Sistema de Gravação Eletroencefalográfica de Baixo Custo Combinado com uma Bobina de Tamanho Milimétrico para Estimular Transcranialmente o Cérebro de Camundongos In Vivo

A estimulação magnética transcraniana (EMT) é uma ferramenta promissora para a ciência do cérebro humano, aplicação clínica e pesquisa de modelos animais devido à sua não/baixa invasividade. Durante o estágio inicial das aplicações da EMT, a medida do efeito cortical em resposta à EMT de pulso único e pareado em humanos e animais foi restrita ao córtex motor; a produção facilmente mensurável limitou-se aos potenciais evocados motores e aos potenciais mioelétricos induzidos envolvendo o córtex motor ^1,2. Para expandir as regiões cerebrais que podem ser medidas pela modulação da EMT, o registro eletroencefalográfico (EEG) foi integrado à EMT de pulso único e pareado como um método útil para examinar diretamente a excitabilidade, conectividade e dinâmica espaço-temporal de áreas em todo o cérebro ^3,4,5. Assim, a aplicação simultânea do registro de EMT e EEG (EMT-EEG) ao cérebro tem sido usada para sondar várias áreas corticais superficiais cerebrais de humanos e animais para investigar circuitos neurais intracorticais (ver Tremblay et ^al.6). Além disso, os sistemas TMS-EEG podem ser usados para examinar características espaço-temporais corticais adicionais, incluindo a propagação de sinais para outras áreas corticais e a geração de atividade oscilatória ^7,8.

No entanto, o mecanismo de ação da EMT no cérebro permanece especulativo devido à não invasividade da EMT, o que limita nosso conhecimento de como o cérebro funciona durante as aplicações da EMT. Portanto, estudos translacionais invasivos em animais desde roedores até humanos são de fundamental importância para a compreensão do mecanismo dos efeitos da EMT sobre os circuitos neurais e sua atividade. Em particular, para experimentos combinados de EMT-EEG em animais, um sistema de estimulação e medição simultâneas não foi desenvolvido intensivamente para pequenos animais. Portanto, experimentalistas são obrigados a construir tal sistema por tentativa e erro de acordo com suas exigências experimentais específicas. Além disso, modelos de camundongos são úteis entre outros modelos de espécies animais in vivo , pois muitas linhagens de camundongos transgênicos e isolados de cepas estão disponíveis como recursos biológicos. Assim, um método conveniente para construir um sistema de medição combinado EMT-EEG para camundongos seria desejável para muitos pesquisadores da neurociência.

Este estudo propõe um método combinado EMT-EEG que pode ser aplicado para estimulação e gravação simultâneas do cérebro de camundongos, que é o principal tipo de animal transgênico usado em pesquisas, e que pode ser facilmente construído em laboratórios típicos de neurociência. Primeiro, um sistema de registro de EEG de baixo custo é descrito usando eletrodos de parafuso convencionais e um substrato flexível para atribuir de forma reprodutível uma posição de arranjo de eletrodos em cada experimento. Em segundo lugar, um sistema de estimulação magnética é construído usando uma bobina de tamanho milimétrico, que pode ser facilmente feita sob medida em laboratórios típicos. Terceiro, o sistema combinado EMT-EEG registra a atividade neural em resposta à estimulação sonora e magnética. O método apresentado neste estudo pode revelar os mecanismos que geram distúrbios específicos em pequenos animais, e os resultados obtidos nos modelos animais podem ser traduzidos para a compreensão dos distúrbios humanos correspondentes.

No presente estudo, todos os experimentos com animais foram realizados seguindo o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e com aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Hokkaido. Camundongos C57BL/6J, dois machos e três fêmeas, com 8 a 10 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Este é um procedimento terminal. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Projeto e construção de matriz bidimensional flexível

1. Prepare o número necessário de eletrodos de parafuso miniatura (inox, SUS XM7; ver Tabela de Materiais) com as seguintes propriedades estruturais para uso como eletrodos de registro e referência de EEG: diâmetro nominal, comprimento do colo e diâmetro da cabeça de 0,6 mm, 1,5 mm e 1,1 mm, respectivamente (Figura 1A).
   EMENTA: No presente estudo, foram utilizados 16 eletrodos de parafusos em miniatura.
2. Prepare um plano de um diagrama de circuito impresso em um substrato flexível seguindo as etapas abaixo.
   1. Crie um padrão de almofada de eletrodo bidimensional (2D) em um substrato flexível (tamanho total, 41,2 mm × 19,9 mm; consulte Tabela de Materiais) para que os eletrodos de parafuso sejam lidos. Projetar o arranjo de eletrodos 2D. A Figura 1B mostra os arranjos específicos utilizados neste estudo e as coordenadas relativas a partir de um ponto basal (cruzado marcado na origem [0, 0]).
      OBS: No presente estudo, para registrar a atividade neural no córtex auditivo dentro dos lobos temporais, a colocação dos eletrodos no sentido látero-medial (horizontal) foi maior do que no sentido rostral-caudal (vertical) (Figura 1B).
   2. Certifique-se de que, para os eletrodos de registro de EEG, cada almofada de cobre (ver Tabela de Materiais) no substrato flexível tenha uma forma de anel com um diâmetro externo de 1,3 mm e um diâmetro interno de 0,8 mm (Figura 1C, à esquerda). Faça um pequeno orifício (0,8 mm de diâmetro) no centro para que cada eletrodo de parafuso passe pelo substrato. Para os eletrodos de referência, cada almofada de cobre deve ter uma forma quadrada com um comprimento lateral de 1,4 mm; da mesma forma, faça um pequeno orifício (0,8 mm de diâmetro) no centro para que cada parafuso passe através da almofada quadrada sobre o substrato (Figura 1C, à direita).
   3. Em seguida, para soldar um conector de montagem em superfície (Figura 1D, à esquerda), projete almofadas de leitura (matriz 2D) que levam ao conector (Figura 1D, à direita). Por exemplo, use um conector com 2 × 10 pinos e um passo de 1,27 mm entre os pinos adjacentes (Figura 1D, à direita).
   4. Conecte as almofadas de eletrodo de parafuso e as almofadas conectoras usando a camada superficial e posterior com largura de linha de 0,03 mm e intervalo de linha de 0,03 mm (linhas finas na Figura 1E).
   5. Além disso, para conectar os canais de referência e terra ao amplificador, conecte as almofadas de eletrodos para os eletrodos de referência e terra à parte isolada na parte externa da matriz flexível 2D (dois retângulos verticais indicados por "G" e "HR" na parte inferior da Figura 1E). Depois de determinar os canais de referência e de aterramento, lembre-se de soldar as almofadas dos eléctrodos aos conectores correspondentes (ver passo 2.1).
   6. Projete corretamente uma área exposta que não seja coberta com uma camada de proteção (camada de poliimida). Exponha as almofadas conectoras na camada superficial enquanto expõe as almofadas de eletrodo de parafuso nas camadas superficial e posterior. Todo o design do eletrodo, os tamanhos e a matriz 2D flexível fabricada são ilustrados na Figura 1E, e a imagem de um substrato fabricado é mostrada na Figura 1F.
   7. Na parte superior do eletrodo (parte da cabeça) da matriz flexível 2D, certifique-se de que a estrutura de três camadas de cima para baixo seja composta do seguinte (espessura total de 49,0 μm): uma camada superior de cobre (12,0 μm de espessura), uma camada média de poliimida de núcleo (25,0 μm) e uma camada inferior de cobre (12,0 μm) (Figura 1G, acima).
   8. Gravar as camadas de cobre na superfície superior e inferior do substrato, por exemplo, usando corrosão úmida e a técnica de fabricação padrão⁹.
   9. Na parte inferior da almofada quadrada (parte conectora) da matriz flexível 2D, certifique-se de que a estrutura de seis camadas seja composta por três camadas, incluindo uma camada superior de cobre (12,0 μm de espessura), uma camada de poliimida de núcleo médio (25,0 μm) e uma camada inferior de cobre (12,0 μm), que são prensadas por camadas protetoras de poliimida, incluindo camadas superior e inferior (ambas de 12,5 μm). Fixe uma placa de poliimida de 2 mm na parte inferior como material de reforço (Figura 1G, fundo).
      NOTA: Para manter a flexibilidade, a placa de poliimida de reforço não é montada na parte do pescoço da matriz flexível 2D entre a cabeça e a parte do conector.
   10. Da mesma forma, na parte do conector, grave as camadas de cobre e poliimida protetora na parte superior usando corrosão úmida e a técnica de fabricação padrão.
       NOTA: O peso total do dispositivo de matriz 2D fabricado e flexível, incluindo o conector, é de 0,84 g. Depois de projetar um layout para uma matriz 2D flexível, os substratos de um fabricante comercial (consulte Tabela de Materiais) às vezes são recomendados por conveniência.

Figura 1: Partes componentes da matriz bidimensional flexível (2D) para registro eletroencefalográfico (EEG) e o dispositivo fabricado, incluindo a matriz. (A) O eletrodo de parafuso em miniatura que está embutido no crânio do rato. (B) As almofadas de eletrodos projetadas para medir a atividade cerebral (círculos verdes) e o canal de referência (quadrado no canto inferior direito). As coordenadas relativas das almofadas de eletrodos a partir de um ponto de referência (marca transversal) na origem (0, 0) são mostradas; O tamanho em milímetros é ilustrado entre parênteses. As coordenadas centrais das almofadas dos eletrodos são simétricas em relação ao eixo vertical que passa pela marca transversal. (C) As almofadas de eletrodos e furos de perfuração para um eletrodo de gravação (esquerda) e um eletrodo de referência (direita) são ilustrados. (D) Um conector de montagem na superfície (2 × 10 pinos) usado para a matriz 2D flexível (esquerda) e o padrão e tamanho das almofadas projetadas no substrato (direita). (E) Planta projetada com o tamanho de cada peça em milímetros. (F) Imagem de um substrato fabricado indicado pela planta em E. (G) A estrutura de camadas da matriz 2D flexível (partes do cabeçote e do conector). As vistas superior e lateral das almofadas de eletrodos de parafuso (superior) e das almofadas de leitura (inferior) são ilustradas. A cabeça e as partes do conector são compostas por uma estrutura de três camadas (superior) e uma estrutura de seis camadas (inferior), respectivamente. Além disso, a parte do pescoço é composta por uma estrutura de cinco camadas; Uma camada protetora de poliimida é montada na superfície superior e traseira, e a placa de poliimida de reforço não é montada na parte do pescoço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Construção de adaptadores e mapeamento de canais

1. Execute a construção do adaptador seguindo as etapas abaixo.
   1. Espalhe o fluxo de solda no conector de 2 × 10 pinos, montado na superfície (Figura 1D, esquerda) e as almofadas conectoras da matriz 2D (Figura 1D, direita) (consulte Tabela de Materiais) no substrato flexível.
   2. Solde o conector de montagem em superfície de 2 × 10 pinos nas almofadas conectoras. Em particular, confirme a conexão entre as duas pás na parte inferior da matriz 2D e os dois pinos conectores usados como canais de referência e terra (Figura 2A).
   3. Conecte cada uma das duas pás a fios de chumbo individuais para alimentar os sinais de linha de base para um ponto externo (por exemplo, um ponto terra conectado ao canal de terra do sistema de medição; Figura 2A).
      NOTA: Neste estudo, no entanto, uma das almofadas circulares com eletrodos de parafuso foi usada como eletrodo de referência em vez de um eletrodo quadrado na parte conectora.
   4. Após a solda, cubra os pontos de solda com resina epóxi (ver Tabela de Materiais) para proteger os pontos expostos e evitar curtos-circuitos.
2. Fixe o cabo conector e o amplificador de cabeça seguindo as etapas abaixo.
   1. Prepare um conector de deslocamento de isolamento (IDC) com 2 × 10 pinos e um passo de 1,27 mm (Figura 2B, canto superior esquerdo) e um cabo de fita plano de 20 pinos (consulte Tabela de Materiais) com passo de 0,635 mm (Figura 2B, canto inferior esquerdo). Corte o cabo de fita plana no comprimento necessário (por exemplo, 40 cm).
   2. Crimpe o IDC e uma extremidade do cabo de fita plana usando uma ferramenta de crimpagem IDC (Figura 2B, canto superior direito) (consulte Tabela de materiais).
   3. Separe cada linha da outra extremidade do cabo até aproximadamente 15 mm da extremidade da ponta usando um cortador. Retire o isolamento a 3 mm da extremidade da ponta.
   4. Conecte o IDC frisado ao cabo de fita plana e o conector de 2 × 10 pinos soldado ao substrato flexível (Figura 2C).
   5. Confirme a correspondência entre o eletrodo de gravação e a linha separada do cabo. Certifique-se de que cada linha usada não produza um erro de conexão incorreto.
   6. Soldar os fios de cobre expostos das linhas individuais correspondentes à saída de cada eletrodo para o conector de 20 pinos (passo de 1,25 mm) do sistema de medição, incluindo o amplificador principal (Figura 2B, canto inferior direito).
   7. Após a solda, confirme a condução entre as almofadas de eletrodo de parafuso e os pinos do conector usando um equipamento de teste (por exemplo, um medidor LCR; consulte Tabela de Materiais).
   8. Cubra os pontos de solda usando resina epóxi e fita de proteção para protegê-los de danos e evitar o contato com outras linhas de sinal.
   9. Usando resina epóxi, adera uma haste fina de aço inoxidável (diâmetro: 1,1-1,2 mm; comprimento: 100 mm) na parte traseira da parte do conector da matriz 2D no substrato flexível.
      NOTA: Esta haste de aço inoxidável pode ser agarrada por um suporte de micromanipulador durante os experimentos (Figura 2C).
   10. Por fim, confirme o mapeamento entre os eletrodos de parafuso e os canais de saída de sinal (Figura 2D).

Figura 2: Construção do adaptador para um arranjo de eletrodos bidimensional (2D) no substrato flexível e mapeamento do canal de gravação. (A) Na parte conectora, os canais de referência e terra são conectados às almofadas de eletrodos inferiores com fios de chumbo. Se os canais de referência e de aterramento forem determinados com antecedência, os canais devem ser conectados às almofadas de eletrodos inferiores correspondentes durante a fase de projeto. Nesses casos, a soldagem de fios de chumbo para os canais e almofadas de eletrodos é desnecessária. (B) Os conectores de deslocamento de isolamento (canto superior esquerdo) são cravados em uma extremidade do cabo plano (canto inferior esquerdo) para conectar o conector do amplificador de medição (canto superior direito). Todas as linhas que correspondem aos canais a serem utilizados são soldadas aos conectores verdes (canto inferior direito). Neste caso, como cada conector verde conectado ao amplificador de cabeça é atribuído para uma medição de oito canais, pelo menos dois conectores são necessários para registrar sinais de atividade cerebral de 16 canais. Os pontos soldados são cobertos com resina epóxi e fita de proteção para evitar o contato com outras linhas de sinal. (C) O conector e o cabo fabricado são colocados na superfície do substrato flexível da matriz 2D. A haste fina de aço inoxidável é fixada na parte traseira do substrato flexível. (D) São mostradas as localizações espaciais dos canais de gravação na superfície do cérebro do rato e os mapas dos canais para cada ponto do sistema de medição. Neste caso, existem 16 canais de gravação com eletrodos de parafuso (círculos vermelhos), embora o número total de locais de registro possíveis seja de 32. Os outros 16 canais sem gravação também são mostrados como círculos verdes na superfície do cérebro. No gráfico de mapeamento, "G" e "R" indicam os canais projetados para eletrodos de terra e de referência, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cirurgia de animais

1. Preparar o ambiente cirúrgico estéril.
   1. Usar equipamentos de proteção, como luvas de látex, durante todo o procedimento experimental envolvendo animais.
   2. Esterilizar o aparelho estereotáxico e os instrumentos cirúrgicos (ver Tabela de Materiais).
   3. Após esterilizar os instrumentos cirúrgicos, lave-os com soro fisiológico estéril.
2. Anestesiar os animais.
   1. Meça o peso do rato antes da cirurgia. Administrar sulfato de atropina (0,04 mg/kg; ver Tabela de Materiais) por injeção intraperitoneal.
   2. Anestesiar o camundongo através de uma injeção intraperitoneal de uma mistura de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4,0 mg/kg) e butorfanol (5,0 mg/kg).
   3. Confirme a profundidade do anestésico pelo nível de resposta através do pinçamento do dedo do pé.
      NOTA: A anestesia se desgastará após aproximadamente 40 min. Se o rato responder a uma pinça do dedo do pé, administrar a mesma dose da mistura anestésica através de uma injeção intraperitoneal.
3. Pré-preparação para a cirurgia de implante de eletrodos.
   1. Corte os bigodes do rato para evitar a sensação háptica.
   2. Lubrifique ambos os olhos com uma pomada oftálmica para evitar o ressecamento. Feche as pálpebras para obstruir o sentido da visão e mantenha o fechamento aderindo as pálpebras superior e inferior com fita adesiva.
   3. Raspe o cabelo na cabeça do mouse com cortadores elétricos. Insira um termómetro no recto e mantenha a temperatura corporal a 37 °C utilizando uma almofada de aquecimento.
   4. Administrar cloridrato de lidocaína como anestésico local tópico na parte do couro cabeludo de camundongo que será incisada.
   5. Incisar o couro cabeludo de camundongo com bisturi ou tesoura cirúrgica no sentido rostral-caudal (tamanho da área: 7 × 10 mm²).
   6. Aperte o couro cabeludo perto da parte incisada com uma pinça e levante. Remova a membrana visível no crânio usando um bisturi ou tesoura cirúrgica. Não quebre os vasos sanguíneos ao redor dos olhos durante a operação.
   7. Segure a pele perto de ambos os centros da linha de incisão do couro cabeludo com pinças e amplie a parte incisada para expor amplamente o topo do crânio.
   8. Confirme a remoção completa de todas as membranas na superfície do crânio e do tecido ao redor do lambda com tesoura cirúrgica.
   9. Molhe a superfície do crânio com soro fisiológico para aumentar a visibilidade da superfície cerebral sob o crânio e localizar o seio transverso.
      NOTA: Ao implantar eletrodos de parafuso no crânio, lembre-se de não incorporá-los acima e no seio transverso.

4. Implantação de eletrodos

1. Conecte a haste de aço inoxidável montada ao arranjo de eletrodos 2D na parte traseira do substrato flexível a um micromanipulador. Coloque o substrato flexível sobre o crânio.
2. Ajuste a localização dos canais (Chs) 3 e 14 (Figura 2D) na matriz para caber dentro do colículo inferior.
   NOTA: O colículo inferior localiza-se ao longo do seio transverso. Recomendamos confirmar a localização do colículo inferior usando um atlas cerebral de camundongo com antecedência.
3. Desenhe pequenos círculos nos locais das Chs 3, 8, 9 e 14 (Figura 2D) no crânio com um marcador permanente para usar como pontos de referência de mira.
4. Secar a superfície do crânio para aumentar a aderência ao cimento dentário e isolar eletricamente o arranjo de eletrodos 2D no substrato flexível do crânio do camundongo.
5. Aplicar cimento dentário (aproximadamente 1 mm de espessura; ver Tabela de Materiais) na superfície do crânio. Após a aplicação do cimento dentário, aguarde aproximadamente 30 min para que ele cicatrize.
6. Alinhar o substrato flexível de acordo com as pequenas marcas circulares na superfície do crânio.
7. Alinhe a ponta de uma broca odontológica a cada orifício da almofada do eletrodo no substrato flexível. Perfure cuidadosamente o crânio através de cada um dos orifícios da almofada do eletrodo.
8. Rosqueie cada um dos eletrodos de parafuso em miniatura através dos orifícios perfurados no crânio usando uma chave de fenda dedicada para parafusos em miniatura.
9. Crimpar a cabeça do eletrodo de parafuso e a almofada do eletrodo com força. Finalmente, meça a condutância entre cada eletrodo de parafuso e o conector com um equipamento de teste (por exemplo, um medidor LCR) para confirmar a condutividade elétrica.

5. Projeto e construção de bobinas pequenas

1. Projete um disco em forma de rosquinha (consulte Arquivo de codificação suplementar 1) com um orifício no centro (diâmetro interno: 2 mm; diâmetro externo: 7 mm; espessura: 1 mm) usando software de projeto auxiliado por computador (CAD) (consulte Tabela de materiais).
2. Usando uma impressora 3D, imprima dois discos (Figura 3A, à esquerda) feitos de material não resistente ao calor (por exemplo, filamento de ácido polilático); Nem sempre é necessário material não resistente ao calor (veja abaixo).
3. Corte uma haste de permalloy-45 (diâmetro: 2 mm; ver Tabela de Materiais) para formar um eixo curto (comprimento: 60 mm).
4. Insira o eixo em cada orifício dos dois discos impressos em 3D (Figura 3A, à direita). Coloque um disco na extremidade do eixo e o outro a 11 mm da extremidade, resultando em uma distância de 10 mm entre os dois discos. Cole os discos com cola instantânea (consulte Tabela de Materiais).
5. Conecte a extremidade do eixo sem disco a um driver de impacto (Figura 3B). Conecte um pequeno ímã ao eixo permalloy-45. Coloque um sensor de efeito hall perto do ímã a 5 mm do eixo. Conecte o sensor de efeito hall a um sistema de aquisição de dados (DAQ; consulte Tabela de Materiais).
6. Para contar o número de voltas, prepare um programa de computador (consulte Tabela de Materiais) que analise os sinais de saída do sensor de efeito hall através do sistema DAQ.
7. Conecte um fio fino de cobre (diâmetro: 0,16 mm) ao eixo e adera à extremidade superior do fio com cola instantânea.
8. Usando o driver de impacto, enrole o fio de cobre por 1.000 voltas entre os dois discos. Embora a velocidade de rotação seja arbitrária, aproximadamente 5 rotações por segundo são normalmente usadas. Em seguida, adera ao fio da ferida com cola instantânea.
9. Retire os dois discos do eixo. Se os discos estiverem fortemente aderidos ao eixo, derreta os discos usando uma pistola de calor.
10. Cubra a bobina com resina epóxi para isolar e fixar a superfície. Em seguida, corte a porção do eixo não enrolado como excesso.
11. Certifique-se de que a bobina obtida tenha altura de 10 mm e diâmetro de 6 mm (Figura 3B, à esquerda). Para a manipulação da bobina, construa um suporte de bobina (Figura 3C, à direita) ou cole uma haste de aço inoxidável à bobina (não mostrado aqui).
12. Meça a resistência e a indutância da bobina usando um medidor LCR (consulte a Tabela de Materiais). Por exemplo, a bobina usada aqui tinha uma resistência à corrente contínua (CC) de 18,3 Ω e uma indutância de 7,9 mH na entrada de corrente alternada (CA) de 1 kHz. As propriedades da CA (resistência e indutância) são mostradas na Figura 3D.
13. Use um gerador de funções para aplicar uma onda quadrada bipolar à bobina. A amplitude típica da tensão de entrada é de 20 V através de uma fonte de alimentação bipolar com um ganho de 10x, seguindo uma saída de gerador de 2 V. A forma de onda resultante é uma onda quadrada bipolar com uma amplitude aproximada de 20 V (ou seja, uma tensão pico-a-pico de 40 V) (Figura 3E).
14. Meça a densidade de fluxo magnético usando o sensor de efeito hall e o sistema DAQ. Neste caso, por exemplo, a densidade de fluxo magnético (B) da bobina foi de 113,6 ±2,5 mT (média ± MEV) quando o fundo da bobina estava em contato com o sensor de efeito hall (Figura 3F).

Figura 3: Bobina pequena para estimulação magnética. (A) Disco impresso tridimensional (3D) (esquerda). Dois discos idênticos estão aderidos ao eixo permalloy-45; um está no final do eixo, e o outro está a 10 mm de distância (direita). (B) Configuração para enrolamento da bobina. O eixo de 60 mm com os dois discos é acoplado a um driver de impacto. Um sensor de efeito hall é colocado perto do pequeno ímã conectado ao eixo. O fio de cobre é enrolado entre os dois discos. (C) Bobina construída. A bobina tem 10 mm de altura, 6 mm de diâmetro e 1.000 voltas de fio de cobre. O lado direito da figura mostra a bobina manipulada por um suporte de bobina impresso em 3D. (D) Propriedades AC da bobina registradas por um medidor LCR: (superior) resistência versus frequência de entrada senoidal; (inferior) indutância versus frequência de entrada. Uma bobina típica tem uma resistência e indutância de 21,6 e 7,9 mH, respectivamente, a 1 kHz de entrada AC. (E) Forma de onda retangular bifásica usada como entrada da bobina registrada por um osciloscópio. (F) Relação entre a densidade de fluxo magnético e a distância entre uma bobina construída e o sensor de efeito hall. A densidade de fluxo magnético foi registrada por cinco diferentes sensores de efeito hall, uma vez para cada sensor. A média de cinco medidas é plotada, e as barras de erro representam os erros padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Sistema e procedimento de gravação de sinais

1. Conecte a matriz 2D flexível ao sistema de gravação (consulte Tabela de Materiais) com o cabo de fita plana.
2. Fixe a haste de aço inoxidável montada na bobina a um micromanipulador (ver Tabela de Materiais).
3. Coloque a bobina acima do bregma e ajuste a posição no sentido caudal para localizar o ponto focal acima do colículo inferior. O ponto focal do campo elétrico emissor é a linha média da área da ferida na superfície inferior da bobina (ou seja, 1 mm da borda para o centro).
4. Prepare um sistema de estimulação composto por uma fonte de alimentação bipolar e um gerador de funções (ver Tabela de Materiais) e conecte a bobina ao sistema.
5. Conecte um cabo entre o terminal de entrada do gerador de função e o terminal de saída do sistema DAQ para aplicar sinais de gatilho ao gerador de função do sistema DAQ. Prepare um programa de computador apropriado para sinais de gatilho para iniciar estímulos. Além disso, conecte o sistema DAQ ao sistema de gravação para salvar os tempos de estimulação como carimbos de data/hora.
6. Inicie o processo de aquisição do sistema de gravação.
   NOTA: Se o sistema de gravação estiver captando ruído, encontre a fonte do ruído e reduza-o.
7. Testar a estimulação magnética acionando o sistema de estimulação.
   NOTA: Se o ruído produzido pela estimulação magnética saturar a faixa de medição, ajuste a faixa corretamente. Além disso, confirme se o sistema de gravação salva os carimbos de data/hora de estimulação corretamente.
8. Comece a gravar os dados de resposta e inicie as sessões de estimulação. Pare a gravação quando cada sessão de estimulação estiver concluída. Salve todos os dados gravados para análise subsequente.
   NOTA: Para realizar todas as condições experimentais com cinco intensidades magnéticas diferentes, por exemplo, o tempo total necessário para todas as sessões foi de cerca de 75 min. O desfecho foi geralmente determinado após o término de todas as sessões de gravação. No entanto, quando os animais apresentavam sinais clínicos como tosse, dificuldade para respirar e respiração ofegante, a sessão experimental foi imediatamente encerrada. Para a eutanásia, a decapitação foi realizada com tesoura cortante e limpa, enquanto os animais estavam sob anestesia.

7. Análise dos dados

1. Filtre o sinal de banda larga (bruto) usando um filtro passa-baixa com uma frequência de corte de 200 Hz.
2. Colete formas de onda filtradas durante uma janela de tempo em torno de cada carimbo de data/hora de estimulação. Média das formas de onda para obtenção das formas de onda do potencial relacionado a eventos (ERP) (Figura 4 e Figura 5).

Os dados de EEG de amostra registrados em camundongos C57BL/6J anestesiados com o substrato flexível combinado com os eletrodos de parafuso são apresentados a seguir.

Como exemplo típico, as médias das formas de onda do EEG geradas em resposta à estimulação sonora (tone-burst de 8 kHz, nível de pressão sonora [NPS] de 80 dB) são mostradas para 60 tentativas com estímulos idênticos (Figura 4A). Um esquema de mapeamento do canal de registro também é apresentado no meio da Figura 4A. As respostas das Chs 5, 7, 10 e 12 são registradas em áreas próximas ao córtex auditivo em ambos os lobos temporais. Nas formas de onda individuais do EEG dos canais localizados ao redor das áreas auditivas (colículo inferior e córtex auditivo), as respostas excludentes dos artefatos de estimulação foram primeiramente negativas imediatamente após o início da estimulação sonora (por exemplo, Chs 3 e 10); as amplitudes dos picos foram de 45,6 ± 4,0 μV e 25,6 ± 1,5 μV, respectivamente. As respostas foram subsequentemente positivas, indo até certo ponto acima da linha de base (Figura 4B,C) e oscilando durante o amortecimento. Em contraste, as respostas de outros canais foram quase independentes do início da estimulação, embora algumas formas de onda do canal tenham mostrado respostas semelhantes.

Figura 4: Formas de onda do potencial sonoro relacionado a eventos (ERP) em 16 locais no cérebro de camundongos . (A) Em resposta à estimulação sonora (8 kHz tone-burst, 80 dB NPS) aplicada a um camundongo anestesiado, formas de onda ERP de 16 canais são ilustradas. O esquema de um cérebro de camundongo é mostrado no centro, e os 16 locais de gravação (círculos vermelhos) na superfície do cérebro de camundongo são indicados por números de canal. Neste caso, são utilizados 16 canais de gravação; os outros 16 canais não gravados são mostrados como círculos verdes. (B) Visões expandidas das formas de onda do ERP para o Ch 3. (C) Visões expandidas das formas de onda do ERP para Ch 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Da mesma forma, as formas de onda médias dos registros de EEG em resposta à estimulação magnética curta (V em = 60 Vpp) da área próxima ao colículo inferior direito são mostradas para 60 tentativas com estímulos idênticos na Figura 5A. Um esquema de mapeamento do canal de registro também é apresentado no meio da Figura 5A. Como a bobina de estimulação estava localizada próxima à área de Ch 14, o artefato de estimulação foi maior nesse canal. No entanto, artefatos de estimulação relativamente grandes foram observados para a maioria dos canais imediatamente após o início da estimulação, indicando que a estimulação magnética influenciou todos os locais de registro. Como as respostas das Chs 5, 7, 10 e 12 foram registradas em áreas próximas ao córtex auditivo em ambos os lobos temporais, as formas de onda individuais do EEG, excluindo os artefatos de estimulação, foram primeiramente negativas e depois positivas até certo ponto, dependendo das posições dos canais (Figura 5A-C). Próximo às áreas auditivas, os tempos de resposta induzidos pela estimulação magnética foram diferentes daqueles induzidos pela estimulação sonora. Para as Chs 3 e 10, por exemplo, as respostas foram negativas imediatamente após o início da estimulação sonora, embora as amplitudes de pico tenham sido de 58,8 ± 4,0 μV e 28,2 ± 2,0 μV, respectivamente. Além disso, com o aumento das intensidades de estimulação magnética, as amplitudes de pico das respostas direcionadas para Ch 10 foram aumentadas (Figura 5D), sugerindo que a estimulação magnética afetou as respostas neurais evocadas.

Figura 5: Formas de onda de potencial relacionado a eventos (ERP) impulsionadas pela estimulação magnética transcraniana (EMT) em 16 locais no cérebro de camundongos. (A) As formas de onda ERP de 16 canais em resposta à EMT (V em = 60 Vpp) aplicadas a um camundongo anestesiado são ilustradas. Um esquema de um cérebro de camundongo é mostrado no centro, e os 16 locais de gravação (círculos vermelhos) na superfície do cérebro de camundongo são indicados pelos números de canal. (B) Visões expandidas das formas de onda do ERP para o Ch 3. (C) Visões expandidas das formas de onda do ERP para Ch 10. (D) Resumo para as amplitudes dos ERPs do Ch. 10 evocados por diferentes intensidades magnéticas (tensão de entrada). Para a análise estatística, utiliza-se uma ANOVA para comparações múltiplas seguida de um teste post-hoc de Tukey-Kramer. * e *** representam p < 0,05 e p < 0,001, respectivamente. O número de testes para uma sessão é de 60 vezes para cada condição de animais individuais. As estatísticas são calculadas para as amostras obtidas de dois animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este método também pode ser facilmente estendido a um pequeno animal acordado que é conectado com cabos amarrados através de um adaptador comum e fixado com um dispositivo TMS à cabeça durante a gravação (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).

Figura suplementar 1: Fixação da bobina de estimulação presa a um crânio de camundongo. (A) Para um rato acordado, é mostrada uma bobina de estimulação fixada com o dispositivo fixo ao crânio do rato. (B) Os potenciais relacionados a eventos (ERPs) do camundongo acordado foram registrados em uma caixa de acril, onde o camundongo poderia se mover dentro da caixa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Formas de onda de ERPs acionados por som e estimulação magnética transcraniana (EMT) em 16 locais do cérebro de um camundongo acordado. (A) Em resposta à estimulação sonora (8 kHz tone-burst, 80 dB NPS) aplicada a um camundongo acordado em uma caixa de acrílico (Figura 1B Suplementar), formas de onda ERP de 16 canais são ilustradas. O esquema de um cérebro de camundongo é mostrado no centro, e os 16 locais de gravação (círculos vermelhos) na superfície do cérebro de camundongo são indicados por números de canal. Neste caso, são utilizados 16 canais de gravação; os outros 16 canais não gravados são mostrados como círculos verdes. (B) Da mesma forma, formas de onda ERP de 16 canais em resposta à EMT (Vem = 60 Vpp) aplicadas ao mesmo camundongo acordado são ilustradas. Um esquema de um cérebro de camundongo é mostrado no centro, e os 16 locais de gravação (círculos vermelhos) na superfície do cérebro de camundongo são indicados pelos números de canal. A bobina de estimulação está localizada próxima à área do Ch 14. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: arquivo de dados CAD para o disco em forma de rosquinha necessário para a construção da bobina. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.