Caracterização da morfologia vascular da degeneração macular relacionada à idade neovascular pela angiografia com indocianina verde

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma condição prevalente que leva à perda grave da visão em indivíduos idosos¹. Somente nos Estados Unidos, o número de pacientes com DMRI deve dobrar, chegando a quase 22 milhões até 2050, em comparação com os atuais 11 milhões. Globalmente, espera-se que o número estimado de casos de DMRI atinja impressionantes 288 milhões até 2040².

A neovascularização da coroide (NVC), também conhecida como DMRI "úmida" ou neovascular, pode ter efeitos devastadores na visão devido à formação de vasos sanguíneos anormais abaixo da retina central. Isso leva a hemorragia, exsudação da retina e perda significativa da visão. A introdução de terapias antifator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que têm como alvo o VEGF extracelular, revolucionou o tratamento da CNV. No entanto, apesar desses avanços, até 50% dos pacientes apresentam respostas subótimas a essas terapias, com atividade contínua da doença, como acúmulo de líquidos e^{hemorragias não} resolvidas ou novas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Estudos clínicos têm indicado que a resistência anti-VEGF em pacientes com NVC frequentemente corresponde à presença de CNV arteriolar, caracterizada por arteríolas ramificadas de grande calibre, alças vasculares e conexões anastomóticas⁹. O tratamento repetido com anti-VEGF pode contribuir para a anormalização dos vasos, o desenvolvimento de CNV arteriolar e, finalmente, a resistência às terapias anti-VEGF^14,15. Nos casos de NVC arteriolar, o extravasamento de líquido persistente é provavelmente devido à exsudação aumentada causada por tight junctions inadequadamente formadas nas alças anastomóticas arteriovenosas, particularmente em condições de alto fluxo sanguíneo⁹. Por outro lado, indivíduos que respondem bem ao tratamento anti-VEGF tendem a apresentar CNV capilar.

Em nossos estudos utilizando modelos animais, demonstramos que a CNV induzida por laser em camundongos mais velhos desenvolve CNV arteriolar e apresenta resistência ao tratamento anti-VEGF^16,17. Por outro lado, a CNV induzida por laser em camundongos mais jovens leva ao desenvolvimento de CNV capilar e alta responsividade ao tratamento anti-VEGF. Assim, é crucial diferenciar os tipos vasculares de CNV para investigações mecanicistas e terapêuticas.

Em ambientes clínicos, a CNV é comumente classificada com base nos padrões de vazamento da angiografia fluoresceínica (FA) (por exemplo, Tipo 1, Tipo 2), que usam corante fluoresceína para rastrear a exsudação e identificar áreas de vazamento patológico. Na pesquisa da DMRI, a CNV é predominantemente estudada usando FA em modelos animais. No entanto, a AF falha em revelar a morfologia vascular da NVC. Além disso, a AF capta apenas imagens no espectro da luz visível e não consegue visualizar a vasculatura coroidal abaixo do epitélio pigmentado da retina (EPR). Em contraste, o verde de indocianina (ICG), que apresenta forte afinidade pelas proteínas plasmáticas, facilita a retenção intravascular predominante e permite a visualização da estrutura vascular e do fluxo sanguíneo⁹. Ao utilizar a propriedade de fluorescência no infravermelho próximo da ICG, torna-se viável obter imagens do pigmento da retina e coroide usando a angiografia por ICG (ICGA). Neste contexto, é apresentado um protocolo que combina AF e ICGA para investigar o extravasamento e a morfologia vascular da neovascularização de coroide (CNV) induzida por laser em camundongos jovens e velhos, onde CNV capilar e arteriolar são observadas.

Os experimentos com animais realizados neste estudo receberam aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes descritas na Declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e da visão. Camundongos jovens (7-9 semanas) e velhos (12-16 meses) C57BL/6J machos e fêmeas foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparo do sistema de imagem

1. Posicione uma almofada de aquecimento na plataforma de imagem (consulte Tabela de Materiais) para garantir que a temperatura corporal do mouse seja mantida durante a geração de imagens. Ative a almofada de aquecimento e ajuste a temperatura para 35 °C.
2. Remova a tampa de poeira e ligue o oftalmoscópio de varredura a laser. Coloque uma lente de 55° na máquina.
3. Configure o software de imagem (consulte Tabela de Materiais) e insira informações essenciais, incluindo genótipo, sexo, idade, etc. Quando a sessão de imagem começar, selecione o IR (canal infravermelho) para capturar imagens ICGA.

2. Preparação dos animais antes da ICGA e da AG

1. Pesar o rato para determinar a quantidade de anestesia (Ketamine/Xylazine 70-100/2.5-10 mg/kg, ver Tabela de Materiais) necessária.
   NOTA: Otimizar a dosagem é crucial, pois o perfil metabólico varia entre diferentes cepas de camundongos. É essencial determinar a dosagem adequada para evitar que o rato acorde antes de completar a imagem ou o risco de uma overdose e potencial mortalidade animal.
2. Use uma seringa estéril de 1 mL com uma agulha 30-32 G para administrar a anestesia por injeção intraperitoneal. Aperte suavemente uma das patas do rato para verificar se o rato está adequadamente anestesiado. Se o animal apresentar alguma resposta ou movimento, é aconselhável aguardar um tempo adicional antes de prosseguir para a próxima etapa. Isso permite que o animal se acomode e garante condições ideais para os procedimentos subsequentes.
3. Administrar gotas de solução oftálmica de tropicamida a 1% para dilatar ambos os olhos do rato. Aguarde pelo menos 30 s antes de usar gotas de cloridrato de proparacaína a 0,5% (ver Tabela de Materiais) em ambos os olhos para reduzir o movimento ocular e o piscar. Acompanhe com colírio lubrificante para os olhos.
   NOTA: Durante toda a duração da anestesia, é importante abordar a questão do ressecamento extremo nos olhos do rato, que pode levar à opacidade da córnea. Essa opacidade torna a imagem subsequente desafiadora devido à visibilidade prejudicada. Para evitar isso, é crucial aplicar gotas de gel lubrificante para os olhos continuamente para manter os olhos do rato hidratados.
4. Coloque o mouse em uma almofada de água de aquecimento.
   NOTA: Os ratos possuem uma alta relação área/volume de superfície, resultando em maior perda de calor para o ambiente. Quando combinado com a queda de temperatura induzida pela anestesia, isso pode representar um risco significativo para o camundongo, potencialmente levando à morte devido à hipotermia. É fundamental tomar as precauções necessárias para evitar a hipotermia e garantir o bem-estar do rato durante o procedimento.
5. Preparar uma mistura de volume 1:1 de 2 mg/mL ICG e 20 mg/mL de corante fluoresceína (ver Tabela de Materiais). Administrar 250 μL da mistura por injeção intraperitoneal utilizando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 32 G.
   1. Insira a agulha no quadrante inferior esquerdo do abdómen do rato, perto das patas traseiras, num ângulo paralelo à pele do rato, para evitar perfurar quaisquer órgãos.
   2. Retire cuidadosamente o êmbolo e verifique se não entrou sangue na tampa da seringa. Proceder à injeção do corante de forma lenta e constante, mantendo um ritmo consistente.
      NOTA: O corante ICG deve ser filtrado com um filtro de seringa de 0,22 μm antes de ser utilizado.

3. ICGA e FA

1. Coloque o mouse na almofada de aquecimento da plataforma de imagem para iniciar a geração de imagens.
2. Posicione o corpo do mouse em um ângulo de 45 graus em relação à câmera e gire a cabeça levemente para baixo. Isso permite que o nervo óptico esteja no centro do foco da câmera.
3. Usando um cotonete, limpe delicadamente o olho para remover a camada de colírio lubrificante ou géis no olho que está sendo fotografado primeiro. Certifique-se de aplicar as gotas de gel lubrificante imediatamente após a conclusão do procedimento de imagem.
   NOTA: Deixar o olho sem lubrificação por mais de 1 min enquanto estiver sob anestesia não é recomendado.
4. Mova a câmera em direção ao olho do mouse. Selecione o canal FA no módulo de aquisição. A luminescência emitida pelo canal de FA pode ser usada para posicionar no centro da córnea do camundongo para uma colocação mais rápida.
5. Posicione a cabeça do mouse de forma que o nervo óptico fique centralizado na tela, evitando a necessidade de inclinar o oftalmoscópio de varredura a laser em um ângulo. Faça pequenos ajustes na posição da cabeça do mouse para alcançar o alinhamento desejado.
6. No módulo de aquisição, selecione o canal ICGA. Certifique-se de que a intensidade do laser esteja ajustada para 100% e selecione a opção de 55° para corresponder à lente apropriada. Isso garante as configurações ideais para o oftalmoscópio de varredura a laser.
   NOTA: Para evitar a saturação excessiva, pode ser necessário usar uma intensidade de laser mais baixa, normalmente em torno de 25%-50%, ao criar imagens no estágio inicial. Ajustar a intensidade do laser nessa faixa pode ajudar a capturar imagens claras e precisas sem causar saturação excessiva.
7. Quando o olho ocupar toda a tela do software de imagem, faça ajustes nas configurações de sensibilidade e foco para obter a imagem mais clara da membrana CNV.
   1. Gire o botão preto redondo no módulo de aquisição para ajustar a sensibilidade da imagem.
   2. Gire o botão do oftalmoscópio para ajustar o foco. O foco ideal para visualizar a vasculatura retiniana usando AF está tipicamente dentro da faixa de 35-45 D (dioptrias). Por outro lado, o foco ideal para visualização da coroide usando ICGA é geralmente entre 10-15 D.
      NOTA: Devido aos diferentes tamanhos da membrana CNV, pode ser necessário ajustar o foco em 10-30 D para obter imagens ideais da morfologia vascular.
8. Uma vez que o foco e a sensibilidade tenham sido ajustados para obter a melhor imagem possível, pressione o botão preto redondo no módulo de aquisição para normalizar a imagem. Quando a normalização estiver concluída (todos os quadros capturados), clique no botão adquirir no painel touchscreen para salvar a imagem. Pode ser necessário mover a câmera para obter imagens CNV de diferentes ângulos. O mouse também pode ser orientado em diferentes posições para fornecer a melhor imagem da lesão da CNV.
   NOTA: Pode-se ter que reajustar o foco ou o posicionamento do oftalmoscópio de varredura a laser ao visualizar a vasculatura mais longe do nervo óptico.
9. Volte para o canal FA usando o módulo de aquisição. Conclua os mesmos passos listados nas etapas 3.6-3.7 para ajustar a sensibilidade e o foco de cada imagem para capturar o vazamento da lesão de CNV.
   NOTA: Certifique-se de que a sensibilidade correta é selecionada para evitar a saturação excessiva do vazamento CNV e aumentar artificialmente a área de vazamento.
10. Imagem da "fase inicial" de ICGA e FA 3-4 min pós-injeção.
    NOTA: A "fase inicial" é o momento em que a vasculatura coroidal pode ser vista de forma clara e distinta. Durante a fase média, que normalmente ocorre entre 4-8 min, os vasos da retina e da coroide estão muito mais desbotados e difusos. À medida que a fase tardia (>8-10 min) se instala, tanto os vasos coroidais quanto os da retina tornam-se indiscerníveis. Lesões de CNV hiperfluorescentes, no entanto, exibem contraste máximo contra o fundo diminuído. Esses tempos mencionados são variáveis e dependem da concentração e quantidade de corante ICG injetado. Uma maior quantidade de corante ICG tende a aumentar o tempo de cada fase e proporcionar vasos mais distintos. Uma fase deve ser definida com base nas principais características listadas acima, em vez de um tempo absoluto.
11. Depois que todas as imagens forem adquiridas, aplique um lubrificante ou pomada em gel no olho do mouse e monitore cuidadosamente o mouse na almofada de aquecimento para recuperação. Geralmente leva 1,5 h para o mouse se recuperar totalmente.
12. Coloque os ratos de volta em suas gaiolas e na área de retenção designada assim que eles se recuperarem totalmente da anestesia e estiverem acordados.
13. Antes de desligar o sistema de imagem e o laser, exporte as imagens como arquivos TIFF ou JPEG para análise subsequente.

4. PSE/coroide de montagem plana e coloração

1. Fixe os olhos em paraformaldeído a 4% durante a noite. Lave os olhos com PBS três vezes. Retire o cristalino e a córnea.
2. Incubar os olhos em solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 10%, Triton X-100 a 0,6% em PBS) por 1 h à temperatura ambiente. Repita a lavagem PBS três vezes.
3. Incubar os olhos com isolado GS-IB4 Alexa-flour 568 conjugado e anticorpo anti-actina de músculo liso α (ver Tabela de Materiais) durante a noite na solução de bloqueio.
4. Lave três vezes com PBS. Incubar as amostras com um anticorpo secundário de cabra Alexa Fluor 488 anti-coelho (ver Tabela de Materiais) durante 2 h à temperatura ambiente.
5. Realizar 4 cortes radiais da borda até o equador. Remover cuidadosamente a retina¹⁷.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a membrana neovascular não seja descolada.
6. Monte a coroide plana em uma lâmina de vidro. Visualize a CNV usando microscopia confocal.

Seguindo o protocolo, ICGA e FA foram realizados em CNV induzida por laser em camundongos C57BL/6J jovens (7-9 semanas) e idosos (12-16 meses). A AF fornece informações sobre a localização e o vazamento das lesões de CNV (Figura 1, painéis esquerdos), enquanto a AGIC revela a morfologia vascular das lesões de CNV (Figura 1, painéis à direita). Em camundongos jovens, a CNV capilar domina as lesões da CNV. Em contraste, camundongos velhos exibem CNV arteriolar caracterizada por vasos de grande calibre, alças vasculares e conexões anastomóticas. Camundongos jovens e velhos mostram nítida visibilidade da vasculatura retiniana na AF (Figura 1, painéis à esquerda). Nas imagens de ICGA de camundongos jovens, a vasculatura retiniana não é visível, e os vasos coroidais parecem desbotados, indicando a fase média da ICGA com foco na vasculatura coroidal. Nas imagens de ICGA de camundongos velhos, a vasculatura parcial da retina pode ser observada enquanto os vasos coroidais parecem desbotados, sugerindo a fase média com o foco entre a retina e a coroide devido ao maior tamanho da CNV arteriolar em camundongos velhos. A CNV arteriolar em camundongos velhos exibe maior tamanho de CNV (Figura 2) e significativamente mais vazamento em comparação com CNV capilar em camundongos jovens. A imunomarcação com anticorpo antiactina de músculo liso marca extensivamente a vasculatura da CNV em camundongos velhos, confirmando a morfologia arteriolar (Figura 3). Em contraste, coloração mínima com actina de músculo α-liso é observada na vasculatura do sítio da lesão de camundongos jovens, compatível com a morfologia capilar.

Figura 1: Comparação das imagens de FA e ICGA mostrando CNV induzida por laser em camundongos jovens e velhos. As imagens de AF mostram o extravasamento das lesões de CNV, enquanto a ICGA fornece visualização da morfologia vascular. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação do tamanho da lesão da CNV em camundongos jovens e velhos com base em imagens de ICGA. As áreas de CNV foram medidas, com um total de 26 e 14 pontos laser analisados em camundongos jovens e velhos, respectivamente. As barras de erro representam a média ± DP. A análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado. P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas de lesões de CNV em camundongos jovens e velhos, co-marcadas com Alexa 568 isolado e anticorpo anti-actina de músculo liso α em suportes planos de EPR/coroide. A cor vermelha representa a isolectina Alexa 568, enquanto a cor verde representa a actina de músculo liso α (AME). Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.