misturá-las bem. Pipetar 10 μL das esferas de contagem bem misturadas para o mesmo tubo de citometria de fluxo que no passo 2.1.4.
    6. Adicionar 10 μL da mistura de coloração preparada (passo 2.1.3) ao tubo de citometria de fluxo. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos longe da luz.
    7. Adicione 100 μL de soro fisiológico ao tubo e misture bem para garantir a distribuição uniforme das esferas e células de contagem.
    8. Realizar análise por citometria de fluxo do meio celular. Colete as células a uma taxa baixa com ~400 eventos/s. Portar as células APC-PE-Cy7- para FSC-A e SSC-A, e portar as células intactas com posições médias FSC-A e SSC-A para o FITC-Annexina-V e PE-PI; a população de Anexina-V−PI− é classificada como células saudáveis.
      NOTA: As seguintes equações determinam o número total de células saudáveis por amostra e a viabilidade dos neutrófilos:
      Número total de células saudáveis por amostra27 = (1.000/número de contas de contagem) × número de população de Anexina-V−PI− × 10
      Viabilidade de neutrófilos = número total de células saudáveis no tempo indicado/número total de células saudáveis no tempo zero
  2. Ensaio de imagem fluorescente
    1. A cultura isolou neutrófilos a uma densidade de 1 milhão de células/mL no meio básico a 37 °C e 5% CO 2 em uma placa confocal com2 mL de meio celular por placa.
      NOTA: Um microscópio de fluorescência confocal tem a melhor qualidade de imagem, mas qualquer microscópio de fluorescência que tenha canais 488/561/DIC é suficiente para suportar este experimento.
    2. Retire o prato suavemente no momento indicado. Adicionar 10 μL cada de 0,4 mg/mL de FITC-Anexina-V, 0,5 mg/mL IP e 200 mM de CaCl2 à placa uniformemente. Manchar à temperatura ambiente por 5 min.
      NOTA: Evite agitar durante todo o processo. Adicione os agentes corantes uniforme e suavemente.
    3. Capturar imagens de fluorescência em 488 (annexin-V)/561 (PI)/canais DIC usando um microscópio confocal de fluorescência com uma lente objetiva de 20x (ver Tabela de Materiais). Defina o tempo de exposição do canal 488 como 500 ms, o canal 561 como 200 ms e o canal DIC como 100 ms. Selecione 5-10 áreas aleatórias para cada placa. Os tipos celulares são definidos em nosso relato publicado anteriormente14.

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Resultados

A morfologia corada por Wright-Giemsa (Figura 2A-D) e os fenótipos FACS (Figura 2E-J) dos neutrófilos tratados com CLON-G não foram afetados. A viabilidade dos neutrófilos tratados com CLON-G em 24 h foi de cerca de 90%+ com base na análise por citometria de fluxo (Figura 3) e nos ensaios de imagem fluorescente (Figura 4). Menor viabili...

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Discussão

Os neutrófilos desempenham papéis vitais na imunidade inata e adaptativa, e sua homeostase é fortemente regulada. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico humano e têm um turnover robusto e rápido. Um adulto saudável pode liberar 1 x 109 neutrófilos/kg diariamente da medula óssea28. A morte dos neutrófilos tornou-se, portanto, um dos enigmas intrigantes desse campo, e muito esforço tem sido dedicado para melhor compreendê-los. Acredita-se que a caspase 29,30...

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Divulgações

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado pelo Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), pelo Fundo de Inovação para Ciências Médicas da Academia Chinesa de Ciências Médicas (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), pelo Fundo Especial de Pesquisa para Universidades Centrais, pela Faculdade de Medicina da União de Pequim (3332022062) e pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (NO. 2021YJ0480).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ m filtro de seringaPall Corporation4612Componentes CLON-G preparados para filtrado.
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLLABSELECTMCT-001-150Consumível de laboratório.
Tubos de centrífuga de 15 mLLABSELECTCT-002-15Consumíveis de laboratório.
Placa de cultura de células de 24 poçosFalcon351147Placa de cultura de neutrófilos.
Tubos de centrífuga de 50 mLLABSELECTCT-002-50Consumíveis de laboratório.
BD LSRIIBDInstrumento para análise de citometria de fluxo da morte de neutrófilos.
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma AldrichC4901Assistente de ligação de Anexina-V à fosfatidilserina.
Microscópio confocalPerkinelmerUltraVIEW VOXInstrumento para análise fluorescente da morte de neutrófilos.
Placa confocalNEST801001-20mmConsumível de laboratório para ensaio de imagem fluorescente.
Contas de contagemThermo FisherC36950Quantificação na análise de citometria de fluxo da morte de neutrófilos.
DFOSigma AldrichD9533Componente do CLON-G. inibidor da LMP.
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma AldrichD2650Solvente para Q-VD-oph e Nec-1s.
Soro bovino fetalGibco10099141CComponente do meio básico de cultura de neutrófilos. Oferta de nutrição.
FITC-Anexina-VBD51-65874XA anexina-V pode se ligar à fosfatidilserina de células envelhecidas. Isso está no canal FITC.
Hsp70Abcamab113187Componente do CLON-G. inibidor da LMP.
NACSigma AldrichA9165Componente do CLON-G. Antioxidante.
Nec-1sEMD Millipore852391-15-2Componente do CLON-G. Inibidor de necroptose.
Solução de penicilina-estreptomicina (PS)Gibco15070063Componente do meio básico de cultura de neutrófilos. Antibióticos para proteger as células da contaminação bacteriana.
Iodeto de propídio (PI)BioLegend421301Para ensaio de morte de neutrófilos. Uma pequena molécula fluorescente que se liga ao DNA  mas não pode atravessar passivamente as células que possuem uma membrana plasmática intacta.
Q-VD-ophSelleck chemS7311Componente do CLON-G. Inibidor da pan-caspase.
Fator estimulador de colônias de granulócitos humanos recombinantes para injeção (célula CHO)(G-CSF)Chugai Pharma ChinaComponente de GRANOCYTEdo CLON-G.  Promover a sobrevivência dos neutrófilos através da via Akt.
Tubos de poliestireno de fundo redondoFalcon100-0102Consumíveis de laboratório para análise de citometria de fluxo.
RPMI1640GibcoC11875500BTComponente do meio básico de cultura de neutrófilos.
salinaLEAGENER00641para análise de citometria de fluxo da morte de neutrófilos.
Hidróxido de sódio (NaOH)FENG CHUAN13-011-00029Ajuste de pH para NAC.
Solução de coloração Wright-GiemsaSolarbioG1020Coloração de citospin de neutrófilos.
Solução

Referências

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