Amostragem de líquido cefalorraquidiano e sangue da veia lateral da cauda em ratos durante registros de EEG

O líquido cefalorraquidiano (LCR) e a coleta de sangue são importantes para identificar e validar biomarcadores de epilepsia, tanto em pesquisas pré-clínicas quanto clínicas ^1,2. Atualmente, o diagnóstico de epilepsia e a maioria das pesquisas sobre biomarcadores de epilepsia concentram-se no EEG e na neuroimagem ^3,4,5. Essas abordagens, no entanto, apresentam várias limitações. Além das medidas rotineiras do couro cabeludo, o EEG requer, em muitos casos, técnicas invasivas como eletrodos de profundidade⁶. Os métodos de imagem cerebral têm baixa resolução temporal e espacial, são relativamente caros e^demorados7,8. Por essa razão, a identificação de biomarcadores não invasivos, de baixo custo e à base de biofluidos seria uma alternativa bastante atraente. Além disso, esses biomarcadores de biofluidos poderiam ser combinados com abordagens diagnósticas disponíveis para aguçar sua preditividade.

Pacientes com diagnóstico de epilepsia são rotineiramente submetidos ao EEG ^9,10 e coleta de sangue 11,12,13,14, e muitos também à retirada do LCR para excluir causas potencialmente fatais (isto é, infecções agudas, encefalite autoimune)¹⁵. Essas amostras de sangue e LCR podem ser utilizadas em pesquisas clínicas com o objetivo de identificar biomarcadores para epilepsia. Por exemplo, Hogg e colaboradores descobriram que um aumento em três fragmentos de RNAt plasmático precede a ocorrência de convulsões na epilepsia humana¹⁴. Da mesma forma, os níveis de interleucina-1beta (IL-1β) no LCR e no soro humano, expressos como a razão dos níveis de IL-1β no LCR sobre o soro, podem predizer o desenvolvimento de epilepsia pós-traumática após traumatismo cranioencefálico¹⁶. Esses estudos destacam a importância da amostragem de biofluidos para a pesquisa de biomarcadores de epilepsia, mas enfrentam múltiplas limitações intrínsecas aos ensaios clínicos, por exemplo, o fator cofundador de drogas antiepilépticas (DAEs) no sangue, a frequente falta de informações sobre a etiologia, controles inadequados, número modesto de pacientes, entre^outros17,18.

A pesquisa pré-clínica oferece outras oportunidades para investigar moléculas em biofluidos como potenciais biomarcadores para epilepsia. De fato, é possível retirar plasma e/ou LCR de animais durante a realização de registros de EEG. Além disso, a amostragem pode ser realizada repetidamente ao longo de vários dias do experimento, e um número de controles de idade, sexo e insulto epiléptico podem ser usados para melhorar a robustez do estudo. Aqui, uma técnica flexível para obter LCR da cisterna magna com retirada paralela de plasma da veia caudal em ratos monitorados com EEG é descrita em detalhes. A técnica apresentada apresenta diversas vantagens sobre os métodos alternativos. Usando uma abordagem com agulha borboleta, é possível coletar o LCR várias vezes sem comprometer a função de eletrodos de EEG ou implantes de cabeça semelhantes. Isso representa um refinamento dos procedimentos de retirada do cateter intratecal, que estão associados a um risco relativamente alto de infecção. Além disso, a abordagem de queda livre relatada usada para coleta de sangue é superior a outras abordagens de coleta de sangue da veia caudal devido ao risco altamente reduzido de hemólise, devido ao fato de que o sangue não passa pela tubulação e nenhuma pressão de vácuo é aplicada. Se realizada em condições rigorosas de ausência de germes, existe um risco particularmente baixo de infecção para os animais. Além disso, ao iniciar as retiradas de sangue no final da cauda dos animais, a amostragem pode ser repetida várias vezes. Tais técnicas são de fácil domínio e podem ser aplicadas em muitos estudos pré-clínicos de doenças do sistema nervoso central.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Ferrara e pelo Ministério da Saúde italiano (autorização: D.M. 603/2022-PR) de acordo com as diretrizes delineadas na Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos. Este protocolo é especificamente ajustado para análises adicionais da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) de pequenos ácidos ribonucleicos não codificantes (sncRNAs) no LCR e plasma de ratos obtidos sob controle de EEG em animais epilépticos. A seu critério, consulte o vídeo relacionado ao JoVE para melhor compreensão e melhora da cirurgia 19,20,21.

1. Preparo dos animais para implantação cirúrgica de eletrodos ou telemetros

OBS: A técnica de cirurgia estereotáxica varia de acordo com o sistema de EEG utilizado. A seção de método a seguir fornece uma descrição das etapas que são comuns para os dois tipos de cirurgias.

1. Use ratos Sprague-Dawley (SD) (machos, 7-8 semanas de idade, pesando 250-290 g) mantidos de acordo com as leis locais para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Aloja os animais em condições normais, com livre acesso a comida e água potável.
2. Proceder com o manuseio dos ratos por alguns dias antes da cirurgia e dos procedimentos do protocolo experimental.
3. Utilizar aparelho estereotáxico para implantação de eletrodos ou telemetrômetros. Seguir os padrões contemporâneos para cirurgias assépticas. Use eletrodos e transmissores estéreis e que funcionem bem.
4. Faça a barba da cabeça do animal com a navalha elétrica. Induzir anestesia no animal com a mistura de quetamina (45 mg/kg) e xilazina (7,5 mg/kg) administrada por via intraperitoneal (i.p.), adicionar a anestesia com isoflurano (1,4% em ar; 1,2 mL/min) administrada através de máscara facial e fixar a cabeça do animal no aparelho estereotáxico.
5. Garantir a profundidade adequada da anestesia testando o reflexo de retirada do pedal após pinça do coxim podal nas patas traseiras de ambos os animais e manter a anestesia com isoflurano até o final da cirurgia. Verifique regularmente a profundidade anestésica durante toda a duração do procedimento.
6. Aplique uma quantidade suficiente de pomada ocular nos olhos de ambos os animais para evitar danos na córnea devido à perda do reflexo de piscar causado pela anestesia.
7. Limpe bem o couro cabeludo do animal com desinfetante líquido e faça um corte longitudinal de 2 cm de comprimento usando um bisturi esterilizado. Abra o couro cabeludo e aplique clipes cirúrgicos nos retalhos cutâneos para mantê-lo aberto.
8. Delicadamente, desprenda o periósteo para expor o bregma e a área do crânio através da qual o eletrodo de gravação será inserido.

2. Implante cirúrgico de eletrodos cativos

NOTA: Antes de estabelecer o procedimento de retirada do LCR de punção deste protocolo (ver passo 9 para detalhes), repetidas retiradas de LCR via cânula guia em alguns ratos não anestesiados que se movem livremente foram realizadas. Animais canulados implantados com eletrodos cativos foram usados para avaliar o impacto dos implantes de cabeça dupla no registro de EEG de longo prazo acoplado a múltiplas amostragens de LCR. Nesses experimentos específicos, ratos foram implantados com uma cânula guia simulada colocada na cisterna magna, cuja ponta foi inserida 7 mm nela estereotaticamente, de acordo com protocolos previamente^publicados22. As abordagens da cirurgia de duplo implante foram semelhantes àquelas adotadas por alguns trabalhadores no passado para cânulas guia de microdiálise e implante de eletrodo cativo^23,24.

1. Use um braço do quadro estereotáxico, monte o suporte do eletrodo nele e coloque o eletrodo na vertical no suporte. Mova a ponta do eletrodo exatamente acima do bregma. Anote as coordenadas anteroposterior e médio-lateral do bregma e traduza-as para as coordenadas desejadas.
2. Abaixe o eletrodo até que sua ponta quase toque o crânio. Marque o ponto de perfuração e perfure o crânio no ponto marcado. Tenha cuidado para não danificar o cérebro e meninges.
3. Faça quatro ou mais furos para ancorar parafusos e rosqueie-os no crânio. Preste atenção no tamanho do eletrodo ao fazer os furos para ancoragem dos parafusos. O tamanho do eletrodo não deve interferir nos parafusos de ancoragem posicionados.
4. Abaixe lentamente o braço estereotáxico que carrega o eletrodo no eixo dorsoventral, entre no tecido cerebral e pare na posição desejada. Fixe o fio terra do eletrodo ao redor de um dos parafusos parafusados no crânio.
5. Coloque o cimento metacrílico no eletrodo e parafusos cobrindo cerca de metade da altura do pedestal do eletrodo. Deixe a metade superior do eletrodo, que se encaixa na extremidade do fio de amarração, nua.
6. Solte o eletrodo do suporte e levante o braço estereotáxico. Solte o animal do aparelho estereotáxico e dê-lhe cuidados pós-operatórios.
7. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação separada e observe-o a cada 10 minutos até ficar acordado e deambulando. Devolva o animal à sua gaiola padrão e a outra companhia de animais não anestesiados somente após totalmente recuperado.

3. Implante cirúrgico dos telemetros

NOTA: Use apenas telemetros estéreis. Se os telemetros forem reutilizados, limpe-os e esterilize-os antes da cirurgia de acordo com as instruções do fabricante. Nesse protocolo, foi utilizado um telemetro Data Science International (DSI) para registro de EEG.

1. Ligue o transmissor de telemetria usando um ímã e teste o sinal com um rádio de frequência AM. Verifique se há um sinal forte e claro antes da cirurgia. Se necessário, descarte os telemetros que funcionam mal.
2. Prepare os cabos do telemetro encurtando-os para comprimentos ideais para ratos adultos. Descasque o revestimento de silicone em dois eletrodos (negativos e positivos), expondo aproximadamente 5 mm do chumbo de aço helicoidal. Crie uma alça em loop de cerca de 2 mm de comprimento e 1 mm de largura na ponta dos cabos.
3. Faça a barba do flanco do animal sob e atrás do ombro esquerdo. Desinfetar a área da cirurgia com desinfetante à base de peróxidos estabilizados e atividade quaternária de amônio. Deixe o desinfetante agir por 15 min.
4. Faça cerca de 2 cm de incisão lateral logo atrás do ombro do animal e faça uma bolsa subcutânea de cerca de 5 cm³ de espaço para a colocação do transmissor. Coloque o transmissor paralelo ao longo eixo do corpo, com os eletrodos direcionados para a direção rostral.
5. Fixar o transmissor na parede interna da loja subcutânea com uma sutura de algodão 3-0. Com tesoura romba, crie o túnel subcutâneo (aproximadamente 2,5 cm de comprimento) através do flanco e pescoço do animal, conectando assim a bolsa transmissora com a incisão mediana feita no couro cabeludo do animal no passo 1.6.
6. Pegue os dois telemetros com pinça e puxe-os pelo túnel, para que eles fiquem salientes da saída da incisão do couro cabeludo. Segure os eletrodos para fora da incisão do couro cabeludo com clipes da ferida.
7. Use a estrutura estereotáxica para individualizar as coordenadas desejadas para o chumbo positivo (vermelho) e faça o furo no crânio para a ponta do chumbo positivo (semelhante ao passo 2.1.). Faça mais um furo para ancorar o parafuso para cima na tribuna e rosqueie-o no crânio.
8. Insira a ponta de chumbo positivo sob a calota craniana e a dura-máter e coloque-a na superfície cerebral. Conecte a ponta em laço do cabo negativo (branco) no parafuso. Coloque uma pequena quantidade de cimento metacrílico ao redor da saída de chumbo positivo e do chumbo negativo para imobilizá-los no crânio.
9. Fixar os eletrodos na parede interna da pele do crânio com uma sutura de algodão 3-0. Certifique-se de que os cabos-eletrodos fixos e a sutura de fixação não interfiram no local de retirada do LCR (ou seja, uma superfície depressível com a aparência de um losango entre a protuberância occipital e a espinha do atlas).
10. Fechar a incisão do couro cabeludo e a incisão do flanco com fio de algodão 3-0. Aplique desinfetantes nas feridas. Somente depois que estes secarem, aplique um creme antibiótico sobre as feridas suturadas.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Monitorar os animais por cerca de 1 h após a cirurgia até ficar ereto e movimentando-se ao redor da gaiola. Mantenha-os em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia. Administrar aos animais um antibiótico sistêmico para prevenir infecção e um analgésico sistêmico para prevenir dor pós-cirúrgica por 2-3 dias.
2. Permitir que os ratos se recuperem por pelo menos 7 dias após os procedimentos cirúrgicos. Monitorar os animais pelo menos uma vez ao dia por 3 dias em busca de sinais de dor ou angústia.

5. Indução do estado de mal epiléptico em ratos

NOTA: Para um protocolo detalhado de indução do estado de mal epiléptico (SE) necessário para reproduzir a epilepsia do lobo temporal mesial (EMTm) em ratos, consulte Guarino et ^al.25.

1. Após uma semana de recuperação pós-cirúrgica, alocar os animais aleatoriamente nos grupos: (i) animais controle que receberão veículo e (ii) animais epilépticos que receberão pilocarpina. Utilizar um número proporcionalmente maior de animais para o grupo epiléptico, uma vez que nem todos os ratos administrados com pilocarpina sobreviverão ou desenvolverão SE.
2. No dia anterior à indução do SE, administrar aos animais uma dose única de 127 mg/kg de cloreto de lítio dissolvido em solução salina a 0,9% (3M) em volume de 1 mL/kg por gavagem gástrica. Administrar lítio no animal, o que aumenta a eficácia da pilocarpina²⁶, aproximadamente 14 h antes da indução do SE, a fim de diminuir a variabilidade no tempo de aparecimento do SE.
3. Cerca de 14 h após a administração de lítio, administrar aos ratos uma única injeção de escopolamina metila (1 mg/kg, por via subcutânea).
4. Exatamente 30 minutos após a administração de metil escopolamina, administrar aos ratos uma única injeção de pilocarpina (50 mg/kg, i.p.) para induzir o SE.
   1. A injeção de pilocarpina induz comportamento típico em animais: convulsões parciais precoces (movimentos de vibrissas e acenos de cabeça dentro de 5 minutos após a administração de pilocarpina) evoluindo para convulsões generalizadas recorrentes (SE) dentro de 25-30 min. Para ratos que não desenvolvem SE dentro de 30 min, administrar uma dose adicional de pilocarpina (25 mg/kg, i.p.) e, se ainda assim não desenvolverem SE, excluí-los do estudo (SE não respondedores).
5. Observar e pontuar o comportamento das crises em ratos a cada 5 min começando imediatamente após a injeção de pilocarpina. Use a escala de Racine para pontuar²⁷.
6. Interromper o SE 2h após o início por meio da administração i.p. de um coquetel de medicamentos: diazepam (10 mg/kg), fenobarbital (25 mg/kg) e escopolamina (1 mg/kg).
7. Dê aos ratos este coquetel novamente após 4 h. Finalmente, após mais 4 h, dê aos ratos i.p. a última mistura de drogas (diazepam 10 mg/kg mais escopolamina 1 mg/kg) a fim de parar completamente a atividade convulsiva.
8. Injetar i.p. os animais com soro fisiológico (1 mL de solução de NaCl a 0,9%, pH ajustado para 7,0) e alimentá-los com solução de sacarose a 10% por 2-3 dias após o SE para favorecer a recuperação da perda de peso corporal que se segue ao SE.
9. Atribuir aleatoriamente animais sobreviventes pós-SE a diferentes grupos experimentais de acordo com as exigências do protocolo experimental específico. Utilizar os seguintes critérios de inclusão/exclusão para experimentos posteriores em ratos epilépticos: desenvolvimento de SE convulsivo dentro de 1 h após a administração de pilocarpina, ganho de peso na primeira semana após a AE e o correto posicionamento do eletrodo na área cerebral de interesse para registros de EEG²⁵.

6. Video-EEG cativo em ratos epilépticos e análise da atividade convulsiva

NOTA: Esta seção descreve o procedimento experimental para registrar sinais de EEG em ratos unicasados e em movimento livre sob condições padrão. A gaiola não deve conter objetos onde o animal ou o cabo de gravação possam ficar presos. Dependendo da questão científica a ser abordada, vários parâmetros podem ser analisados. No caso da pesquisa de epilepsia, os traços de EEG são rastreados para reconhecer convulsões elétricas e motoras. Os parâmetros mais comuns usados para identificar uma crise são a amplitude, a frequência e a duração da atividade elétrica paroxística.

1. Coloque o animal em uma gaiola limpa na sala de gravação para permitir a habituação e reduzir o estresse induzido pelo novo ambiente. Coloque a gaiola do animal em uma gaiola de Faraday para evitar a contaminação do sinal EGG com o campo eletromagnético ambiental.
2. Conecte uma extremidade do cabo de gravação ao dispositivo de gravação. Use um voltímetro para medir o potencial elétrico e diferenciar entre eletrodos terra e de referência.
3. Conecte a outra extremidade do cabo de gravação ao eletrodo fixado na cabeça do rato. Para isso, segure a tampa de cimento na cabeça do animal ao inserir o plugue do cabo no conector do eletrodo e evite aplicar qualquer pressão na cabeça do rato.
4. Contrabalançar o peso do cabo de gravação para permitir a livre circulação do animal, evitando o risco de torcer o cabo. Para fazer isso, use um braço de contrabalanceamento ou comutadores. Mesmo que o cabo de gravação seja contrabalançado, coloque o alimento dentro da gaiola em vez de em um suporte de alimentação, no qual os animais têm que se levantar para alcançar o alimento.
5. Antes de iniciar o cadastro, verifique todas as configurações utilizadas para adquirir e processar os dados do EEG.
   NOTA: Este protocolo não fornece uma introdução ao aparelho necessário para realizar o registro do EEG, no entanto, taxas adequadas de filtragem e amostragem devem ser aplicadas para evitar artefatos e ruído nos sinais de EEG.
   1. Para um experimento de rotina, defina a taxa de amostragem em 500 Hz e o ganho de amplificação em 5000x. Filtre o sinal usando um filtro de 0,005 Hz, além de um filtro de entalhe para descartar a atividade elétrica circundante na faixa de 50 Hz (específica para países europeus).
6. Inicie as gravações de vídeo e EEG e certifique-se de que os traços correspondam a um sinal de EEG esperado, verificando a potência em bandas de frequência específicas ao longo do tempo. Registrar um período basal antes de iniciar as intervenções nos animais.
7. Verifique os animais e os traços de EEG periodicamente. Não é raro que um cabo de gravação se desprenda do conector do eletrodo na cabeça do rato. Se isso acontecer, reconecte o eletrodo na cabeça do rato a um cabo de gravação novamente e verifique se há um sinal de EEG claro.
8. Analise o sinal de EEG manual ou automaticamente usando software disponível comercialmente. Se analisar manualmente, rastreie através do registro de EEG para identificar atividades semelhantes a convulsões. Se o software for usado, configure parâmetros-chave de um evento de convulsão, como amplitude, frequência e duração da atividade elétrica.
   NOTA: A crise única pode ser caracterizada por uma atividade elétrica com uma amplitude 3x maior que a linha de base, frequência igual ou superior a 5 Hz e duração de pelo menos 5 s²².
9. Independentemente do método utilizado, confirme as possíveis crises convulsivas verificando a gravação de vídeo sincronizada coletada simultaneamente ao EEG.

7. Telemetria vídeo-EEG em ratos epilépticos e análise da atividade convulsiva

NOTA: Esta seção descreve o procedimento experimental para registrar sinais de EEG por radiotelemetria em ratos unicasados e em movimento livre sob condições padrão. O protocolo é baseado em um sistema de telemetria disponível comercialmente. No entanto, vários sistemas de telemetria diferem ligeiramente em suas especificações funcionais e técnicas. O sistema deve ser escolhido dependendo dos requisitos do laboratório e dos objetivos da pesquisa.

1. Coloque a gaiola do animal acima do receptor de sinal. Conecte o receptor de sinal ao sistema de aquisição de dados e este a um computador com o software de aquisição.
2. Ligue o implante de telemetria de radiofrequência colocando um ímã próximo ao telémetro inserido no flanco do rato. Teste o sinal usando um dispositivo de rádio. Use um dispositivo de rádio universal para testar os telemetros e ouvir um sinal sonoro claro indica que o telémetro está ativado, enquanto um som escaldante indica um telémetro inativado.
   NOTA: A vida útil da bateria do transmissor de radiofrequência deve ser levada em conta antes de definir a duração das gravações.
3. Configure o software de aquisição e sincronize o sinal de telemetria e o sistema de vídeo para adquirir simultaneamente dados de EEG e vídeo. Atribua um receptor de sinal a cada transmissor implantado e defina os valores de calibração do transmissor. Defina a taxa de amostragem em 1000 Hz, a detecção de ruído entre -500 mV e +500 mV e o intervalo de integração em 100 ms. Não utilize filtros passa-baixa e passa-alta.
4. Inicie a telemetria e as gravações de vídeo. Realizar o registro basal de longo prazo antes de adquirir a atividade epiléptica. Analise o sinal do EEG conforme descrito nas etapas 6.8 e 6.9.

8. Procedimento de coleta de sangue da veia caudal

NOTA. O sistema de coleta de sangue a vácuo consiste em uma agulha borboleta (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). A técnica de coleta de sangue pode ser facilmente realizada por um operador e o procedimento leva cerca de 5 min.

1. Cubra a agulha borboleta e sua tubulação com EDTA K₂a 1% em água destilada pouco antes da retirada, ou seja, retire e expulse a solução de EDTA K₂do sistema usando a seringa de 1 mL. Cortar a tubulação logo atrás da agulha para coletar sangue gota a gota, sem aspiração (Figura 1A).
2. Colocar o rato em uma câmara de indução e anestesiar com isoflurano (1,4% em ar; 1,2 mL/min). Mude para o quadro estereotáxico e mantenha a anestesia através de uma máscara facial. Coloque a almofada de aquecimento sob o animal, mantendo uma parte de sua cauda em contato direto com a almofada.
3. Mova suavemente as costas do animal para o lado de modo que a veia lateral da cauda seja mantida na parte superior.
4. Mergulhe a cauda em água morna (42 °C) por 2 min para dilatar a veia lateral. Limpe a cauda com etanol 70% para tornar a veia mais visível. Coloque luz quente na cauda usando uma lâmpada incandescente regular.
5. Introduza a agulha borboleta 21G na veia lateral da cauda com uma profundidade de 5 mm e um ângulo de 20°. Coletar sangue em um tubo de coleta a vácuo de 500 μL que contenha 5 mg de EDTA K₂como anticoagulante (Figura 1B,C).
6. Remova a agulha e pare o fluxo do sangue, colocando pressão no local da punção. Devolva o rato à sua gaiola de origem.
7. Inverta suavemente o tubo 10x para misturar anticoagulante no sangue. Faça furos de cerca de 1,5 cm de profundidade no gelo para acomodar os tubos de coleta. Coloque a amostra suave e verticalmente no gelo.
8. Centrifugar a amostra de sangue numa centrífuga refrigerada (4 °C) a 1300 x g durante 10 minutos para separar o plasma. Realize este procedimento dentro de 1 h no máximo.
9. Tome cerca de 200 μL de plasma, evitando a camada de glóbulos vermelhos e brancos. Colocar o plasma retirado no microtubo estéril de 0,2 mL. Se necessário, conservar a 4 °C até 1 h após a centrifugação.
10. Separar 5 μL da amostra para controle de qualidade. Conservar a amostra a -80 °C até à análise.
    NOTA: Não use o vácuo mesmo que recomendado por alguns pesquisadores²⁸ ou ordenhe a cauda durante os procedimentos descritos na etapa 8.5 para obter mais sangue, pois diminui a qualidade da amostra para as próximas análises de quantificação de sncRNA (consulte os Resultados Representativos para detalhes). Tenha em mente que, em ratos, a quantidade máxima de sangue que pode ser retirada de uma só vez é de <10% de seu volume sanguíneo total (ou seja, cerca de 1,6-1,9 mL em um rato de 250-300 g) e <15% do volume sanguíneo total (cerca de 2,64 mL) em 1 mês²⁹. Nesse protocolo, utiliza-se no máximo 500 μL de coleta de sangue em uma única ocasião por até cinco vezes em um único animal^30,31.

9. Procedimento de recolha do LCR

NOTA. A técnica pode ser facilmente realizada por um único operador, e o procedimento requer cerca de 2-4 min. Os materiais utilizados para a coleta do líquor são agulhas borboleta a vácuo de baixo custo e uso único e tubos de extração. Nesse protocolo, um conjunto de infusão com asas de borboleta conectado a uma seringa estéril é usado para criar o vácuo (Figura 2A).

1. Preparar a agulha borboleta 23G, cortando sua proteção plástica de manga para que a extremidade da agulha nua fique exposta em 7 mm para evitar que penetre mais de 7 mm de profundidade na cisterna magna durante a retirada (Figura 2B).
2. Conecte a agulha borboleta equipada com tubo de polímero a uma seringa de 1 mL.
3. Colocar o rato em uma câmara de indução e anestesiar com isoflurano (1,4% no ar; 1,2 mL/min). Mudar o fluxo de isoflurano para o quadro estereotáxico e manter a anestesia administrada através de uma máscara facial. Remova o pelo na parte traseira da cabeça e pescoço do rato com uma navalha.
4. Fixe a cabeça do rato com barras auriculares. Abaixe a cabeça do animal aproximadamente 45° verticalmente, descendo a barra do nariz do quadro estereotáxico (Figura 2C). Inspecione a cabeça traseira do animal e encontre uma superfície levemente deprimida com aspecto de losango, entre a protuberância occipital e a coluna vertebral do atlas.
5. Esfregue esta superfície com etanol 70% para torná-la mais visível e desinfetá-la.
6. Inserir a agulha borboleta verticalmente no centro da superfície deprimida em forma de losango na cisterna magna para coleta do líquor até que o movimento seja bloqueado pelo corte da proteção da agulha em manga plástica de tamanho (Figura 2D). Retire suavemente o pistão da seringa de 1 mL para deixar o LCR fluir lentamente através da agulha.
7. Coletar cerca de 100 μL do LCR em tubos de polímero (Figura 2D). Evite entrar sangue ou qualquer outra contaminação visível. Aperte o tubo de polímero muito perto da agulha borboleta e corte o tubo neste ponto.
8. Introduza a amostra límpida (não contaminada) na seringa. Descarte a amostra contaminada, se a contaminação visível entrar na tubulação de coleta.
9. Expelir a amostra para o microtubo estéril de 0,2 ml e conservar no gelo até 1 h.
10. Desinfetar o local de retirada do líquor na cabeça do animal. Retire o rato da estrutura estereotáxica e coloque-o de volta em sua gaiola.
11. Separar 2 μL da amostra para controlo de qualidade. Conservar o resto da amostra a -80 °C para análise posterior.
    NOTA: Em ratos, se várias retiradas de LCR forem realizadas repetidamente, o volume recomendado a ser retirado em cada coleta é de 100 μL³². Nesse protocolo, foi realizado um máximo de 100 μL de LCR em uma única ocasião com retirada máxima de 5x em 15 dias em um único animal.

10. Análise espectrofotométrica da qualidade da amostra

NOTA: Após a coleta adequada de amostras de líquor e plasma, as amostras estão prontas para análises em espectrofotômetro e não requerem nenhum manuseio específico. Medir a absorbância da hemoglobina por espectrofotometria UV a 414 nm para avaliar o risco de hemólise em amostras. Utilizar um valor de absorbância de corte de 0,25 em amostras de ratos. A escolha desse limite pode depender da análise subsequente de qPCR e de seus requisitos específicos para quantificação de sncRNAs.

1. Ligue o espectrofotômetro UV. Selecione o método para a medição da absorbância em um único comprimento de onda de 414 nm para PLASMA ou CSF. Clique em Avançar.
2. Enxágue a cubeta de 1 mm com água purificada. Coloque 5 μL de etanol 70% no ponto de medição da cubeta. Seque com um papel toalha e esfregue com papel higiênico sem fiapos. Verifique se é perfeitamente transparente.
3. Coloque 1,5 μL de água purificada na cubeta de 1 mm e feche-a. Insira a cubeta na câmara de medição do espectrofotômetro e meça a absorvância da amostra em branco clicando no botão Em branco . Verifique se o valor de absorbância a 414 nm é 0,000.
4. Seque a cubeta com um papel toalha e limpe-a com papel de seda sem fiapos. Verifique se é perfeitamente transparente.
5. Colocar 1,5 μL da amostra na cubeta de 1 mm e fechá-la. Insira a cubeta na câmara de medição do espectrofotômetro. Meça a amostra, clicando no botão Amostra . Verificar a absorvância da amostra a 414 nm e anotá-la.
6. Proceder à quantificação da absorbância da hemoglobina em todas as amostras disponíveis. Meça a amostra em branco antes de qualquer amostra de plasma ou LCR, clicando alternativamente nos botões Em branco e Amostra .
7. Conservar as amostras com A414 nm < 0,25 a -80 °C e eliminar as amostras se A414 nm > 0,25.
8. Enxágue a cubeta de 1 mm com água purificada e etanol 70%, sequencialmente. Seque a cubeta.
9. Feche a cubeta vazia na câmara de medição para evitar a sua pulverização. Desligue o espectrofotômetro.

O resultado de diferentes procedimentos de retirada de sangue e LCR realizados em 9 ratos controles e 18 ratos epilépticos crônicos, todos implantados com eletrodos 1 mês após SE, é relatado em termos de taxa de sucesso. Após o implante, todos os ratos foram monitorados por vídeo-EEG por 1 mês, durante o qual o LCR mais sangue foi retirado 5x a cada 3 dias durante as duas últimas semanas do experimento (ou seja, nos dias 52, 55, 58, 61 e 64 pós-SE; dpSE). Os dados de múltiplas retiradas em diferentes animais foram utilizados para comparar a taxa de sucesso da coleta de LCR nos ratos dotados de implante de cabeça dupla (canulados para retirada de LCR) com a taxa de sucesso da coleta de LCR (realizada por punção da cisterna magna) em apenas eletrodos cativos ou de telemetria implantados (Tabela 1). Em diferentes animais, avaliou-se o impacto da coleta de sangue a vácuo ou da ordenha de cauda na qualidade das amostras de plasma (Tabela 2). Para isso, a espectrofotometria UV a 414 nm foi utilizada para a detecção de hemoglobina livre. Para as análises estatísticas, utilizou-se software comercial e Kruskal-Wallis ou ANOVA one-way com testes post-hoc de comparações múltiplas de Tukey (p<0,05 considerado estatisticamente significativo). Os dados foram expressos em média ± EPM.

Taxa de sucesso de múltiplas amostras de LCR em ratos canulados e puncionados
O LCR foi amostrado 5x dentro de 2 semanas em 3 grupos de ratos: (i) ratos canulados e amarrados implantados com eletrodo (grupo CT de animais); nestes, a retirada do LCR foi realizada por meio de cânula guia simulada e articulação da tubulação de PTFE para seringa de 1 mL quando não anestesiados e em movimento livre sob vídeo-EEG; (ii) ratos com eletrodo puncionado (passo 9) e cativo (grupo PT); (iii) ratos puncionados e eletrodos de telemetria implantados (grupo PTe). Foram utilizados 9 animais por grupo (6 epilépticos e 3 controles). O número de coletas bem-sucedidas foi avaliado em 5 vezes. A taxa de sucesso foi semelhante nos ratos puncionados: 86,7% ± 5,8% nos ratos cativos e 88,9% ± 4,8% nos animais implantados com eletrodo de telemetria. Em vez disso, nos ratos canulados, a taxa foi reduzida, embora não significativamente diferente (71,1% ± 8,9%, Tabela 1). Tais resultados indicam que a cânula na cabeça dos animais pode interferir em repetidas coletas de líquor e comprometer estudos longitudinais. A técnica de punção é mais indicada para múltiplas retiradas liquóricas em eletrodos implantados em animais.

Impacto da ordenha a vácuo e de cauda no método de coleta de plasma
O sangue foi coletado 5x de 9 ratos (6 epilépticos e 3 controles) aos dias 52, 55, 58, 61 e 64 pós-SE e a qualidade do plasma foi avaliada para hemólise visual e por espectrofotometria UV a 414 nm. Para a obtenção da primeira amostra em cada rato, foi utilizada a retirada do vácuo por meio de agulha borboleta 21G acoplada a seringa de 1 mL. Com a segunda amostra, o sistema de retirada de gotas e agulha borboleta 21G foi empregado na ordenha da cauda simultaneamente. Para a obtenção da 3ª a 5ª amostra, foi utilizado o procedimento de retirada das gotas sem ordenha da cauda (descrito no passo 9).

Quando empregado vácuo, o plasma foi corado de rosa sob a inspeção visual, e o valor médio de absorbância das amostras de 9 ratos foi de 0,647 ± 0,067 (Tabela 2, Figura 3). Resultados semelhantes foram obtidos se empregada a ordenha de cauda durante o procedimento: plasma róseo com absorbância média de 0,620 ± 0,043 (Tabela 2, Figura 3). Em contraste, com a retirada de gotas habilitada por gravidade e o sistema de agulha borboleta 21G, os valores médios de absorbância plasmática foram significativamente reduzidos (0,226 ± 0,017 a 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 a 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 a 64 dpSE; Tabela 2, Figura 3) com relação ao método de ordenha a vácuo ou de cauda. Além disso, as amostras de plasma em gota foram principalmente transparentes. Maiores valores de absorbância (52 e 55 dpSE) correlacionaram-se com a cor rosa das amostras (dados não mostrados). Estes resultados podem sugerir que o último método é o melhor para obter amostras de altíssima qualidade para análises.

Figura 1: Principais etapas do fluxo de trabalho de amostragem de plasma. (A) Materiais necessários para retirada de sangue e rato no quadro estereotáxico, pronto para coleta; (B, C) Aumentos da cauda com agulha borboleta 21G inserida na veia lateral da cauda e a gota de sangue caindo pelas paredes do tubo de coleta com um anticoagulante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Principais etapas do fluxo de trabalho de amostragem do líquido cefalorraquidiano (LCR). (A) Materiais necessários para a retirada do líquor e rato no quadro estereotáxico, pouco antes da coleta; (B) A preparação da agulha borboleta 23G cortando sua proteção de manga plástica de modo que a extremidade da agulha nua fique exposta por 7 mm para garantir a penetração correta na cisterna magna; (C) A cabeça do rato é inclinada para baixo em 45° durante a retirada. (D) Ampliação no local romboide com agulha borboleta inserida na cisterna magna. Observe o líquor que sobe na tubulação, indicado pela ponta do marcador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação da qualidade das amostras de plasma. Grau de hemólise medido a 414 nm para hemoglobina livre por espectroscopia UV em amostras de plasma de 9 animais em 5 momentos (52, 55, 58, 61 e 64 dias pós-estado de mal epiléptico, dpSE) usando diferentes métodos: dia 52 - técnica a vácuo; dia 55 - ordenha da cauda; dias 58-64 as técnicas de gota foram empregadas. A diminuição da hemoglobina livre no plasma obtida pela técnica de gotejamento em relação aos métodos de ordenha a vácuo e de cauda foi significativa (*p <0,05 de acordo com ANOVA one-way e teste post-hoc de comparações múltiplas de Tukey). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Taxas de sucesso das retiradas de LCR. Comparação das taxas de sucesso da retirada repetida do LCR em três grupos experimentais de animais expressas como uma porcentagem de retiradas bem-sucedidas ao longo de 5 dias. O valor 1 foi atribuído à retirada bem-sucedida de > 100 μL de líquor claro; o valor zero foi atribuído às retiradas < 100 μL e/ou de LCR não esclarecido. Abreviaturas: N/A - ausência de coleta devido à perda da cânula durante o procedimento de amostragem (somente animais TC); TC - canulado amarrado; PT - puncionado amarrado; PTe - eletrodos de telemetria puncionados implantados. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Avaliação da hemólise em amostras de plasma. Resultados das medidas de hemólise em 5 momentos utilizando três diferentes métodos de coleta de sangue: dia 52 - técnica a vácuo; dia 55 - ordenha da cauda; dias 58-64 as técnicas de queda. Os valores >0,3 de absorbância correlacionaram-se com a cor rosa das amostras. Clique aqui para baixar esta tabela.

Os autores não têm nada a revelar.