O protocolo mostra repetidas coletas de líquido cefalorraquidiano e sangue de ratos epilépticos realizadas em paralelo com a monitorização contínua por vídeo-eletroencefalograma (EEG). Estes são instrumentais para explorar possíveis ligações entre alterações em várias moléculas de fluido corporal e atividade convulsiva.
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Artigo de método
Amostragem de líquido cefalorraquidiano e sangue da veia lateral da cauda em ratos durante registros de EEG
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como a composição dos fluidos corporais reflete muitas dinâmicas fisiológicas e patológicas, amostras líquidas biológicas são comumente obtidas em muitos contextos experimentais para medir moléculas de interesse, como hormônios, fatores de crescimento, proteínas ou pequenos RNAs não codificantes. Um exemplo específico é a amostragem de líquidos biológicos na pesquisa de biomarcadores para epilepsia. Nesses estudos, é desejável comparar os níveis de moléculas no líquido cefalorraquidiano (LCR) e no plasma, retirando o LCR e o plasma em paralelo e considerando a distância temporal da amostragem de e para as convulsões. A coleta combinada de LCR e plasma, juntamente com o monitoramento por vídeo-EEG em animais epilépticos, é uma abordagem promissora para a validação de biomarcadores diagnósticos e prognósticos putativos. Neste artigo, descreve-se um procedimento de retirada combinada de LCR da cisterna magna e coleta de sangue da veia lateral da cauda em ratos epilépticos monitorados continuamente por vídeo-EEG. Este procedimento oferece vantagens significativas em relação a outras técnicas comumente utilizadas. Permite amostragem rápida com o mínimo de dor ou invasividade e tempo reduzido de anestesia. Além disso, ele pode ser usado para obter amostras de LCR e plasma em ratos registrados no EEG cativo e por telemetria, e pode ser usado repetidamente ao longo de vários dias de experimento. Ao minimizar o estresse devido à amostragem por meio do encurtamento da anestesia com isoflurano, espera-se que as medidas reflitam com mais precisão os verdadeiros níveis das moléculas investigadas em biofluidos. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico apropriado, essa técnica pode ser usada para medir os níveis de múltiplas moléculas diferentes ao mesmo tempo em que se realiza o registro do EEG.
Introdução
O líquido cefalorraquidiano (LCR) e a coleta de sangue são importantes para identificar e validar biomarcadores de epilepsia, tanto em pesquisas pré-clínicas quanto clínicas 1,2. Atualmente, o diagnóstico de epilepsia e a maioria das pesquisas sobre biomarcadores de epilepsia concentram-se no EEG e na neuroimagem 3,4,5. Essas abordagens, no entanto, apresentam várias limitações. Além das medidas rotineiras do couro cabeludo, o EEG requer, em muitos casos, técnicas invasivas como eletrodos de profundidade
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Ferrara e pelo Ministério da Saúde italiano (autorização: D.M. 603/2022-PR) de acordo com as diretrizes delineadas na Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos. Este protocolo é especificamente ajustado para análises adicionais da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) de pequenos ácidos ribonucleicos não codificantes (sncRNAs) no LCR e plasma de ratos obtidos sob controle de EEG em animais epilép....
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Resultados
O resultado de diferentes procedimentos de retirada de sangue e LCR realizados em 9 ratos controles e 18 ratos epilépticos crônicos, todos implantados com eletrodos 1 mês após SE, é relatado em termos de taxa de sucesso. Após o implante, todos os ratos foram monitorados por vídeo-EEG por 1 mês, durante o qual o LCR mais sangue foi retirado 5x a cada 3 dias durante as duas últimas semanas do experimento (ou seja, nos dias 52, 55, 58, 61 e 64 pós-SE; dpSE). Os dados de múltiplas retiradas em diferentes animais foram utiliz.......
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Discussão
O presente trabalho ilustra uma técnica fácil de dominar de coleta de líquor e sangue em ratos, que pode ser útil não apenas para estudos em modelos de epilepsia, mas também de outras condições neurológicas ou doenças como Alzheimer, Parkinson ou esclerose múltipla. Na pesquisa em epilepsia, ambos os procedimentos de amostragem acoplados ao vídeo-EEG são ideais quando se busca uma correlação entre os níveis de diferentes moléculas solúveis e a atividade convulsiva. Por esse motivo específico, foi empregada a gravação con.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por uma subvenção do Programa de Trabalho Horizonte 2020 da União Europeia (convite à apresentação de propostas H2020-FETOPEN-2018-2020) ao abrigo da convenção de subvenção 964712 (PRIME; a M. Simonato).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Conjunto de coleta de sangue BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milão, Itália | 367246 | Material |
| Tubos de coleta de sangue (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milão, Itália | 365975 | Material |
| Conjunto de infusão com asas de borboleta 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japão | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrífuga refrigerada ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, Inglaterra | 112000033 | Material |
| Sutura de algodão 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, EUA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Itália | 105183014 (AIC) | Solução |
| Sistema de gravador de mídia de 8 canais de vídeo digital de telemetria EEG configurado | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EUA | PNM-VIDEO-008 | Equipamento |
| Sistema de vigilância por vídeo digital de configuração | de EEG amarradoEZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Desinfetante de equipamento |
| à base de peróxidos estabilizados e atividade de amônio quaternário | Laboratoire Garcin-Bactinyl, França | LB 920111 | Solução |
| Cânula guia fictícia 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Suécia | CXD-8 | Material |
| Eletrodo 3 canais de duas torções | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virgínia, EUA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Suporte de eletrodo para cirurgia estereotxica | Agn Tho's, Lindigö, Suécia | 1776-P1 | |
| Equipamento Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0,2 mL | Eppendorf Srl, Milão, Itália | 30124332 | Material |
| Eppendorf μ Cubeta G1.0 | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 6138 | |
| Equipamento Agulha de alimentação flexível 17G para ratos | Agn Tho's, Lindigö Suécia | 7206 | Material |
| Grass Technology aparelho | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Califórnia, EUA | M665G08 | Equipamento (amplificador AS40, caixa de cabeça, cabos de interconexão, telefator modelo RPSA S40) |
| Isoflurano 100%, IsoFlo | Zoetis, Roma, Itália | 103287025 (AIC) | Solução |
| Cetamina (Imalgene) | Merial, Toulouse, França | 221300288 ( AIC) | Solução |
| Cloreto de lítio | Sigma-Aldrich, Milão, Itália | L9650 | Material |
| Cânula de microinjeção 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Suécia | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular aquisição de dados e sistema de análise | Biopac, Goleta, Califórnia, EUA | MP150WSW | Equipamento |
| Pomada veterinária oftálmica, Hylo night | Ursapharm, Milão, Itália | 941791927 (AIC) | Material |
| Cloridrato de pilocarpina | Sigma-Aldrich, Milão, Itália | P6503 | Material |
| Tubo de PTFE com junta | Agn Tho's, Lindigö, Suécia | JT-10 | Material |
| Solução salina | 0,9% NaCl, pH ajustado para 7.0 | Solução | |
| Bromidrato de escopolamina trihidratado | Sigma-Aldrich, Milão, Itália | S2250 | Material |
| Nitrato de metila de escopolamina | Sigma-Aldrich, Milão, Itália | S1876 | Material |
| Prata Creme de sulfadiazina 1% | Sofar, Trezzano Rosa, Milão, Itália | 025561010 (AIC) | Material |
| Cimento metacrílico dental rápido simplex | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Reino Unido | ACR811 | Material |
| Aparelho estereotáxico | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, EUA | Modelo 963 | Equipamento |
| Solução de sacarose | 10% de sacarose em água destilada | Solução | caseira |
| Seringa 1 mL | Biosigma,, Venezia, Itália | 20,71,26,03,00,350 | Telémetros de materiais |
| Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EUA | CTA-F40 | ||
| Analisador de traços de EEG de telemetria | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EUA | NeuroScore v3-0 | Sistema |
| telemetria | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, EUA | Hardware mais software Ponemah núcleo 6.51 | Equipamento |
| Cloridrato de xilazina | Sigma-Aldrich, Milão, Itália | X1251 | Material |
Referências
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dl....
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Reimpressões e permissões
