Atualmente, a angiografia fluoresceínica (AF) é o método preferido para identificar padrões de vazamento em modelos animais de neovascularização de coroide (CNV). Entretanto, a AF não fornece informações sobre a morfologia vascular. Este protocolo descreve o uso da angiografia verde com indocianina (ICGA) para caracterizar diferentes tipos de lesões de CNV induzida por laser em modelos de camundongos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Caracterização da morfologia vascular da degeneração macular relacionada à idade neovascular pela angiografia com indocianina verde
Neste artigo
Resumo
Resumo
A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma das principais causas de cegueira entre indivíduos mais velhos, e sua prevalência está aumentando rapidamente devido ao envelhecimento da população. A neovascularização da coroide (NVC) ou DMRI úmida, responsável por 10%-20% de todos os casos de DMRI, é responsável por alarmantes 80%-90% da cegueira relacionada à DMRI. As terapias anti-VEGF atuais mostram respostas subótimas em aproximadamente 50% dos pacientes. A resistência ao tratamento anti-VEGF em pacientes com CNV está frequentemente associada à CNV arteriolar, enquanto os respondedores tendem a ter CNV capilar. Embora a angiografia fluoresceínica (AF) seja comumente usada para avaliar padrões de vazamento em pacientes com DMRI úmida e modelos animais, ela não fornece informações sobre a morfologia vascular da NVC (CNV arteriolar vs. CNV capilar). Este protocolo introduz o uso da angiografia verde com indocianina (ICGA) para caracterizar tipos de lesões em modelos de CNV induzida por laser. Este método é crucial para investigar os mecanismos e estratégias de tratamento da resistência anti-VEGF na DMRI úmida. Recomenda-se incorporar ICGA ao lado de FA para avaliação abrangente de vazamento e características vasculares da CNV em estudos mecanísticos e terapêuticos.
Introdução
A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma condição prevalente que leva à perda grave da visão em indivíduos idosos1. Somente nos Estados Unidos, o número de pacientes com DMRI deve dobrar, chegando a quase 22 milhões até 2050, em comparação com os atuais 11 milhões. Globalmente, espera-se que o número estimado de casos de DMRI atinja impressionantes 288 milhões até 20402.
A neovascularização da coroide (NVC), também conhecida como DMRI "úmida" ou neovascular, pode ter efeitos devastadores na visão devido à formação de vasos sanguíneos anormais abaixo da retina central. Isso leva a hemorragia, exsudação da retina e perda significativa da visão. A introdução de terapias antifator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que têm como alvo o VEGF extracelular, revolucionou o tratamento da CNV. No entanto, apesar desses avanços, até 50% dos pacientes apresentam respostas subótimas a essas terapias, com atividade contínua da doença, como acúmulo de líquidos ehemorragias não resolvidas ou novas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Estudos clínicos têm indicado que a resistência anti-VEGF em pacientes com NVC frequentemente corresponde à presença de CNV arteriolar, caracterizada por arteríolas ramificadas de grande calibre, alças vasculares e conexões anastomóticas9. O tratamento repetido com anti-VEGF pode contribuir para a anormalização dos vasos, o desenvolvimento de CNV arteriolar e, finalmente, a resistência às terapias anti-VEGF14,15. Nos casos de NVC arteriolar, o extravasamento de líquido persistente é provavelmente devido à exsudação aumentada causada por tight junctions inadequadamente formadas nas alças anastomóticas arteriovenosas, particularmente em condições de alto fluxo sanguíneo9. Por outro lado, indivíduos que respondem bem ao tratamento anti-VEGF tendem a apresentar CNV capilar.
Em nossos estudos utilizando modelos animais, demonstramos que a CNV induzida por laser em camundongos mais velhos desenvolve CNV arteriolar e apresenta resistência ao tratamento anti-VEGF16,17. Por outro lado, a CNV induzida por laser em camundongos mais jovens leva ao desenvolvimento de CNV capilar e alta responsividade ao tratamento anti-VEGF. Assim, é crucial diferenciar os tipos vasculares de CNV para investigações mecanicistas e terapêuticas.
Em ambientes clínicos, a CNV é comumente classificada com base nos padrões de vazamento da angiografia fluoresceínica (FA) (por exemplo, Tipo 1, Tipo 2), que usam corante fluoresceína para rastrear a exsudação e identificar áreas de vazamento patológico. Na pesquisa da DMRI, a CNV é predominantemente estudada usando FA em modelos animais. No entanto, a AF falha em revelar a morfologia vascular da NVC. Além disso, a AF capta apenas imagens no espectro da luz visível e não consegue visualizar a vasculatura coroidal abaixo do epitélio pigmentado da retina (EPR). Em contraste, o verde de indocianina (ICG), que apresenta forte afinidade pelas proteínas plasmáticas, facilita a retenção intravascular predominante e permite a visualização da estrutura vascular e do fluxo sanguíneo9. Ao utilizar a propriedade de fluorescência no infravermelho próximo da ICG, torna-se viável obter imagens do pigmento da retina e coroide usando a angiografia por ICG (ICGA). Neste contexto, é apresentado um protocolo que combina AF e ICGA para investigar o extravasamento e a morfologia vascular da neovascularização de coroide (CNV) induzida por laser em camundongos jovens e velhos, onde CNV capilar e arteriolar são observadas.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os experimentos com animais realizados neste estudo receberam aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes descritas na Declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e da visão. Camundongos jovens (7-9 semanas) e velhos (12-16 meses) C57BL/6J machos e fêmeas foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparo do sistema de imagem
- Posicione uma almofada de aquecimento na plataforma de imagem (consulte Tabela de Materiais) para garantir que a temperatura corporal do mouse seja mantida durante a geração de imagens. Ative a almofada de aquecimento e ajuste a temperatura para 35 °C.
- Remova a tampa de poeira e ligue o oftalmoscópio de varredura a laser. Coloque uma lente de 55° na máquina.
- Configure o software de imagem (consulte Tabela de Materiais) e insira informações essenciais, incluindo genótipo, sexo, idade, etc. Quando a sessão de imagem começar, selecione o IR (canal infravermelho) para capturar imagens ICGA.
2. Preparação dos animais antes da ICGA e da AG
- Pesar o rato para determinar a quantidade de anestesia (Ketamine/Xylazine 70-100/2.5-10 mg/kg, ver Tabela de Materiais) necessária.
NOTA: Otimizar a dosagem é crucial, pois o perfil metabólico varia entre diferentes cepas de camundongos. É essencial determinar a dosagem adequada para evitar que o rato acorde antes de completar a imagem ou o risco de uma overdose e potencial mortalidade animal. - Use uma seringa estéril de 1 mL com uma agulha 30-32 G para administrar a anestesia por injeção intraperitoneal. Aperte suavemente uma das patas do rato para verificar se o rato está adequadamente anestesiado. Se o animal apresentar alguma resposta ou movimento, é aconselhável aguardar um tempo adicional antes de prosseguir para a próxima etapa. Isso permite que o animal se acomode e garante condições ideais para os procedimentos subsequentes.
- Administrar gotas de solução oftálmica de tropicamida a 1% para dilatar ambos os olhos do rato. Aguarde pelo menos 30 s antes de usar gotas de cloridrato de proparacaína a 0,5% (ver Tabela de Materiais) em ambos os olhos para reduzir o movimento ocular e o piscar. Acompanhe com colírio lubrificante para os olhos.
NOTA: Durante toda a duração da anestesia, é importante abordar a questão do ressecamento extremo nos olhos do rato, que pode levar à opacidade da córnea. Essa opacidade torna a imagem subsequente desafiadora devido à visibilidade prejudicada. Para evitar isso, é crucial aplicar gotas de gel lubrificante para os olhos continuamente para manter os olhos do rato hidratados. - Coloque o mouse em uma almofada de água de aquecimento.
NOTA: Os ratos possuem uma alta relação área/volume de superfície, resultando em maior perda de calor para o ambiente. Quando combinado com a queda de temperatura induzida pela anestesia, isso pode representar um risco significativo para o camundongo, potencialmente levando à morte devido à hipotermia. É fundamental tomar as precauções necessárias para evitar a hipotermia e garantir o bem-estar do rato durante o procedimento. - Preparar uma mistura de volume 1:1 de 2 mg/mL ICG e 20 mg/mL de corante fluoresceína (ver Tabela de Materiais). Administrar 250 μL da mistura por injeção intraperitoneal utilizando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 32 G.
- Insira a agulha no quadrante inferior esquerdo do abdómen do rato, perto das patas traseiras, num ângulo paralelo à pele do rato, para evitar perfurar quaisquer órgãos.
- Retire cuidadosamente o êmbolo e verifique se não entrou sangue na tampa da seringa. Proceder à injeção do corante de forma lenta e constante, mantendo um ritmo consistente.
NOTA: O corante ICG deve ser filtrado com um filtro de seringa de 0,22 μm antes de ser utilizado.
3. ICGA e FA
- Coloque o mouse na almofada de aquecimento da plataforma de imagem para iniciar a geração de imagens.
- Posicione o corpo do mouse em um ângulo de 45 graus em relação à câmera e gire a cabeça levemente para baixo. Isso permite que o nervo óptico esteja no centro do foco da câmera.
- Usando um cotonete, limpe delicadamente o olho para remover a camada de colírio lubrificante ou géis no olho que está sendo fotografado primeiro. Certifique-se de aplicar as gotas de gel lubrificante imediatamente após a conclusão do procedimento de imagem.
NOTA: Deixar o olho sem lubrificação por mais de 1 min enquanto estiver sob anestesia não é recomendado. - Mova a câmera em direção ao olho do mouse. Selecione o canal FA no módulo de aquisição. A luminescência emitida pelo canal de FA pode ser usada para posicionar no centro da córnea do camundongo para uma colocação mais rápida.
- Posicione a cabeça do mouse de forma que o nervo óptico fique centralizado na tela, evitando a necessidade de inclinar o oftalmoscópio de varredura a laser em um ângulo. Faça pequenos ajustes na posição da cabeça do mouse para alcançar o alinhamento desejado.
- No módulo de aquisição, selecione o canal ICGA. Certifique-se de que a intensidade do laser esteja ajustada para 100% e selecione a opção de 55° para corresponder à lente apropriada. Isso garante as configurações ideais para o oftalmoscópio de varredura a laser.
NOTA: Para evitar a saturação excessiva, pode ser necessário usar uma intensidade de laser mais baixa, normalmente em torno de 25%-50%, ao criar imagens no estágio inicial. Ajustar a intensidade do laser nessa faixa pode ajudar a capturar imagens claras e precisas sem causar saturação excessiva. - Quando o olho ocupar toda a tela do software de imagem, faça ajustes nas configurações de sensibilidade e foco para obter a imagem mais clara da membrana CNV.
- Gire o botão preto redondo no módulo de aquisição para ajustar a sensibilidade da imagem.
- Gire o botão do oftalmoscópio para ajustar o foco. O foco ideal para visualizar a vasculatura retiniana usando AF está tipicamente dentro da faixa de 35-45 D (dioptrias). Por outro lado, o foco ideal para visualização da coroide usando ICGA é geralmente entre 10-15 D.
NOTA: Devido aos diferentes tamanhos da membrana CNV, pode ser necessário ajustar o foco em 10-30 D para obter imagens ideais da morfologia vascular.
- Uma vez que o foco e a sensibilidade tenham sido ajustados para obter a melhor imagem possível, pressione o botão preto redondo no módulo de aquisição para normalizar a imagem. Quando a normalização estiver concluída (todos os quadros capturados), clique no botão adquirir no painel touchscreen para salvar a imagem. Pode ser necessário mover a câmera para obter imagens CNV de diferentes ângulos. O mouse também pode ser orientado em diferentes posições para fornecer a melhor imagem da lesão da CNV.
NOTA: Pode-se ter que reajustar o foco ou o posicionamento do oftalmoscópio de varredura a laser ao visualizar a vasculatura mais longe do nervo óptico. - Volte para o canal FA usando o módulo de aquisição. Conclua os mesmos passos listados nas etapas 3.6-3.7 para ajustar a sensibilidade e o foco de cada imagem para capturar o vazamento da lesão de CNV.
NOTA: Certifique-se de que a sensibilidade correta é selecionada para evitar a saturação excessiva do vazamento CNV e aumentar artificialmente a área de vazamento. - Imagem da "fase inicial" de ICGA e FA 3-4 min pós-injeção.
NOTA: A "fase inicial" é o momento em que a vasculatura coroidal pode ser vista de forma clara e distinta. Durante a fase média, que normalmente ocorre entre 4-8 min, os vasos da retina e da coroide estão muito mais desbotados e difusos. À medida que a fase tardia (>8-10 min) se instala, tanto os vasos coroidais quanto os da retina tornam-se indiscerníveis. Lesões de CNV hiperfluorescentes, no entanto, exibem contraste máximo contra o fundo diminuído. Esses tempos mencionados são variáveis e dependem da concentração e quantidade de corante ICG injetado. Uma maior quantidade de corante ICG tende a aumentar o tempo de cada fase e proporcionar vasos mais distintos. Uma fase deve ser definida com base nas principais características listadas acima, em vez de um tempo absoluto. - Depois que todas as imagens forem adquiridas, aplique um lubrificante ou pomada em gel no olho do mouse e monitore cuidadosamente o mouse na almofada de aquecimento para recuperação. Geralmente leva 1,5 h para o mouse se recuperar totalmente.
- Coloque os ratos de volta em suas gaiolas e na área de retenção designada assim que eles se recuperarem totalmente da anestesia e estiverem acordados.
- Antes de desligar o sistema de imagem e o laser, exporte as imagens como arquivos TIFF ou JPEG para análise subsequente.
4. PSE/coroide de montagem plana e coloração
- Fixe os olhos em paraformaldeído a 4% durante a noite. Lave os olhos com PBS três vezes. Retire o cristalino e a córnea.
- Incubar os olhos em solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 10%, Triton X-100 a 0,6% em PBS) por 1 h à temperatura ambiente. Repita a lavagem PBS três vezes.
- Incubar os olhos com isolado GS-IB4 Alexa-flour 568 conjugado e anticorpo anti-actina de músculo liso α (ver Tabela de Materiais) durante a noite na solução de bloqueio.
- Lave três vezes com PBS. Incubar as amostras com um anticorpo secundário de cabra Alexa Fluor 488 anti-coelho (ver Tabela de Materiais) durante 2 h à temperatura ambiente.
- Realizar 4 cortes radiais da borda até o equador. Remover cuidadosamente a retina17.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a membrana neovascular não seja descolada. - Monte a coroide plana em uma lâmina de vidro. Visualize a CNV usando microscopia confocal.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Seguindo o protocolo, ICGA e FA foram realizados em CNV induzida por laser em camundongos C57BL/6J jovens (7-9 semanas) e idosos (12-16 meses). A AF fornece informações sobre a localização e o vazamento das lesões de CNV (Figura 1, painéis esquerdos), enquanto a AGIC revela a morfologia vascular das lesões de CNV (Figura 1, painéis à direita). Em camundongos jovens, a CNV capilar domina as lesões da CNV. Em contraste, camundongos velhos exibem CNV arteriolar car...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este estudo demonstrou o uso da angiografia verde com indocianina (ICGA) para identificar a morfologia vascular da neovascularização arteriolar e capilar de coroide (CNV) em modelos murinos com CNV induzida por laser. As propriedades da luz infravermelha e ligada à hemoglobina do corante verde de indocianina (ICG) permitiram a detecção da morfologia da CNV, o que é desafiador de se conseguir usando a angiografia fluoresceínica (AF), o método atual empregado pela comunidade de pesquisa.
O prime...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subsídios da BrightFocus Foundation, Retina Research Foundation, Mullen Foundation, e Sarah Campbell Blaffer Endowment in Ophthalmology para YF, NIH core grant 2P30EY002520 para Baylor College of Medicine, e uma concessão irrestrita para o Departamento de Oftalmologia no Baylor College of Medicine da Research to Prevent Blindness.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de Insulina 32-G | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 anticorpo secundário anti-coelho para cabras | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-alfa; anticorpo de actina de músculo liso | Abcam | ab5694 | |
| Albumina de soro bovino | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| Camundongos C57BL/6J (7-9 semanas) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Sal de Sódio de Fluoresceína | T Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar Bomba | Gaymar | TP-500 | para recuperação de camundongos após imagem |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Gel |
| lubrificante transparente para os olhosGS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugado | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Alemanha | HEYEX2 | |
| Indocianina Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Cetamina | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldeído | Acros Organics | ||
| Solução Oftálmica de Cloridrato de Proparacaína (0,5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Sistema de Imagem Multimodal Spectralis | Heidelberg Engineering, Alemanha | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | Para dilatação de pupilas |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
Referências
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
- Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
- Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), London, England. 538-545 (2014).
- Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
- Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
- Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
- Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906(2021).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
- Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
- Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
- Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
- Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
- Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
- Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386(2020).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2(2022).
- Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804(2015).
- Li, X. -T., Qin, Y., Zhao, J. -Y., Zhang, J. -S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
- Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061(2014).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
