Preparação de Amostras de Alimentos Utilizando Homogeneização e Digestão Ácida Úmida Assistida por Micro-ondas para Determinação de Multielementos com ICP-MS

A análise elementar é um processo analítico para determinar a composição elementar de várias amostras. Ele pode ser usado para controlar a ingestão de metais no corpo humano (especialmente metais pesados¹), uma vez que suas altas concentrações podem causar problemas de saúde indesejados. Os metais pesados também são um dos principais contaminantes ambientais, portanto, o controle de sua presença no ambiente é necessário². Além disso, a análise elementar pode ser empregada para determinar a origem geográfica dos produtos alimentícios³ e para controlar a qualidade dos alimentos e dos recursos hídricos⁴. Além disso, é usado para a determinação de micro e macronutrientes em solos⁵ e para obter informações sobre processos geológicos ao longo da história, examinando a composição química de minerais e sedimentos⁶. Estudos também têm sido realizados para determinar a presença de metais raros em resíduos eletroeletrônicos para posterior regeneração de metais⁷, avaliar o sucesso de tratamentos medicamentosos⁸ e verificar a composição elementar de implantes metálicos⁹.

A espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) e a espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) são técnicas comumente utilizadas para a análise elementar de várias amostras¹⁰. Eles permitem a determinação simultânea de múltiplos elementos com limites de detecção (LOD) e limites de quantificação (LOQ) tão baixos quanto ng/L. Em geral, ICP-MS tem menores valores de LOD¹¹ e uma faixa de concentração linear mais ampla em comparação com ICP-OES¹². Outras técnicas para determinar a composição elementar são a espectrometria de emissão óptica com plasma induzida por micro-ondas¹³ e várias variantes da espectroscopia de absorção atômica (EAA), incluindo espectroscopia de absorção atômica com chama, espectroscopia de absorção atômica eletrotérmica², espectroscopia de absorção atômica com vapor frio e espectroscopia de absorção atômica com geração de hidreto¹⁴. Além disso, a determinação elementar com baixos LOD e LOQ é possível com diferentes métodos eletroanalíticos, especialmente com voltametria de redissolução anódica^15,16. É claro que existem outros métodos para determinar a composição elementar das amostras, mas eles não são tão frequentemente empregados quanto os métodos acima mencionados.

A determinação elementar direta de amostras sólidas é viável usando espectroscopia de degradação induzida por laser e fluorescência de raios X¹⁷. No entanto, para a determinação elementar com ICP-MS, ICP-OES e AAS é necessário converter amostras sólidas em estado líquido. Para este fim, a digestão ácida é realizada usando ácidos e reagentes auxiliares (na maioria dos casos H₂O₂). A digestão ácida é realizada em temperatura e pressão elevadas, convertendo a parte orgânica da amostra em produtos gasosos e convertendo os elementos metálicos em sais solúveis em água, dissolvindo-os na solução¹⁸.

Existem dois tipos principais de digestão ácida, a digestão de vasos abertos e a digestão de vasos fechados. A digestão em vasos abertos é custo-efetiva¹⁴ , mas apresenta limitações, como a temperatura máxima de digestão, que coincide com a temperatura de ebulição dos ácidos à pressão atmosférica. A amostra pode ser aquecida em placas quentes, blocos de aquecimento, banhos de água, banhos de areia² e por micro-ondas¹⁹. Ao aquecer a amostra dessa maneira, grande parte do calor gerado é perdido para o entorno²⁰, o que prolonga o tempo de digestão¹⁴. Outras desvantagens da digestão em vasos abertos incluem o maior consumo de produtos químicos, a maior possibilidade de contaminação do ambiente circundante e a possível perda de analitos devido à formação de componentes voláteis e sua evaporação a partir da mistura reacional²¹.

Sistemas de vasos fechados são mais convenientes para a digestão de amostras orgânicas e inorgânicas em comparação com sistemas de vasos abertos. Os sistemas de vasos fechados utilizam uma variedade de fontes de energia para aquecer as amostras, como aquecimento por condução e micro-ondas²². Os métodos de digestão que utilizam micro-ondas incluem a combustão induzida por micro-ondas²³, sistemas de câmara de reação única²⁴ e a digestão ácida úmida assistida por micro-ondas (MAWD) ^{comumente usada 25,26}. O MAWD permite a digestão em temperaturas operacionais mais elevadas, variando entre 220 °C e 260 °C e pressões máximas de até 200 bar, dependendo das condições de trabalho do instrumento²⁷.

A eficiência e a taxa de MAWD dependem de vários fatores, incluindo a composição química das amostras, a temperatura máxima, o gradiente de temperatura, a pressão no recipiente de reação, a quantidade de ácidos adicionados e a concentração de ácidos utilizados²⁸. No MAWD, a digestão ácida completa pode ser alcançada em poucos minutos devido às condições de reação elevadas em comparação com digestãos mais duradouras em sistemas de vasos abertos. Menores volumes e concentrações de ácidos são necessários na DMA, o que está de acordo com as diretrizes atuais de química verde²⁹. Na MAWD, uma quantidade menor de amostra em comparação com a digestão em vasos abertos é necessária para realizar a digestão ácida, geralmente até 500 mg de amostra é suficiente 30,31,32. Maiores quantidades de amostra podem ser digeridas, mas requerem uma quantidade maior de produtos químicos.

Uma vez que o instrumento para MAWD controla automaticamente as condições de reação e a pessoa não entra em contato direto com os produtos químicos durante o aquecimento, o MAWD é mais seguro de operar do que as digestãos de vasos abertos. No entanto, a pessoa deve sempre proceder com cautela ao adicionar produtos químicos aos vasos de reação para evitar que eles entrem em contato com o corpo e causem danos. Os vasos de reação também precisam ser abertos lentamente, pois a pressão é acumulada dentro deles durante a digestão ácida.

Embora a digestão ácida seja uma técnica útil para preparar amostras para determinação elementar, a pessoa que a realiza deve estar ciente de suas possíveis limitações. A digestão ácida pode não ser adequada para todas as amostras, especialmente aquelas com matrizes complexas e aquelas que são altamente reativas ou podem reagir explosivamente. Portanto, a composição da amostra deve sempre ser avaliada para selecionar os produtos químicos adequados e as condições de reação para uma digestão completa que dissolva todos os elementos desejados na solução. Outras preocupações que o usuário deve considerar e abordar são as impurezas e a perda de analitos em cada etapa da preparação da amostra. A digestão ácida deve ser sempre realizada de acordo com regras específicas ou utilizando protocolos.

O protocolo descrito abaixo fornece instruções para a homogeneização de amostras de alimentos em um misturador de tamanho laboratorial, um procedimento para limpar os componentes do misturador, pesar adequadamente a amostra, adicionar produtos químicos, realizar a digestão ácida por MAWD, limpar os vasos de reação após a digestão completa, preparar as amostras para determinação elementar e realizar uma determinação quantitativa multielemento com ICP-MS. Seguindo as instruções abaixo, deve-se ser capaz de preparar uma amostra adequada para a determinação elementar e realizar as medições das amostras digeridas.

1. Homogeneização da amostra

1. Usando uma faca de cerâmica limpa, corte manualmente as amostras de alimentos (brócolis, cogumelos, salsichas e macarrão) em pedaços menores para acelerar o processo de secagem. Preparar amostras suficientes para um mínimo de 6 repetições da digestão ácida (garantir que a massa mínima das amostras secas é de 1500 mg).
   OBS: O aumento da área superficial da amostra expõe uma porção maior da amostra ao ar ambiente aquecido, aumentando a taxa de evaporação da água.
2. Colocar a amostra num copo de vidro de 250 ml e secá-la a 105 °C até um peso constante utilizando um secador.
3. Retire o copo de vidro com a amostra do secador e insira-o no dessecador.
4. Deixe a amostra arrefecer até à temperatura ambiente.
   NOTA: As amostras devem ser pesadas a uma temperatura constante para garantir que o peso reflecte com precisão a massa. Variações de temperatura podem afetar o volume e a densidade das amostras medidas.
5. Abra o exsicador e transfira o copo de vidro com a amostra na balança analítica. Meça o peso do copo de vidro com a amostra.
6. Após a conclusão da pesagem, coloque a amostra de volta no secador.
   NOTA: Se a amostra encolheu significativamente durante a secagem, pode-se transferi-la para um copo de vidro menor usando uma espátula plástica para pesagem mais conveniente.
7. Repetir o processo conforme descrito nos passos 1.3-1.6 até atingir um peso constante da amostra.
8. Coloque a amostra heterogénea seca no copo misturador (ver Tabela de Materiais), certificando-se de que não excede o volume máximo do copo misturador.
9. Insira o copo misturador no misturador e feche a porta de proteção (Figura 1).
10. Pressione o botão Iniciar para ativar as lâminas para moer e misturar a amostra.
11. Realizar a moagem até que a amostra se transforme em um pó fino ou uma pasta homogênea. Para conseguir tal produto, repita o processo de moagem várias vezes.
12. Quando a amostra estiver homogeneizada, desligue o misturador, abra a porta de proteção e retire o copo misturador.
13. Retirar a amostra homogeneizada do copo misturador e transferi-la para um copo de vidro limpo de 50 mL usando uma espátula plástica limpa (Figura 2).
    OBS: Se a amostra for muito dura e puder danificar os componentes do misturador, como as lâminas e o copo misturador, ela pode ser homogeneizada por outros meios, como esmagá-la em argamassas. Os misturadores geralmente não são adequados para homogeneizar materiais duros, amostras congeladas ou amostras facilmente inflamáveis, o que poderia danificar os componentes do misturador. O uso de solventes orgânicos no misturador é desencorajado.
    CUIDADO: Use equipamentos de segurança e certifique-se de que a porta do misturador esteja adequadamente fechada, pois as lâminas do misturador giram em altas velocidades.

2. Limpeza do misturador

1. Adicione água ultrapura (ver Tabela de Materiais) à marca do copo misturador vazio.
2. Insira o copo misturador no misturador e execute o procedimento de mistura padrão.
3. Retire o copo da batedeira e despeje o esgoto. Se necessário, repita o processo com água ultrapura várias vezes até que a água permaneça limpa mesmo após a mistura.
4. Retire as lâminas contaminadas e a vedação do diafragma do misturador e limpe-as cuidadosamente com água ultrapura.
   NOTA: Use detergentes neutros para melhorar a eficiência da limpeza, especialmente quando se trata de amostras com alto teor de gordura, pois a gordura adere facilmente à superfície do inventário do laboratório.
   CUIDADO: Use equipamentos de proteção adequados, como luvas, ao remover e limpar as lâminas para reduzir o risco de possíveis lesões de suas bordas cortantes.
5. Secar os componentes limpos no secador a 105 °C e reinseri-los no misturador.
   NOTA: Certifique-se de que os componentes do misturador estão completamente secos antes de os reinstalar no misturador, para evitar o transporte da água para a amostra seguinte.

3. Pesagem da amostra

1. Retirar a tampa do recipiente de reação de 100 mL de trifluorometoxil-politetrafluoretileno TFM-PTFE³³.
2. Coloque o recipiente de reação aberto na balança analítica e certifique-se de que a balança seja nivelada e zerada antes de cada medição (Figura 3).
   NOTA: A pesagem deve ser realizada à temperatura ambiente. Evite áreas onde flutuações severas de temperatura e fluxo de ar possam afetar o peso medido. Certifique-se de que a área de pesagem esteja limpa e livre de contaminantes.
3. Transferir a amostra homogeneizada para o recipiente de reação usando uma espátula plástica e pesar 250 mg da amostra. Não pesar a amostra abaixo do limite mínimo de peso da balança analítica.
4. Quando a pesagem estiver completa, coloque a tampa de cobertura no recipiente de reação para proteger a amostra de contaminação.
   NOTA: Exceder o limite de peso do procedimento de digestão pode resultar em digestão incompleta. Manusear a amostra e os recipientes de reação com cuidado para evitar qualquer contaminação externa.

4. Adição de ácido

1. Despeje aproximadamente 40,0 mL de HNO₃ em peso 68% e 5,0 mL de 30% em peso H₂O₂ em copos de vidro separados de 50 mL, respectivamente.
   NOTA: Os produtos químicos devem ser de alta pureza com impurezas metálicas residuais inferiores a 1,0 μg/L (ppb), idealmente na faixa ng/L (ppt). Traços de impurezas metálicas afetam a precisão e a repetibilidade da determinação elementar.
2. Colocar os recipientes de reacção num exaustor, abrir as tampas da tampa e adicionar os volumes abaixo mencionados de 68% em peso de HNO₃ e 30% em peso de H₂O₂ com pipetas automáticas de 1 ml ou 5 ml, de acordo com as seguintes especificações:
   1. Brócolis, cogumelos, salsichas e macarrão; para 250 mg de amostra adicionar 5,0 mL 68% em peso HNO₃ e 1,0 mL 30% em peso H₂O₂. Prepare três réplicas para cada amostra.
   2. Para determinar a exactidão do método (em termos de recuperação, Rec), utilizar o procedimento descrito no ponto 4.2.1 e adicionar 37,5 μL de solução padrão multielemento ICP 100 mg/L (ver Tabela de Materiais) nos recipientes de reacção utilizando uma pipeta automática de 200 μL. Para cada amostra, prepare três repetições.
      NOTA: O volume de 37,5 μL foi selecionado por corresponder a um aumento de 15,0 μg/L para as soluções fortificadas das amostras em comparação com a concentração nas soluções não fortificadas das amostras. Além disso, o aumento da concentração para a solução fortificada das amostras corresponde à concentração final que ainda está na faixa de concentração linear para cada analito medido.
   3. Preparar uma amostra em branco utilizando o mesmo volume de 68% em peso HNO₃ e 30% em peso H₂O₂ utilizado para a digestão de amostras de alimentos na etapa 4.2.1. Para uma amostra em branco, não adicione a amostra aos recipientes de reacção.
      CUIDADO: O_{HNO 3} usado para digestão é corrosivo e produz fumos. Por esta razão, a adição de ácido deve ser realizada em um exaustor de fumaça. Devem ser utilizados equipamentos de proteção laboratoriais padrão (luvas, óculos de segurança e jaleco de laboratório). Se houver contato com ácido, a área afetada deve ser imediatamente enxaguada sob a corrente de água fria, e a ajuda médica deve ser procurada.
3. Coloque a tampa da tampa nos recipientes de reação e permita que as amostras reajam com a adição de 68% em peso de HNO₃ e 30% em peso de H₂O₂ por 2-3 min.
4. Rosqueie a tampa de rosca no vaso e aperte as tampas da tampa.
5. Agite o recipiente de reação usando movimentos leves das mãos para incorporar totalmente as amostras em produtos químicos.
   OBS: Não deixe os espécimes nas paredes ou tampas dos vasos de reação, pois existe a possibilidade de que eles não sejam completamente digeridos.

5. Digestão ácida úmida assistida por micro-ondas

1. Ligue o sistema de micro-ondas (consulte a Tabela de Materiais) para digestão ácida pressionando o botão de partida (Figura 4).
2. Abra a porta do forno de micro-ondas e retire o rack.
3. Distribua os recipientes de reação fechados simetricamente no rack para garantir a irradiação uniforme das amostras por micro-ondas.
4. Insira o rack na câmara de micro-ondas e monte-o em um suporte (Figura 5).
5. Feche a porta do micro-ondas.
6. Defina um programa de digestão adequado na tela sensível ao toque do forno de micro-ondas usando uma ferramenta em forma de caneta. Escolha um gradiente de temperatura apropriado, a temperatura final e o número de amostras a serem digeridas. O programa de digestão recomendado para diferentes amostras de alimentos está listado abaixo:
   1. Brócolis, cogumelos, salsichas e macarrão: aumento de 10 min para 160 °C, aumento de 10 min para 200 °C, 15 min para 200 °C, potência máxima de 900 W.
7. Inicie o programa de digestão e monitore a mudança nas condições de reação na tela. Pare o processo de digestão se a temperatura não aumentar de acordo com o programa prescrito.
   NOTA: Durante a digestão, picos repentinos de temperatura podem ser vistos na tela do forno de micro-ondas. Eles ocorrem quando as amostras reagem exotermicamente com os produtos químicos. O sistema de micro-ondas irá regular automaticamente a temperatura, ajustando a potência de saída.
8. Aguarde até que a digestão assistida por micro-ondas seja concluída e a temperatura da amostra diminua.
9. Abra a porta do forno de micro-ondas e retire o rack da câmara do forno de micro-ondas. Feche a porta e desligue o instrumento.
10. Retire os recipientes de reação do rack e espere que eles esfriem até a temperatura ambiente.
11. Abra lentamente as tampas da tampa manualmente para liberar os gases formados durante a digestão ácida. Gire os vasos de reação na direção da exausta (Figura 6).
12. Remova completamente a tampa e lave a tampa e as paredes do recipiente de reação com uma pequena quantidade de água ultrapura.
13. Transferir quantitativamente o conteúdo do recipiente de reacção para um balão volumétrico de vidro limpo de 25 ml através de um funil de vidro através de uma lavagem repetida da tampa e do recipiente de reacção com água ultrapura.
14. Diluir a amostra com água ultrapura até à marca do balão volumétrico. Fechar o balão volumétrico com uma rolha e misturar o conteúdo do balão volumétrico.
    NOTA: Deve proceder-se a uma diluição adicional das amostras digeridas com água ultrapura, uma vez que estas devem conter menos de 5% (V/V) de ácido residual³⁴ e menos de 2 g/L de elementos dissolvidos, também designados por sólidos dissolvidos totais³⁵.
15. Pegue uma seringa de plástico de 20 mL e conecte-a a um filtro de seringa de poliamida (25 mm de diâmetro, tamanho de poro de 0,20 μm). Encha a seringa de plástico com a amostra diluída e filtre o seu conteúdo num tubo de centrífuga de plástico de 50 ml aplicando pressão. Use uma nova seringa plástica e um filtro de seringa para cada amostra para evitar qualquer contaminação cruzada.
    NOTA: As amostras precisam ser filtradas para remover quaisquer materiais insolúveis ou partículas sólidas que possam permanecer não digeridas após a MAWD. Essas partículas podem interferir nas medidas de determinação elementar por obstruir os componentes do instrumento. Ao filtrar as amostras, certifique-se de descartar as primeiras gotas. Use filtros hidrofílicos (feitos de poliamida) para soluções aquosas. Os filtros hidrofóbicos (PTFE) não são adequados para a filtração de soluções aquosas, pois requerem maior pressão aplicada, o que poderia resultar em ruptura da membrana³⁶.
16. Fechar o tubo da centrífuga plástica de 50 mL com tampa de rosca e colocar a amostra na geladeira até as medições.
    NOTA: As amostras digeridas são armazenadas na geladeira em temperaturas mais baixas para preservá-las e estender seu tempo de armazenamento.

6. Limpeza do vaso de reação

1. Após as amostras digeridas serem transferidas para frascos volumétricos de 50 mL, adicionar 5,0 mL de HNO₃ em peso 68% e 5,0 mL de água ultrapura com pipetas automáticas de 5 mL nos vasos de reação.
2. Feche os recipientes de reação com as tampas da tampa e insira-os no rack. Transfira o rack para a câmara do forno de micro-ondas.
3. Aplique o seguinte programa de micro-ondas: aumento de 15 min para 160 °C, aumento de 10 min para 180 °C, potência máxima de 900 W.
4. Monitorar as condições de reação durante o aquecimento. Após o aquecimento ser concluído, deixe os recipientes de reação esfriarem.
5. Abra o forno de micro-ondas, retire os recipientes de reação do rack e abra-os lentamente no exaustor.
6. Descarte o conteúdo dos recipientes de reação em recipientes de resíduos plásticos.
7. Lave os vasos de reação com água ultrapura para remover qualquer excesso de material ou produtos químicos.
8. Secar os recipientes de reacção no secador a 105 °C antes da próxima utilização.
   NOTA: O mesmo procedimento de micro-ondas (tempo, potência, gradiente de temperatura e volume de produtos químicos) usado para a digestão ácida das amostras pode ser usado para limpar os vasos de reação. Alternativamente, os vasos de reação podem ser limpos sem o sistema de micro-ondas, submergindo-os em HNO₃ ou HCl concentrado por várias horas e enxaguando-os com água ultrapura.

7. Determinação multielementar com ICP-MS

1. Retirar do frigorífico os tubos de centrífuga de plástico de 50 ml que contêm as amostras digeridas e deixá-los aquecer à temperatura ambiente.
2. Diluir as amostras por um factor de 10 para diminuir a concentração de ácido na amostra digerida e diminuir a concentração do componente da matriz da amostra. Com uma pipeta automática, transfira 2,50 mL da amostra para um balão volumétrico de vidro de 25 mL e, em seguida, preencha-a até a marca com água ultrapura.
3. Transferir as amostras diluídas para os tubos de plástico de 15 ml e colocá-las nas posições adequadas no amostrador automático.
4. Preparar o instrumento ICP-MS (ver Tabela de Materiais) para as medições:
   1. Ligue a ventilação e o chiller que abastece o ICP-MS com água de resfriamento e resfria seus componentes.
   2. Use o software compatível para garantir que a solução de enxágue (1% em peso de HNO₃) flua continuamente do amostrador automático para o ICP-MS sem pulsar.
   3. Abrir botijões de gás Ar (99,999% de pureza) e He (99,999% de pureza) para abastecer o ICP-MS com ambos os gases. Verifique o fluxo de gás no software e ajuste-o, se necessário.
      NOTA: Use célula de colisão com gás He quando interferências espectrais são esperadas devido à formação de íons poliatômicos (por exemplo, ⁴⁰Ar¹⁶O⁺ interferindo com ⁵⁶Fe⁺)³⁷.
   4. Ligue o plasma e calibre o instrumento usando a solução de afinação (consulte Tabela de Materiais).
   5. Uma vez calibrado o instrumento (posição da tocha, tensão de ganho, tensão da lente, massa/resolução, calibração de pulso/analógico (P/A), calibração de banco de dados (DB) e validação), selecione o método de medição desejado e realize as medições.
5. Ao trabalhar com amostras desconhecidas, realizar uma determinação semiquantitativa para obter informações sobre quais elementos estão presentes na amostra e sua concentração aproximada.
   NOTA: É aconselhável diluir adicionalmente as amostras para a determinação semiquantitativa, uma vez que os detectores têm um limite da concentração de elementos que podem detectar de uma só vez. Concentrações de amostra mais baixas podem prolongar a vida útil dos componentes do instrumento.
6. Depois de obter os dados sobre as concentrações aproximadas dos elementos nas amostras, crie um método para a determinação elementar quantitativa no software. Selecione as condições de operação do ICP-MS (Tabela 1) e selecione os elementos desejados (no presente caso, Fe, Mn e Zn). Determinar o número e as concentrações de soluções da norma necessárias para criar uma curva de calibração (por vezes referida como curva analítica ou curva de trabalho) (Quadro 1).
   NOTA: Preparar pelo menos seis concentrações diferentes como pontos de calibração para a curva de calibração.
7. Preparar soluções de padrão para a curva de calibração. Usando pipetas automáticas, pipetar o volume necessário de soluções padrão multielementos de 100 mg/L em balões volumétricos de vidro de 25 mL, para preparar soluções de padrões com as seguintes concentrações: 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L e 50,0 μg/L. Encha os frascos até a marca com 1% em peso de HNO₃. Além disso, prepare um espaço em branco de calibração usando a solução de HNO₃ em peso de 1%.
8. Transfira as soluções preparadas do padrão e das amostras para os tubos plásticos de 15 mL, coloque-as no amostrador automático e inicie o instrumento seguindo o procedimento descrito na etapa 7.4.
9. Realizar a medição quantitativa dos elementos selecionados utilizando a metodologia da curva de calibração.
10. Quando as medições forem concluídas, desligue o plasma, feche as fontes de gás Ar e He, desligue o chiller ICP-MS e desligue o sistema de ventilação.

Homogeneização
Todas as amostras foram secas até uma massa constante com o secador de laboratório para eliminar qualquer umidade. A transferência da amostra para um exsicador permitiu que ela resfriasse até a temperatura ambiente sem ligar a umidade do ambiente circundante. As amostras de alimentos foram então homogeneizadas em misturador de laboratório para obtenção de um pó fino. As partículas homogeneizadas resultantes foram uniformes em tamanho e uniformemente distribuídas, garantindo que as subamostras (amostras retiradas de uma amostra maior) usadas para digestão ácida fossem representativas. As amostras foram facilmente removíveis do copo misturador com o auxílio de uma espátula plástica, com exceção da amostra de carne seca, que foi mais difícil de remover devido ao seu maior teor de gordura. O maior teor de gordura fez com que a amostra aderisse parcialmente às paredes de vidro do copo misturador. A comparação entre amostras frescas, secas e homogeneizadas é apresentada na Figura 2.

Os componentes do instrumento tiveram que ser limpos várias vezes com água ultrapura para eliminar todas as partículas de alimentos que permaneceram no misturador.

É essencial garantir que a massa pesada da amostra não exceda o valor máximo permitido nos recipientes de reacção. A pesagem foi realizada utilizando-se balança analítica à temperatura constante e espátula plástica para evitar contaminação com metais que possam advir de espátulas metálicas.

Digestão ácida
Todas as amostras utilizadas no protocolo foram amostras de alimentos contendo várias quantidades de carboidratos, proteínas e gorduras. HNO3, em combinação com H2O2, é adequado para a digestão dessas moléculas, e outros produtos químicos não são necessários. Os produtos químicos foram tratados em uma capela de fumaça, uma vez que o HNO3 forma fumos. Após a adição dos produtos químicos nos recipientes de reação TFM-PTFE, as tampas de cobertura foram montadas na parte superior dos recipientes de reação e foram bem seladas para evitar possível contaminação e perda do analito. Os vasos de reação foram distribuídos simetricamente no rack para garantir uma irradiação uniforme de micro-ondas dentro do sistema de micro-ondas.

Durante a digestão ácida, a porta do sistema de micro-ondas foi fechada e a porta não pôde ser aberta até o final do protocolo. Todo o processo de digestão ácida pode ser monitorado na tela do aparelho, mostrando a mudança de temperatura com o tempo (Figura 7).

Após a digestão ácida ter sido concluída e as soluções das amostras digeridas terem resfriado à temperatura ambiente, os vasos de reação foram abertos no exaustor. Eles foram abertos o mais devagar possível. Se a pressão for liberada muito rapidamente, até mesmo pequenas gotículas da mistura de reação podem escapar, resultando na perda do analito. Quando os vasos de reação foram abertos, um gás amarelo ou amarelo-alaranjado foi liberado (Figura 8). A coloração dos vapores pode ser atribuída ao NO2, que forma fumos alaranjados em temperaturas mais elevadas. O aumento da pressão nos vasos de reação foi devido à oxidação das amostras de alimentos com HNO3, resultando na formação de gases como CO2, H2O, NO, etc. Após a desgaseificação dos vasos de reação, uma solução amarelo-clara ou incolor da amostra digerida permaneceu no vaso de reação, indicando que a digestão ácida total por MAWD havia sido alcançada. Isso foi confirmado pela ausência de partículas visíveis deixadas na solução.

A etapa final do preparo das amostras envolveu a diluição das amostras digeridas com água ultrapura para reduzir a acidez residual (AR). Altos valores de RA interferem nas medidas, aumentando o sinal de fundo. A diluição também diminui a concentração de íons metálicos na amostra líquida26. Ao transferir a solução das amostras digeridas para frascos volumétricos, os componentes do recipiente de reação foram cuidadosamente lavados com água ultrapura para transferir completamente o analito. Um problema que ocorre é que pequenas gotas de água ultrapura, que podem conter o analito de interesse, aderem às paredes dos vasos de reação. Após diluição com água ultrapura até a marca de 25 mL, todas as amostras tornaram-se incolores. As soluções finais das amostras digeridas continham sais solúveis em água, pois os elementos metálicos presentes na amostra reagiram com o HNO3 formando nitratos altamente solúveis. Técnicas de análise elementar podem determinar os íons metálicos que formam sais solúveis em água. Ao filtrar as soluções diluídas, é importante descartar as primeiras gotas para garantir que quaisquer partículas ou contaminantes sejam removidos. Após a filtração, as soluções foram bem seladas para evitar qualquer vazamento e, em seguida, armazenadas na geladeira.

A principal limitação do procedimento de digestão ácida é o rendimento da amostra. O sistema MAWD pode digerir apenas um número limitado de amostras por vez. Além disso, cada etapa de digestão e preparação subsequente da amostra pode levar várias horas para ser concluída. Além disso, a limpeza do vaso de reação também é demorada, mas é crucial para minimizar o risco de contaminação cruzada entre as amostras.

Determinação multielementar com ICP-MS
Para cada elemento, foi construída uma curva de calibração. Eles foram obtidos plotando-se a intensidade em função das concentrações dos analitos (Figura 9). Os intervalos lineares de concentração para todos os elementos medidos estavam na faixa de 1,0 μg/L a 50,0 μg/L.

O LOD e o LOQ para cada elemento foram calculados usando a Equação 1 e a Equação 2, respectivamente. Em ambas as equações, sblank representa o desvio padrão das diversas medidas de calibração em branco (10 repetições)38,39, enquanto b1 representa a inclinação da curva de calibração.

(1)

(2)

Os LODs obtidos foram 0,5 ng/L, 2,8 ng/L, 2,8 ng/L e 3,2 ng/L para Mn,, Fe e Zn, respectivamente. Os LOQs obtidos foram 1,6 ng/L, 9,2 ng/L, 9,5 ng/L e 10,8 ng/L para Mn,, Fe e Zn, respectivamente.

Foram realizadas seis digestãos repetidas de cada amostra. Três digestãos replicadas de cada amostra foram realizadas sem picar a amostra com soluções padrão, e três digestãos replicadas foram realizadas com a adição de uma solução de uma quantidade conhecida de analito padrão para testar a exatidão (teste de recuperação de espícula40) e precisão de toda a metodologia. Para a determinação da exatidão antes do procedimento de digestão, 37,5 μL de 100 mg/L de solução padrão multielemento ICP foram pipetados nos recipientes de reação contendo a amostra, o que resultou em um aumento da concentração de 15,0 μg/L nas amostras fortificadas que foram diluídas por um fator de 10. Isso também correspondeu a um aumento de 15,0 μg por grama de amostra para cada íon metálico medido. A exatidão e a precisão foram determinadas por meio de Rec e desvio padrão relativo (RSD), respectivamente.

A precisão de um método analítico pode ser avaliada pelo teste de recuperação de espículas. Para este efeito, é adicionada à amostra uma solução de uma quantidade conhecida de padrão de analito, que é então digerida nas mesmas condições de reacção que as amostras que não são fortificadas41. O Rec é calculado usando a equação 3, onde γi é a concentração medida das amostras fortificadas após a digestão, enquanto γt representa a concentração determinada da amostra não cravada considerando o aumento da solução adicionada do padrão do analito. As γi e γt são médias das três réplicas. O método analítico é considerado exato quando o Rec está na faixa de 80,00%-120,00%42.

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A precisão de um método analítico é avaliada com RSD. Descreve a proximidade de concordância entre os resultados independentes, que foram obtidos através de várias medidas replicadas. A DSR é calculada usando a equação 4, onde sm representa o desvio padrão das medidas replicadas para a determinação da concentração, enquanto representa o valor médio das concentrações determinadas. O método analítico é considerado preciso se o valor de RSD for inferior a 20,00%43.

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Todas as amostras foram diluídas com água ultrapura por um fator de 10 antes das medidas de ICP-MS (para o primeiro conjunto de medidas). A diluição diminuiu a concentração dos componentes da matriz introduzidos no analisador. Além disso, ao diluir a amostra, a AR diminui. Uma AR alta pode comprometer a eficiência da ionização do plasma ou resultar em problemas de interferência da matriz. Se a concentração dos analitos após a primeira série de medições for inferior à LOQ, o factor de diluição deve ser inferior a 10. A quantificação dos íons metálicos foi realizada por meio de uma curva de calibração. Os valores dos resultados calculados devem ter a mesma precisão (o mesmo número de valores significativos) que a solução do padrão empregado para a calibração. O teor de íons metálicos na amostra foi expresso em μg por grama de peso (μg/g). Isto foi conseguido multiplicando-se a concentração mássica medida da amostra analisada pelo fator de diluição para obter a concentração na amostra original digerida. Essa concentração de massa foi então multiplicada pelo volume da amostra digerida (25 mL) e, em seguida, dividida pela massa inicial pesada da amostra homogeneizada (a massa ponderada inicial é a massa da amostra que foi pesada no vaso de reação para o MAWD). Todos os valores são relatados como uma média de três réplicas.

O conteúdo relatado dos elementos abaixo é dado como ± sm. O teor de, Mn e Zn na amostra de brócolis foi de 5,9 ± 0,5 μg/g, 32,5 ± 2,7 μg/g e 42,8 ± 0,2 μg/g, respectivamente. A concentração mássica determinada de Fe nas amostras de brócolis excedeu o limite superior da faixa de concentração linear da curva de calibração (isto é, 50,0 μg/L). Assim, a solução da amostra foi diluída com água ultrapura por um fator de 2, e a medida de ICP-MS dessa solução foi realizada. Os resultados mostraram que o brócolis continha 63,0 ± 1,9 μg/g de Fe.

Para o cogumelo, os teores de Zn, Fe, e Mn foram de 35,6 ± 1,4 μg/g, 30,4 ± 1,3 μg/g, 18,5 ± 1,0 μg/g e 5,4 ± 0,3 μg/g, respectivamente. As salsichas continham 42,2 ± 0,9 μg/g de Fe, 25,1 ± 2,6 μg/g de Zn e 1,0 ± 0,1 μg/g de. A determinação multielemento com ICP-MS da solução digerida, diluída 10 vezes, mostrou que a concentração de Mn foi inferior ao limite inferior da faixa linear de concentração (i.e., 1,0 μg/L). Assim, a solução original da amostra de linguiça foi diluída apenas por um fator de 5, e a determinação multielemento com ICP-MS foi repetida. O teor de Mn nas amostras de salsicha foi determinado em 0,9 ± 0,3 μg/g. Macarrão continha 5,4 ± 2,8 μg/g de Zn, 10,3 ± 1,2 μg/g de Fe, 1,6 ± 0,3 μg/g de e 7,5 ± 0,2 μg/g de Mn.

O Rec para todos os analitos medidos nas quatro amostras estava na faixa de 80,00%-120,00%, indicando a exatidão do método analítico. Os cálculos mostraram que o método analítico foi preciso, pois os valores de RSD foram inferiores a 20,00%, exceto RSD para Zn em amostras de macarrão. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

Figura 1: Misturador de laboratório utilizado para homogeneização de amostras de alimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Comparação das amostras frescas, secas e homogeneizadas. (A-D) Amostras frescas de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. (E-H) amostras secas de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. (I-L) amostras homogeneizadas de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Pesagem da amostra em balança analítica. Isso é realizado de cima, abrindo o retalho superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Sistema de micro-ondas. O sistema de micro-ondas para digestão ácida com tela sensível ao toque lateral para selecionar as condições de reação e monitorar o processo de digestão ácida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Componentes utilizados para digestão ácida assistida por micro-ondas. (A) Rack com 14 vasos de reação para digestão ácida dentro da câmara do forno de micro-ondas. (B) Os vasos de reação TFM-PTFE consistem em 3 partes. Uma vez fechados os recipientes com tampas, nem a amostra nem os gases podem escapar ou entrar nos recipientes de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: O interior dos vasos de reação quando abertos na capela de fumos. (A) A coloração amarelo-alaranjada dos fumos deve-se ao NO2 produzido durante a digestão ácida. (B) A coloração amarela da solução da amostra digerida após a maioria dos gases ter escapado do recipiente de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Variação da temperatura com o tempo. Um gráfico mostrando a mudança de temperatura em função do tempo durante a digestão ácida com MAWD. T2 significa a temperatura da mistura de reação dentro dos vasos de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Abertura dos recipientes de reação sob o exaustor de fumos, onde são liberados gases amarelo-alaranjados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Exemplo de uma curva de calibração para Mn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Instrumento ICP-MS utilizado para determinação de múltiplos elementos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Condições operacionais do instrumento ICP-MS. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Valores de rec e RSD de brócolis, cogumelos, salsicha e macarrão. Clique aqui para baixar esta tabela.

Os autores não têm nada a revelar.