Modelo de Metástase de Linfonodo Drenante para Avaliação da Dinâmica de Células T CD8⁺ Antígeno-Específicas Durante a Tumorigênese

A imunoterapia do câncer, especialmente o bloqueio do ponto de verificação imune (ICB), revolucionou a terapia do câncer¹. O ICB bloqueia os imunorreceptores coinibitórios (como PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), que são altamente expressos em células T CD8⁺ esgotadas no microambiente tumoral (TME), levando ao revigoramento^{de células T} CD8⁺ esgotadas2. Considerando a heterogeneidade das células T CD8⁺ esgotadas, evidências acumuladas revelaram que células T CD8⁺ tumor-específicas derivadas da periferia, incluindo linfonodos drenantes (dLN), mas não na EMT, medeiam a eficácia do ICB3,4,5,6,7,8. Recentemente, confirmou-se que as células T CD8⁺ de memória específicas de TdLN TCF-1^{+TOX (}TdLN-T_TSM) são os verdadeiros respondedores ao ICB, que incorporam várias propriedades funcionais das células T de memória convencionais e podem expandir e diferenciar-se em células exaustas de progênie após o tratamento com ICB⁹. Em conjunto, esses achados corroboram a importância do NL na montagem da imunidade antitumoral.

O linfonodo funciona como um local crítico na facilitação do priming e ativação de células T CD8⁺ tumor-específicas, fornecendo base estrutural e sinais biológicos¹⁰. Vários tipos de células cancerosas frequentemente semeiam linfonodo sentinela (LS, o primeiro LN drenando um tumor primário) antes da disseminação^{sistemática11}. A presença de metástase no LS está associada a pior evolução no câncer humano e modelos pré-clínicos mostraram que as células tumorais no TdLN poderiam se espalhar para órgãos distantes através dos vasos linfáticos e sanguíneos do nódulo 12,13,14,15. A biópsia do LS representa agora um procedimento padrão para orientar decisões subsequentes de tratamento em muitos tipos de tumores sólidos, o que poderia evitar a ressecção desnecessária de NL não comprometido^16,17. Mesmo para o LN envolvido, permanece controverso se e quando a ressecção cirúrgica é necessária, pois vários estudos demonstraram que a remoção do NL regional não apresentou melhora na sobrevida global em comparação com aqueles que receberam radioterapia ou terapia sistêmica sem ressecção regional do NL ^18,19. Uma interpretação é que o LN metastático (mLN) com doença microscópica pode reter alguma capacidade de educar células imunes e fornecer alguns benefícios terapêuticos. Assim, é extremamente importante elucidar como a metástase de LN afeta a resposta imune antitumoral, especialmente as propriedades e funções da_TSM TdLN-T.

Até o momento, tanto os dados pré-clínicos quanto clínicos têm revelado algumas alterações estruturais e celulares no mLN²⁰. No entanto, as alterações dinâmicas das células T CD8⁺ tumor-específicas durante a metástase de NL não foram delineadas. Portanto, o desenvolvimento de um modelo convincente de metástase de NL é necessário para uma investigação mais aprofundada. De fato, vários estudos relataram modelos de camundongos mLN de diferentes maneiras 14,21,22. Por exemplo, metástases espontâneas em LNs axilares foram realizadas através do implante de células de câncer de mama 4T1 no coxim gorduroso^{mamário 22}. Em outro estudo, Reticker-Flynn e col. geraram linhagens celulares de melanoma com alta incidência de disseminação do tumor primário subcutâneo para LNs por meio da inoculação seriada de células tumorais cultivadas a partir de tecidos mLN dissociados (nove rodadas)¹⁴. Outro modelo comumente utilizado foi preparado pela injeção de células tumorais no coxim plantar e os loci metastáticos seriam formados no LN poplíteo²². Notadamente, é difícil avaliar os momentos precisos de intervenção, pois a metástase de NL nesses modelos nem sempre é fiel.

No presente estudo, um modelo metastático de LN murino foi estabelecido através da injeção intranodal de células B16F10-GP^23,24, geradas pela inserção mediada por CRISPR/Cas9 da sequência gênica da glicoproteína (GP) do vírus LCMV no genoma da linhagem celular B16F10 9. Em seguida, esses camundongos foram transferidos com células P14 que abrigam receptores transgênicos de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o epítopo H-2D^b GP_33-41 ^25,26 e a dinâmica sistêmica e local de células T CD8⁺ antígeno-específicas durante metástases de NL pôde ser investigada. Nosso desenho experimental fornece um modelo útil para o estudo das respostas imunes, especialmente das células T CD8⁺ antígeno-específicas durante a metástase do LN, o que exclui a perturbação das células T CD8⁺ circunstantes. Esses resultados afetariam as opções de tratamento clínico de remover ou reter o mLN e lançariam uma nova luz sobre a manipulação do mLN para alcançar o máximo de benefícios terapêuticos.

Os camundongos C57BL/6J (referidos a camundongos B6) e os camundongos transgênicos P14 virgens ^9,27 utilizados tinham de 6 a 10 semanas de idade, pesando 18-22 g. Homens e mulheres foram incluídos sem randomização ou cegamento. Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Agrícola de Qingdao.

1. Preparação do meio e dos reagentes

1. Preparar meio de cultura de células de melanoma B16F10-GP, denominado D10 (meio DMEM completo) adicionando DMEM, soro fetal bovino (SFB) a 10%, penicilina/estreptomicina a 1%, L-glutamina a 1% com mais 100 U/mL de puromicina. Manter um D10 estéril e armazenar por até 2 semanas a 2-4 °C.
2. Preparar meio R2 (para término da lise de hemácias) adicionando RPMI-1640 com SFB a 2%, penicilina/estreptomicina a 1% e L-glutamina a 1%.
3. Preparar tampão de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) adicionando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 2% de FBS e 0,01% de azida de sódio. A adição de azida sódica pode prolongar o tempo de armazenamento do tampão FACS, que pode ser armazenado por meses a 2-4°C.
4. Preparar tampão de lise de hemácias (RBL) adicionando 155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ e 0,1 mM de ácido etilenodiamino tetracético (EDTA) em água destilada dupla e ajustar seu pH para 7,3. Armazenar o tampão RBL à temperatura ambiente (TR) e ele permanece estável por até 3 meses.
5. Preparar o anestésico 2,2,2-tribromoetanol, conforme descrito abaixo.
   1. Pesar a quantidade adequada de cristal de 2,2,2-tribromoetanol em um tubo cônico estéril de 50 mL envolvido com papel alumínio. Adicionar uma quantidade adequada de 2-metil-2-butanol no cristal para preparar a solução-mãe na concentração de 500 mg/ml.
   2. Agite-o para misturar e aquecer o tubo em banho-maria a 37 °C até que o cristal esteja dissolvido. Certifique-se de que todos os cristais estão dissolvidos.
   3. Misture bem a solução. Filtrar a solução-mãe com um filtro de 0,22 μm para um recipiente estéril. Conservar a solução-mãe congelada, protegida da luz, a -20 °C ou diluir com PBS numa solução de trabalho na concentração de 12,5 mg/ml e armazenada a 4 °C.
      NOTA: É melhor usar a concentração prescrita, pois concentrações mais altas do líquido são irritantes.

2. Preparação da suspensão de células B16F10-GP

1. Descongelar e cultivar um frasco de 1 x 10⁶ células B16F10-GP com 5 mL de D10 em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% CO₂. Células de subcultura quando atingiram 80% a 90% de densidade conforme descrito a seguir.
   1. Descarte o meio de cultura original por aspiração com pistola de pipetagem e lave as células 2x com PBS. Ao limpar as células aderentes com PBS em uma placa de cultura celular, mova o PBS para a parede lateral ou solte-o na placa.
   2. Após aspiração de PBS, adicionar 0,5-1 mL de solução de EDTA de tripsina a 0,25% à placa de cultura celular ou ao frasco. Agite suavemente para cobrir toda a superfície celular. Colocar a placa ou o balão de cultura celular numa incubadora a 37 °C durante cerca de 1 min ou em RT até que as células sejam arredondadas e separadas. Observe a esfoliação das células com a ajuda de um microscópio invertido.
   3. Adicione igual volume de D10 recém-formulado para terminar a digestão de tripsina. Purgar a superfície inferior do frasco de cultura celular com uma pistola de pipetagem para garantir que todas as células foram separadas.
   4. Transfira a suspensão da célula B16F10-GP para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 163 x g por 4 min em RT.
   5. Aspirar o sobrenadante e descartar. Ressuspender as células em 1-2 mL de D10 para precipitação. Transferir a suspensão de células B16F10-GP para uma nova placa ou frasco de cultura celular contendo 8-10 mL de D10 e, em seguida, incubar em uma incubadora celular a 37 °C a 5% CO₂.
2. No dia da implantação do tumor, coletar células B16F10-GP com densidade de aproximadamente 90%, conforme descrito nas etapas 2.1.1 a 2.1.4. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e descartar. Ressuspender o precipitado celular em 1 mL de PBS.
3. Conte as células viáveis usando um hemocitômetro de azul de tripano a 0,4%. Adicione PBS para diluir a célula a 5 x 10⁵ células por 100 μL. Coloque as células no gelo até usar.

3. Inoculação ectópica de células B16F10-GP na região inguinal bilateral de camundongos

1. Aspirar 100 μL de suspensão de células B16F10-GP preparadas com uma seringa de 1 mL. Agite a parede do tubo para mover as bolhas para o topo e empurre o pistão para mover a bolha superior para fora.
2. Segure o rato em decúbito dorsal, expondo o seu abdómen. Pressione o membro posterior direito do mouse na posição supina com um dedo para que a pele na região inguinal direita fique totalmente exposta (O mesmo com a região inguinal esquerda).
3. Retire o pelo do abdômen com creme depilatório e, em seguida, limpe a área bilateral do abdome com algodão contendo etanol 75%.
4. Antes de inserir a agulha, certifique-se de que a pele na região inguinal está apertada. Insira a agulha em um ângulo de 45° no espaço subcutâneo da região inguinal da parte superior da coxa. Certifique-se de que a agulha está chanfrada para cima e a profundidade da agulha para 0,5-1 cm.
5. Aplique sucção suave antes da injeção, se não houver sangue, injete as células lentamente injetadas no tecido subcutâneo. Ao mesmo tempo, observe um pequeno bolus (formação de bolsa de líquido) na região subcutânea.
6. Após a injeção, remova a agulha, coloque-a na caixa de materiais perfurocortantes e devolva o rato à sua gaiola.

4. Transferência adotiva de células T P14 para camundongos portadores de tumor

1. Realizar transferência adotiva em camundongos portadores de tumor 6-8 dias após a implantação do tumor, quando os tumores são palpáveis (aproximadamente 3-5 mm de diâmetro). Injetar 4 mg de ciclofosfamida por via intraperitoneal no dia anterior à transferência 28,29,30.
   NOTA: O objetivo da injeção de CTX é criar espaço no compartimento linfático para células T transferidas por adoção, eliminando transitoriamente linfócitos em proliferação.
2. Isolar linfócitos do baço e LNs de camundongos transgênicos P14 virgens conforme descrito abaixo^31,32 (6-10 semanas de idade, o mesmo sexo de camundongos portadores de tumor para evitar problemas de rejeição).
   NOTA: Execute os seguintes procedimentos em um gabinete de biossegurança para garantir condições estritamente estéreis.
   1. Prepare dois pratos de 6 cm e adicione 3 mL de meio R2 a um dos pratos e 3 mL de tampão RBL ao outro prato. Coloque um filtro de células de 70 μm na placa de Petri contendo tampão RBL.
   2. Eutanásia de camundongos P14 em recipientes herméticos contendo isoflurano seguido de deslocamento cervical. Ajuste o número de camundongos P14 de acordo com o número de camundongos receptores.
   3. Colher os linfonodos baço, inguinal e axilar dos camundongos eutanasiados e transferi-los para placas de 6 cm contendo 4 mL de meio R2 e colocadas sobre gelo.
   4. Coloque o baço em um coador embebido com 3 mL de tampão RBL, triture o baço com o putter dentro da seringa de 1 mL. Incubar as células em RT por 1-2 min e, em seguida, terminar a reação com 3 mL de meio R2 frio.
   5. Triture os LNs com o putter dentro da seringa de 1 mL até que apenas o tecido conjuntivo permaneça no filtro com um filtro de células de 70 μm. Enxaguar o filtro com meio R2 frio e transferir a suspensão celular para um novo tubo centrífugo de 15 mL. Centrifugar as amostras a 500 x g durante 6 min a 4 °C.
   6. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células com 3 mL de PBS. Use um filtro de células de 70 μm para remover o material floculante da suspensão celular.
   7. Centrifugar a suspensão celular a 500 x g durante 6 min a 4 °C. Ressuspender as células com 3 mL de PBS e colocar o tubo sobre gelo. Pegue uma pequena amostra, misture com azul de tripano e conte as células usando uma placa de contagem de células sanguíneas.
3. Determinar a porcentagem de células P14 ⁽CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺ vivas/mortas) por citometria de fluxo. Certifique-se de que as células doadoras transferidas exibam marcadores congênicos distintos com camundongos receptores (camundongos B6 portadores de tumor é CD45.2⁺). Realizar coloração antes da transferência para verificar o fenótipo correto das células transferidas.
   1. Adicionar 5 x 10⁴- 1 x 10⁵ células a um tubo de centrífuga de 1,5 ml contendo 1 ml de tampão FACS. Centrifugar a suspensão celular a 500 x g a 4 °C durante 3 min.
   2. Descarte o sobrenadante, mexa no fundo do tubo para dispersar as células e coloque o tubo sobre gelo.
   3. Preparar a seguinte mistura de anticorpos conjugados ^9,32 diluída em 100 μL de tampão FACS: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Mancha viva/morta, 1:400. (Tabela de Materiais).
   4. Centrifugar a mistura de anticorpos a 15.000 x g por 3 min para agregar as partículas. Coloque a mistura sobre o gelo e proteja-a da luz, envolvendo-a em papel alumínio. Só tome o sobrenadante para evitar a aspiração de partículas.
   5. Ressuspenda as células em 100 μL da mistura de anticorpos e misture completamente agitando a parede do tubo. Depois de envolver em papel alumínio, incube o tubo por 30 min sobre gelo.
   6. Lave as células 2x com tampão FACS. Centrifugar o tubo a 500 x g a 4 °C durante 3 min. Ressuspender as células com 200 μL de tampão FACS e transferir a suspensão celular para um tubo de fluxo.
   7. Executar o tubo de fluxo com células coradas em um citômetro de fluxo para determinar a porcentagem de células CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺ vivas^/mortas.
      NOTA: Geralmente, mais de 90% das células T CD8⁺ de camundongos transgênicos P14 abrigavam Vα2⁺TCRs, que são específicos para o epítopo H-2D^b GP_33-41 do LCMV (vírus da coriomeningite linfocítica).
4. Calcular o número absoluto de células CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺ vivas^/mortas multiplicando a sua percentagem e o número de células vivas obtido nos passos 4.2 e 4.3.
5. Aspirar 200 μL de P14 (5 x^{10 5} células) de suspensão com uma seringa de insulina de 100 U e remover bolhas. O número inicial de células P14 virgens transferidas (5 x 10³ - 5 x 10⁵) não afetou o fenótipo das células transferidas⁹.
6. Coloque os ratos em uma gaiola e aqueça com uma lâmpada infravermelha por 5-10 min para expandir a veia da cauda. Segure no lugar com um fixador de mouse de tamanho adequado, endireitar a cauda e limpá-la com uma bola de algodão contendo etanol 75% para tornar as veias visíveis.
7. Insira a agulha paralela à veia da cauda e puxe suavemente o êmbolo. Se houver sangue fluindo para a seringa, empurre lentamente a suspensão celular para a veia.
   NOTA: Se houver resistência ou inchaço da cauda durante a injeção, a posição de injeção precisa ser ajustada. O local de injeção deve começar na extremidade distal.
8. Após a conclusão da injeção, puxe a agulha rapidamente e pressione o local de injeção suavemente com uma bola de algodão. Retorne o mouse para uma nova gaiola limpa e observe-o de perto por vários minutos para quaisquer efeitos adversos.

5. Ressecção do tumor primário

NOTA: Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos sejam autoclavados antes do uso. Esterilizar a área de operação dentro da cabine de biossegurança com etanol 75%, seguido de irradiação UV por pelo menos 30 min. Use aventais, chapéus, máscaras e luvas estéreis durante a cirurgia.

1. Quando o tumor for palpável (aproximadamente 5 mm de diâmetro), ressecção do tumor primário.
2. Anestesiar os camundongos com injeção intraperitoneal de Cetamina (75 mg/kg). Pinça o pé para avaliar o grau de anestesia, se não houver reflexo de dor, indica o momento certo para a cirurgia. Se os membros posteriores foram retirados, fornecer outra dose de 10-30 μL.
   NOTA: Alternativamente, medetomidina intraperitoneal (1 mg/kg de peso corporal; Domitor) é recomendado para anestesiar camundongos.
3. Aplique a pomada preventiva de secagem nos olhos dos ratos. Remova os pelos do abdômen com creme depilatório para expor totalmente o campo cirúrgico.
4. Coloque o mouse em um armário de biossegurança e coloque-o em uma placa anatômica coberta com papel absorvente limpo em posição supina de modo que o eixo longitudinal do mouse fique paralelo ao experimentador.
   OBS: Para manter um ambiente rigorosamente estéril, os seguintes procedimentos devem ser realizados em um gabinete de biossegurança.
5. Desinfete o abdômen dos camundongos com uma bola de algodão embebida em iodopovidona. Incisar a pele perto do local portador do tumor com bisturi estéril ou tesoura oftálmica. Insira a ponta da tesoura fechada na incisão para expor claramente o tumor. Ao incisar a pele, certifique-se de não danificar os gânglios linfáticos inguinais.
6. Durante a remoção do tumor, mantenha a cápsula o mais intacta possível. Remover cuidadosa e suavemente o tecido conjuntivo adjacente ao tumor com tesoura estéril. Remova o tumor in situ completamente, caso contrário, ele pode recorrer.

6. Injeção intranodal de células B16F10-GP no linfonodo inguinal

NOTA: Após a eliminação bilateral do tumor, as células B16F10-GP foram injetadas no linfonodo inguinal unilateral e a PBS foi injetada no outro lado.

1. Aspirar 20 μL (5 x 10⁴ células) de suspensão celular B16F10-GP com uma seringa de insulina 100 U, remover bolhas e, em seguida, injetar em um linfonodo inguinal. Injete um volume igual de PBS no linfonodo inguinal do outro lado.
   1. Durante a injeção, insira a agulha a partir da extremidade distal do linfonodo e, em seguida, insira lentamente a agulha no centro do linfonodo. Neste momento, se o fluido é injetado com precisão no linfonodo, o linfonodo pode ser visto para inchar significativamente.
      NOTA: Quando a agulha é inserida a partir da extremidade distal do linfonodo, certifique-se de não puncionar o nódulo.
2. Sutura da incisão com 2-3 pontos com sutura 3-0. Desinfete a pele ao redor da ferida com algodão impregnado com iodopovidona. Tome cuidado para contornar os gânglios linfáticos durante a sutura.
3. Coloque o rato numa gaiola limpa e mantenha-se aquecido utilizando luz infravermelha na posição de decúbito lateral. Monitore continuamente até que a consciência seja recuperada. Certifique-se de que os ratos que foram submetidos à cirurgia não sejam devolvidos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
4. Dê buprenorfina a cada 4-6 h por 3 dias consecutivos após a operação para aliviar a dor pós-operatória (em uma dose de 0,1-0,5 mg/kg, SQ ou IP). Monitore as áreas de alimentação, bebida, movimento e atividade dos ratos. Normalmente, os ratos se recuperam do trauma cirúrgico dentro de 3 dias.
   NOTA: Se os ratos não conseguirem retomar a alimentação e as atividades normais e apresentarem quaisquer sinais de infecção, consulte um veterinário para intervenção ou eutanasie-o.
5. Sacrificar camundongos em diferentes momentos: dia 8 e dia 18 após injeção intranodal de células tumorais. Recuperar células de doadores ativadas usando análise de citometria de fluxo.

O diagrama esquemático deste desenho experimental é mostrado na Figura 1A. Um total de 5 x 105 células B16F10-GP em 100 μL de PBS foram implantadas por via subcutânea (s.c.) na região inguinal bilateral de camundongos CD45.2 C57BL/6J. Após 7 dias, esses camundongos portadores de tumor foram injetados intraperitonealmente (i.p.) com 4 mg de CTX, seguido pela transferência adotiva de 5 x 105 células CD45.1+P14 através de injeção intravenosa (i.v.) de cauda. Quando os tumores cresceram para aproximadamente 3-5 mm de diâmetro (cerca de 7 dias após a transferência de células P14), os tumores primários foram ressecados, e 5 x 104 células B16F10-GP em 20 μL de PBS foram diretamente injetadas no linfonodo inguinal unilateral. O linfonodo inguinal do outro lado foi injetado com volumes iguais de PBS. A coloração representativa de hematoxilina e eosina (H&E, 100x) do linfonodo não metastático (nLN) e do linfonodo metastático (NMm) nos momentos indicados é mostrada na Figura 1B. A estrutura do nLN estava intacta. No estágio inicial da metástase do NL (D8), o mLN estava parcialmente ocupado com células tumorais (seta preta), e ainda há alguma área remanescente com linfócitos que não foram invadidos por células tumorais (seta vermelha). Enquanto na fase tardia da metástase do NL (D18), o mLN é preenchido por células tumorais acompanhadas de angiogênese tumoral e poucos linfócitos. Células P14 ativadas recuperadas em TdLN produziram alto nível de IFN-γ após estimulação do peptídeo GP33-41 9,31. Aqui, as porcentagens de células P14 ativadas foram analisadas por citometria de fluxo em diferentes momentos e a estratégia de gating é mostrada na Figura 2. A frequência de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos no sangue periférico nos estágios inicial (D8) e tardio (D18) é de 2,81% e 1,48%, respectivamente (Figura 3A). Foi relatado que células T CD8+ específicas do tumor residem estritamente em dLN durante a tumorigênese e LN não drenante recupera células limitadas do doador33. A porcentagem de células P14 antígeno-específicas no nLN foi estável durante a metástase do NL. Curiosamente, as células T CD8+ antígeno-específicas no mLN foram potencializadas transitoriamente no estágio inicial, evidenciado pela maior frequência de células P14 em comparação com o nLN, enquanto diminuiu acentuadamente no estágio tardio (Figura 3B).

Figura 1: Diagrama esquemático do delineamento experimental. (A) Camundongos C57BL/6J (CD45.2+) são implantados com 5 x 105 células tumorais B16F10-GP na região inguinal bilateral. Após 7 dias, esses camundongos são injetados intraperitonealmente com 4 mg de CTX, seguidos pela transferência adotiva de diferentes células P14 marcadas congenicamente (CD45.1+) no dia seguinte. Quando os tumores crescem para aproximadamente 3-5 mm de diâmetro (cerca de 7 dias após a transferência de células P14), os tumores primários são ressecados, então 5 x 104 células B16F10-GP em 20 μL de PBS são injetadas diretamente no linfonodo inguinal unilateral, e o linfonodo inguinal do outro lado é injetado com volumes iguais de PBS. (B) Coloração representativa da hematoxilina e eosina (H&E,100x) dos LNs. Abreviaturas: s.c. = subcutânea; CTX= ciclofosfamida; i.v. = intravenosa; Saco = sacrifício; nLN = LN não metastático; mLN = LN metastático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estratégia de Gating para análise por citometria de fluxo. Estratégia de gating usada para identificar células T CD8+ ativadas antígeno-específicas derivadas do doador. Abreviações: L/D = vivo/morto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Dinâmica das células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases de NL. A proporção de células T CD8+ antígeno-específicas no (A) sangue periférico, (B) nLN e mLN em diferentes momentos. Abreviações: nLN = LN não metastático; mLN = LN metastático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.