Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

Resumo

Este protocolo combina fotometria de massa com um novo sistema microfluídico para investigar interações proteína-proteína de baixa afinidade. Essa abordagem é baseada na rápida diluição de complexos altamente concentrados em solução, o que permite medições de baixa afinidade e amplia a aplicabilidade da fotometria de massa.

Resumo

A fotometria de massa é uma tecnologia versátil de medição de massa que permite o estudo de interações biomoleculares e formação de complexos em solução sem marcadores. A fotometria de massa é geralmente adequada para analisar amostras na faixa de concentração de 100 pM-100 nM. No entanto, em muitos sistemas biológicos, é necessário medir amostras mais concentradas para estudar interações de baixa afinidade ou transitórias. Aqui, demonstramos um método que expande efetivamente a faixa de concentrações de amostras que podem ser analisadas por fotometria de massa de nanomolar para dezenas de micromolares.

Neste protocolo, a fotometria de massa é combinada com um novo sistema microfluídico para investigar a formação de complexos proteicos em solução na faixa de concentração micromolar. Com o sistema de microfluídica, os usuários podem manter uma amostra em uma concentração mais alta desejada, seguida de diluição até a faixa nanomolar - vários milissegundos antes da medição da fotometria de massa. Devido à velocidade da diluição, os dados são obtidos antes que o equilíbrio da amostra tenha mudado (ou seja, dissociação do complexo).

A técnica é aplicada para medir as interações entre um anticorpo imunoglobulina G (IgG) e o receptor Fc neonatal, mostrando a formação de complexos de alta ordem que não foram quantificáveis com medidas de fotometria de massa estática.

Em conclusão, a combinação de fotometria de massa e microfluídica torna possível caracterizar amostras na faixa de concentração micromolar e é proficiente na medição de interações biomoleculares com afinidades mais fracas. Esses recursos podem ser aplicados em uma variedade de contextos - incluindo o desenvolvimento e o design de bioterapêuticos - permitindo a caracterização completa de diversas interações proteína-proteína.

Introdução

As interações proteína-proteína sublinham a maioria das funções celulares, desde a regulação imunológica até a replicação e tradução do DNA. Como resultado, há uma necessidade fundamental em todas as ciências da vida de investigar uma vasta gama de interações em diversos complexos heterogêneos que são comumente formados. No entanto, sua detecção, caracterização e quantificação são muitas vezes desafiadoras, principalmente para interações de baixa afinidade¹.

Os ensaios de imunoprecipitação são frequentemente usados para detectar interações de alta afinidade, mas para interações transitórias e de baixa afinidade, a detecção é amplamente inviável². Técnicas de fluorescência também podem ser usadas, mas requerem a adição potencialmente disruptiva de marcadores fluorescentes². O Cryo-EM pode fornecer um instantâneo estrutural e uma leitura de conjunto dos complexos de proteínas formados com alta resolução espacial, mas também normalmente requer trabalhar em concentrações muito baixas para imagens de interações de baixa afinidade. O Cryo-EM também traz desafios relacionados ao custo, acessibilidade, preparação da amostra e tempo de análise³.

Além disso, a ressonância plasmônica de superfície (SPR) tornou-se uma forma popular de quantificar as interações proteína-proteína, embora exija imobilização proteica, o que pode afetar o equilíbrio de ligação e resultar em taxas de ativação variáveis, reduzindo assim a precisão da medição ^4,5. Também envolve várias etapas do ensaio antes da coleta e análise dos dados⁶.

A fotometria de massa é uma técnica de molécula única que tem sido usada para analisar as interações proteína-proteína ^5,6,7. Ele funciona medindo a massa de moléculas individuais ou complexos com base na luz que eles espalham quando pousam na superfície de uma lamínula de vidro⁸. Medições de fotometria de massa têm sido usadas para quantificar as afinidades de ligação da abundância relativa de parceiros de ligação e os complexos que eles formam⁵. No entanto, como outras técnicas de molécula única, a concentração da amostra a ser medida deve ser normalmente inferior a 100 nM. Se a concentração for maior, as moléculas que pousam na superfície do vidro se sobrepõem espacialmente, resultando em dados de baixa qualidade⁷. Consequentemente, interações mais fracas (K_D ~ micromolares), que se dissociam nessas concentrações mais baixas, não podem ser medidas de forma confiável, uma vez que não é possível observar a mistura necessária de espécies não ligadas e ligadas⁵.

Aqui, descrevemos uma abordagem que supera essa limitação com base em um novo dispositivo de fotometria de massa microfluídica acoplada. Especificamente, um sistema microfluídico é usado em combinação com o fotômetro de massa para expandir efetivamente a gama de interações que podem ser quantificadas por fotometria de massa. A microfluídica demonstrou oferecer uma gama de possibilidades para investigar interações proteína-proteína, incluindo diluição rápida para detectar interações fracas ^1,9. O sistema aqui descrito opera diluindo rapidamente a amostra em até 10.000 vezes em um chip microfluídico e fluindo-a imediatamente pela área de observação do chip, permitindo que a medição da fotometria de massa comece dentro de 50 ms a partir do momento em que as moléculas iniciaram o processo de diluição¹⁰. A diluição ocorre quando a amostra e o tampão são combinados em um misturador de válvula Tesla reverso no chip, com as taxas de fluxo relativas das duas soluções determinando a quantidade de diluição que ocorre (consulte a etapa 8 do protocolo). A vazão é controlável com o software de controle microfluídico. Alterar a vazão pode alterar a população relativa da espécie, pois pode afetar o número de eventos de pouso na superfície do vidro, que é o que é medido pelo fotômetro de massa.

A velocidade do processo é rápida o suficiente para que a medição seja concluída antes que a integridade da interação seja interrompida (para mais detalhes, consulte também a Discussão). Isso pode ser entendido através de uma breve olhada na teoria das reações de primeira ordem, onde . A constante de taxa direta (associação) é k_f, a constante de taxa inversa (dissociação) é k_b e a constante de dissociação de equilíbrio (K_D) é definida como

K_D= k_b/ k_f

Para a ligação às proteínas, k_fé geralmente limitado pela difusão dos reagentes¹¹ e, portanto, é restrito à faixa de 10^{6-10 7 M-1} · ^s-1. Como o intervalo de é limitado, uma reação de baixa afinidade (K_D ~ micromolares) terá k_b≈ 1 ^s-1. Ou seja, k_b = k_f  · K_D= (10^{6 M-1}·^s-1) (10-6 M) = 1 ^s-1, com meia-vida do complexo em torno de 0,7 s^11,12.

Nosso sistema de exemplo é a ligação do anticorpo monoclonal IgG trastuzumabe ao domínio solúvel do receptor Fc neonatal IgG (FcRn), que são conhecidos parceiros de interação¹³. Dados publicados anteriormente obtidos usando apenas fotometria de massa convencional (ou seja, com diluição manual de amostras) mostraram que as proteínas formam várias espécies. Monômeros de FcRn, dímeros de FcRn e IgG não ligados foram claramente visíveis, enquanto complexos IgG-FcRn (nas proporções de 1:1 e 1:2) também foram detectados (em pH 5,0), mas apenas com abundância muito baixa⁵. Essa observação levanta a questão de saber se a formação do complexo IgG-FcRn poderia ser detectada com mais clareza se medida em uma concentração mais alta. De fato, a combinação de fotometria de massa com uma abordagem de diluição rápida acoplada descrita aqui forneceu evidências mais robustas de formação complexa por um aumento em suas partículas medidas.

O protocolo de fotometria de massa e microfluídica aqui descrito permite caracterizar a formação de complexos com K_D até a faixa micromolar. Uma determinação empírica do K_D exigirá melhorias adicionais na precisão do sensor de fluxo, estabilidade da bomba, variações de chip a chip e localização de medição dentro da janela de observação, pois todos esses fatores influenciariam o tempo desde o momento em que a amostra é diluída até a medição.

A mesma abordagem pode ser aplicada para investigar a ligação entre quaisquer proteínas solúveis, desde que tenham pesos moleculares distintos (separados por pelo menos 25 kDa) que se enquadrem na faixa adequada para análise com um fotômetro de massa (30 kDa a 6 MDa). Os insights obtidos podem ser úteis para estudos em uma variedade de contextos - desde a obtenção de uma compreensão mecanicista das funções celulares até o design de novos medicamentos bioterapêuticos.

Protocolo

1. Preparação dos instrumentos e lançamento do software

1. Ligue o fotômetro de massa e deixe-o ligado por pelo menos 1 h antes de iniciar qualquer medição.
   NOTA: Isso ocorre porque o instrumento precisa atingir uma temperatura constante. Não deixar o fotômetro de massa ligado por 1 h pode levar a um deslocamento de massa e, portanto, a resultados imprecisos.
2. Ligue a mesa antivibração ligando a energia e pressionando o botão de isolamento (sob o fotômetro de massa). As vibrações limitam o desempenho do instrumento de fotometria de massa, portanto, a tabela antivibração é importante para garantir a máxima sensibilidade do instrumento. Ligue a caixa de microfluídica.
3. Inicie o software de aquisição de dados e o software de controle de microfluídica. Ligue o compressor de ar.

2. Preparação de amostras de proteínas, tampão e soluções de limpeza

1. Adicione 200 mL de tampão PBS (pH 7,4) a um frasco limpo de 200 mL e 200 mL de tampão PBS (pH 5,0) a um segundo frasco de 200 mL.
   NOTA: Os frascos de 200 mL precisarão ser conectados ao sensor da unidade de fluxo "L" nas próximas etapas. Use tampão PBS de pH 7,4 para a medição de calibração e tampão PBS de pH 5,0 para a medição da amostra.
2. Em um tubo de centrífuga de 0,5 mL, misture IgG (2 μM) e FcRn (20 μM) na proporção de 1:10 para um volume total de 60 μL.
   1. As soluções estoque para FcRn e IgG são 91,9 μM e 13,5 μM, respectivamente. Prepare a reação misturando 9 μL de IgG estoque + 13 μL de FcRn estoque + 38 μL de PBS (pH 5,0, temperatura ambiente [RT]) em um tubo de centrífuga para um volume total de 60 μL. As concentrações finais para os dois reagentes foram de 2 μM para IgG e 20 μM para FcRn. Mantenha todos os estoques de proteínas no gelo durante todo esse processo.
3. Em outro tubo de centrífuga de 0,5 mL, dispense 20 μL do calibrante β-amilase na concentração de 20 μM.
   1. A título de exemplo, para preparar o calibrante de β-amilase aqui utilizado, seguir o procedimento descrito nos pontos 2.3.1.1-2.3.1.2.
      1. Ressuspenda 20 mg de pó de β-amilase no frasco para injetáveis em 3,57 mL de PBS (glicerol a 5%), correspondendo a 5,6 mg / mL e uma concentração molar de 100 μM (já que o peso molecular é de 56 kDa).
      2. Para diluir a 20 μM, combine 200 μL do estoque de 100 μM com 800 μL de PBS (pH 7,4, RT) em um tubo de centrífuga de 1 mL.
4. Incubar as amostras em RT durante pelo menos 30 min.
   NOTA: Comece a preparar a amostra e as diluições do calibrante depois de ligar o fotômetro de massa. Para este experimento, as amostras foram incubadas por 120 min.
5. Em três tubos de centrífuga de 50 mL, alíquotas: 50 mL de PBS (pH 7,4) - solução de limpeza 1 (CS1), 50 mL de NaOH 0,5 M - solução de limpeza 2 (CS2) e 50 mL de IPA 100% - solução de limpeza 3 (CS3).

3. Configuração experimental

1. Para carregar a amostra e o calibrante, coloque o tubo centrífugo calibrante na posição 4 e o tubo centrífugo de amostra na posição 5 da caixa microfluídica (Figura 1).
2. Para carregar as soluções de limpeza, coloque CS1, CS2 e CS3 nas posições 1, 2 e 3 da caixa de microfluídica (Figura 1).
   NOTA: A amostra, o calibrante e as soluções de limpeza são conectados ao multi-switch (m-switch). O interruptor m é conectado ao sensor da unidade de fluxo "S".
3. Enrosque a tampa que se conecta à linha tampão no frasco tampão de 200 mL (pH 7,4).
   NOTA: A linha tampão é conectada a uma válvula de corte, que é conectada ao sensor da unidade de fluxo "L". A válvula de corte evita quaisquer efeitos de sifão que possam ocorrer quando o fluxo do buffer é interrompido. O sifonamento pode levar à contaminação do tampão pelo fluido residual diluído que retorna ao reservatório do tampão.
4. Coloque o chip microfluídico em uma placa de preparação.
   Empurre a outra extremidade do tubo do sensor da unidade de fluxo "S" na "Entrada de amostras" do primeiro canal no chip microfluídico (Figura 1). A linha de amostra está completa.
5. Empurre a outra extremidade do tubo do sensor da unidade de fluxo "L" na "entrada do buffer" do primeiro canal no chip microfluídico (Figura 1). A linha de buffer está completa.
6. Para coletar a saída, empurre um tubo para a "Saída" do primeiro canal no chip microfluídico; Posicionar a outra extremidade de modo a que seja drenada para um balão ou copo receptável de resíduos (figura 1).

4. Preparando as linhas de amostra e tampão com tampão

1. Abra a válvula de corte manual na linha tampão.
2. No software de controle microfluídico, defina a vazão da linha tampão para 1000 μL/min e certifique-se de que a pressão da linha tampão não exceda 110 mbar (Figura 2). O fluxo começará automaticamente na linha de buffer (Figura 1).
   NOTA: Se a pressão da linha de buffer exceder 110 mbar, pode ser devido à passagem de ar pelo sensor de fluxo. Se a pressão não voltar ao normal em alguns segundos, há potencialmente um bloqueio (geralmente devido a tubos comprimidos nas conexões). Nesse caso, pare o fluxo e verifique as conexões na linha tampão, começando pela válvula de corte.
3. No software de controle microfluídico, selecione a posição 1 do interruptor m (correspondente ao tampão PBS), defina a vazão da linha de amostra para 8 μL/min e certifique-se de que a pressão da linha de amostra não exceda 350 mbar. O fluxo começará automaticamente na linha de amostra (Figura 1).
4. Use uma ponta de pipeta (ou outro componente de plástico macio) para aplicar uma leve pressão de cima perto da(s) bolha(s) presa(s) no chip para desalojar as bolhas de ar e garantir que sejam removidas pela saída.
   NOTA: Certifique-se de remover todas as bolhas nas seções 'mixer' e 'área de observação' (Figura 1) do canal em uso. Tome cuidado para não empurrar com muita força, pois isso pode danificar o chip.

5. Colocando o chip microfluídico no fotômetro de massa e encontrando o foco

1. Aplique uma gota de óleo de imersão no microscópio na objetiva do fotômetro de massa.
2. Coloque o chip microfluídico no suporte do fotômetro de massa com a "Entrada de amostra" voltada para cima e segure-o preso ao stage clamps (Figura 1). Certifique-se de que todas as conexões da tubulação permaneçam conectadas.
3. Usando o software de aquisição de dados, mova o palco para garantir que a "Área de observação" do canal 1 esteja alinhada com o objetivo (Figura 1).
4. Feche a tampa do fotômetro de massa e pressione a opção Gotícula-Diluição Encontrar Foco no software de aquisição de dados.
5. Verifique o anel de foco branco no canto inferior esquerdo do software de aquisição de dados (Figura 3). Lacunas no anel indicam a presença de uma bolha de ar no óleo de imersão; Remova isso aumentando a velocidade do palco ao máximo e movendo suavemente o palco lateralmente.
6. Após a conclusão da focagem, aguarde 2-3 minutos antes de fazer a primeira gravação. Em seguida, pressione Gravar para registrar uma medição de 1 minuto e certifique-se (observando a medição) de que nenhuma impureza apareça.
   NOTA: As impurezas podem estar na superfície do vidro ou no tampão. O valor de nitidez no software de aquisição de dados deve estar acima de 4,5%.

6. Calibração de fotometria de massa

1. No software de controle microfluídico, coloque o interruptor m na posição 4 (correspondente ao calibrante) e certifique-se de que a vazão da linha de amostra esteja ajustada em 8 μL/min e que a pressão da linha de amostra não exceda 350 mbar (Figura 2).
   1. O calibrante iniciará o fluxo através do chip. Aguarde aproximadamente 1.5-2.5 min (ou até que o calibrante seja visto de forma consistente no software de aquisição de dados). O tempo pode variar de acordo com o comprimento da tubulação da linha de amostra.
2. Uma vez que o calibrante seja visto de forma consistente (ou seja, o número de eventos é suficiente para uma medição precisa de fotometria de massa), no software de controle microfluídico, reduza a taxa de fluxo para 0,5 μL / min - o nível de diluição alvo para este experimento.
   NOTA: Começar com uma taxa de fluxo mais alta simplesmente reduz o tempo necessário para o calibrante chegar ao chip.
3. Certifique-se de que não haja "poucas" ou "muitas" moléculas pousando na superfície de medição (Figura 4).
   1. Se a densidade do evento de pouso não for "ideal" (Figura 4), altere a taxa de fluxo no software de controle microfluídico. Se a densidade do evento for muito baixa, aumente a taxa de fluxo de amostra até que eventos de pouso bem separados sejam observados (mas não exceda 8 μL / min). Se estiver muito alto, reduza a taxa de fluxo de amostra (mas não fique abaixo de 0,1 μL / min).
   2. Se o volume do calibrante estiver baixo no sample tubo, mude a posição do interruptor m para a linha PBS pH 7.4 (posição 1) para evitar a injeção de ar.
4. Pressione Gravar e faça uma medição de 60 s. Salve o arquivo em uma pasta escolhida.
   NOTA: O software de aquisição de dados produz arquivos com .mp como extensão.

7. Limpando a linha de amostra e interrompendo o fluxo

1. No software de controle microfluídico, mude para a posição 2 do m-switch e altere a pressão da amostra para 800 mbar (Figura 2). Lave o sistema com CS2 (NaOH) por 4 min.
2. Mude para a posição 3 do m-switch e lave o sistema com CS3 (IPA) por 4 min.
3. Mude para a posição 1 do m-switch e lave o sistema com CS1 (PBS) por 4 min.
4. No software de controle microfluídico, pare todo o fluxo definindo as pressões da linha de amostragem e da linha tampão para 0 e desligue a válvula tampão.
5. Desconecte o chip do stage e coloque-o de volta na placa de preparação. Desconecte todos os tubos e coloque o sample extremidade do tubo em um frasco de resíduos. Limpe a objetiva com isopropanol e lenços umedecidos.

8. Medição da amostra de fotometria de massa

1. Desaperte a tampa conectada ao frasco tampão de 200 mL (pH 7.4) e aparafuse-a ao frasco tampão de 200 mL (pH 5.0).
2. Repita as etapas 3.4-5.6, mas use o segundo canal do chip em vez do primeiro.
3. No software de controle microfluídico, coloque o interruptor m na posição 5 (correspondente à amostra), ajuste a vazão da linha de amostragem para 8 μL/min e certifique-se de que a pressão da linha de amostra não exceda 350 mbar (Figura 2).
4. Repita as etapas 6.2 a 6.4 para medir a amostra.
   1. Para calcular as taxas de fluxo a serem usadas, certifique-se de que a diferença de dobra na taxa de fluxo corresponda ao fator de diluição da amostra desejado. Por exemplo, para atingir a diluição de 2000x aqui, as taxas de fluxo diferem por um fator de 2000; a taxa de fluxo do tampão é de 1000 μL/min e a taxa de fluxo da amostra é de 0,5 μL/min. No final de um experimento, sempre deixe as linhas limpas seguindo o protocolo de limpeza.

9. Análise dos dados

1. Quando a aquisição de dados estiver concluída, inicie o software de análise de dados (Figura 5).
2. Clique no ícone de mais (+) no canto superior esquerdo e selecione o arquivo calibrante .mp. O software começará a analisar o arquivo carregado. Dependendo do tamanho e do número de medições, isso pode levar alguns minutos
   1. Não analise arquivos .mp no software de análise de dados ao adquirir dados com software de aquisição de dados, pois isso pode reduzir a qualidade dos dados que estão sendo adquiridos.
3. Pressione o botão Criar calibração de massa (canto inferior direito). Uma caixa de diálogo será aberta mostrando uma tabela preenchida com os valores de contraste dos picos ajustados.
4. Altere os valores para os valores de massa conhecidos para os picos ajustados (para β-amilase, esses valores são 56 kDa, 112 kDa e 224 kDa) e pressione Salvar. O arquivo de calibração recém-criado (extensão .mc) aparecerá no painel Calibração de Massa (canto inferior esquerdo do software de análise de dados) (Figura 6).
5. Clique no ícone de adição (+) no canto superior esquerdo e selecione o arquivo de amostra .mp.
6. Para criar um histograma de massa, como mostrado na Figura 5, vá para a guia Analysis , selecione o modo Histogram e a opção Mass plot. Ajuste a largura do compartimento, os limites de massa e outros parâmetros conforme necessário.
7. Personalize ainda mais a plotagem na guia Imagens , se desejar, antes de exportar imagens e/ou salvar toda a área de trabalho como um arquivo .dmp.

Resultados

A fotometria de massa foi usada para medir a interação entre o anticorpo monoclonal IgG trastuzumabe e o domínio solúvel do receptor Fc neonatal IgG (FcRn). Uma mistura de 1:10 das duas proteínas (a 2 μM para IgG e 20 μM para FcRn) foi diluída manualmente para 10 nM e 20 nM em PBS, respectivamente.

A etapa de diluição é necessária porque a fotometria de massa, uma técnica de medição de massa de molécula única, só pode analisar amostras na faixa de 100 pM-100 nM. A tentativa de medir amostras com concentrações fora dessa faixa pode comprometer a precisão dos resultados (Figura 4). Este experimento não está incluído neste Protocolo, pois foi descrito anteriormente ^5,6.

Nos histogramas de massa produzidos em um experimento de fotometria de massa, a força do sinal de espalhamento (ou 'contraste') para cada evento de pouso é plotada no eixo x e é convertida em massa molecular por meio da etapa de calibração de contraste de massa. Enquanto isso, o eixo y indica o número de moléculas contadas com uma determinada massa (ou contraste). Portanto, um pico indica a presença de uma população de moléculas dentro da faixa de pesos moleculares mostrada no eixo x. O número de eventos (contagens) que compõem o pico reflete o tamanho dessa população.

A medição da fotometria de massa com diluição manual resultou em um histograma de massa onde os dois maiores picos, com base nos pesos moleculares esperados das proteínas, correspondiam a monômeros FcRn não ligados (~ 50 kDa) e monômeros de anticorpos IgG (~ 150 kDa) (Figura 7). Semelhante aos dados de fotometria de massa publicados anteriormente⁵, as espécies não ligadas eram proeminentes, enquanto os picos nas faixas de massa que corresponderiam aos complexos eram muito menos aparentes.

O experimento foi repetido usando um sistema microfluídico de diluição rápida para diluir a mistura até a concentração necessária imediatamente antes da medição da fotometria de massa. Essa abordagem permitiu a detecção de complexos adicionais de baixa afinidade, que podem ter se dissociado durante a etapa de diluição manual. Para atingir o mesmo fator de diluição de 2000x usado durante o experimento de diluição manual, a mistura de amostra 1:10 (na concentração de 2 μM para IgG e 20 μM para FcRn) foi fluída para o chip microfluídico a uma taxa de 0,5 μL / min, juntamente com o tampão PBS (pH 5,0) a uma taxa de fluxo de 1 mL / min. Para garantir que as proteínas não fossem degradadas no momento da medição, IgG (2 μM) e FcRn (20 μM) foram medidos sob fluxo com o sistema microfluídico após 120 min de incubação das amostras. As medições de controle individuais não mostraram degradação de proteínas (Figura Suplementar 1)

Para a amostra que sofreu diluição rápida, os picos correspondentes aos monômeros FcRn (53 kDa), dímeros FcRn (97 kDa) e monômeros IgG (148 kDa) puderam ser observados novamente. Além disso, dois picos adicionais foram claramente observados em 196 kDa e 251 kDa, correspondendo a complexos IgG-FcRn com estequiometrias 1:1 e 1:2 (Figura 7). As massas esperadas para esses dois complexos eram de 200 kDa e 250 kDa, respectivamente. A variabilidade na medida da massa está dentro do erro de medição para o fotômetro de massa utilizado neste estudo é de ±5%¹⁴ (2% para o complexo 1:1 e 0,4% para o complexo 1:2).

A presença desses complexos apenas na amostra rapidamente diluída é consistente com a ideia de que eles tendem a se dissociar em concentrações mais baixas, a uma taxa rápida em relação a um processo de diluição manual, mas lenta em relação ao processo de diluição rápida alcançado com o sistema microfluídico¹⁵.

Figura 1: Combinando microfluídica com fotometria de massa. (A,B) A caixa de microfluídica usada neste protocolo, vista da frente (A) e (B) superior. As soluções de limpeza são colocadas nas posições 1-3 e as amostras e calibrantes nas posições 4-6. Todas as soluções são conectadas ao m-switch, que é conectado ao sensor da unidade de fluxo "Pequeno". (C) Visão geral de todo o sistema. O computador (canto superior esquerdo) é conectado à caixa de microfluídica (mostrada ao lado do tampão e dos tubos de amostra) e ao fotômetro de massa (canto inferior direito), onde o chip microfluídico está localizado. O monitor de vazão pequena (FRMS) monitora o fluxo através da linha de amostra, enquanto o monitor de vazão grande (FRML) monitora o fluxo do buffer. A amostra e a tubulação da linha tampão se conectam a um canal no chip microfluídico, colocado dentro do fotômetro de massa. (D) Cada chip tem três canais. O FRMS é conectado à entrada de amostra e o FRML à entrada do buffer. A área do misturador é onde ocorre a diluição rápida da amostra, enquanto a área de observação é onde as medições de fotometria de massa são feitas. A saída é monitorada por um sensor de fluxo adicional para garantir que não haja vazamentos no chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O software de controle de microfluídica. Com este software, defina e monitore as taxas de fluxo, as linhas de pressão do sistema microfluídico e a posição do multi-switch (m-switch). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Identificando a presença de bolhas no óleo. Os exemplos do software de aquisição de dados mostram um anel de foco claro e ininterrupto (esquerda) e um anel 'quebrado', indicando a presença de bolhas de ar no óleo de imersão (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplos representativos de concentrações de amostras em que o número de eventos de pouso de moléculas é muito pequeno, ideal ou muito. As moléculas que pousam na superfície da área de observação no chip microfluídico aparecerão como manchas escuras na visão raciométrica da imagem de fotometria de massa. Idealmente, a concentração desejada deve permitir que uma densidade ideal de eventos de pouso ocorra durante a aquisição de dados (meio). Se a densidade do evento de pouso for muito baixa (superior, 'Muito poucos'), a análise estatística precisa dos dados de fotometria de massa não poderá ser concluída. Se for muito alto (inferior, 'Muitos'), as moléculas de pouso se sobreporão espacialmente, o que resultará em dados de baixa qualidade. Essas imagens foram capturadas com o software de aquisição de dados usando um fotômetro de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Uma captura de tela do software de análise de dados para fotometria de massa. Aqui, os arquivos .mp exportados do software de aquisição de dados podem ser carregados para analisar os dados. Os números podem ser gerados a partir dos dados processados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Uma captura de tela da calibração de contraste de massa para este experimento. O calibrante utilizado foi a β-amilase, que é conhecida por formar três espécies: monômero (56 kDa), dímero (112 kDa) e tetrâmero (224 kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Os histogramas de massa revelam a formação complexa somente após a rápida diluição da amostra. Histogramas de massa e distribuições gaussianas de melhor ajuste correspondentes são mostrados para medições de amostras contendo IgG e FcRn após diluição manual (laranja) ou diluição rápida via sistema microfluídico HC (azul). Os rótulos de massa indicam que os valores médios das curvas gaussianas se ajustam aos histogramas de massa medidos após diluição rápida. Após a diluição manual, foram observados picos correspondentes aos monômeros FcRn (52 kDa, medidos com diluição manual) e monômeros IgG (152 kDa). Após rápida diluição, além dos monômeros FcRn e IgG, também foram observados picos correspondentes aos dímeros FcRn e complexos IgG-FcRn com estequiometria 1:1 e 1:2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dados suplementares Figura 1: As medições de fotometria de massa de amostras de controle após diluição rápida não mostram degradação de proteínas. (A) Histograma de massa e distribuição gaussiana de melhor ajuste para a amostra somente FcRn. A concentração inicial da amostra antes da diluição rápida foi de 20 μM e a taxa de fluxo foi ajustada para 0,5 μL / min. Picos de massa correspondentes aos monômeros FcRn (53 kDa) e dímeros FcRn (97 kDa) puderam ser observados. (B) Histograma de massa e distribuição gaussiana mais adequada para a amostra apenas de IgG (Herceptin). A concentração inicial da amostra antes da diluição rápida foi de 2 μM e a taxa de fluxo foi ajustada para 1 μL / min. Um único pico de massa correspondente ao monômero IgG (155 kDa) pode ser observado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece um método para detectar e quantificar interações proteína-proteína de baixa afinidade. Ele usa um fotômetro de massa acoplado a um sistema microfluídico de diluição rápida. A fotometria de massa é uma ferramenta bioanalítica sem rótulo que pode medir de forma confiável a massa molecular em solução para biomoléculas¹⁶, para aquelas dentro da faixa de 30 kDa a 6 MDa. Como a fotometria de massa é uma técnica de molécula única que analisa as amostras uma a uma, geralmente é limitada a amostras na faixa de concentração de 100 pM-100 nM. Acima dessa faixa, as moléculas que pousam na superfície do vidro se sobrepõem espacialmente, resultando em dados de baixa qualidade; abaixo desse intervalo, poucos dados são obtidos para fazer análises robustas⁷. Uma consequência importante é que pode limitar a investigação das interações proteicas àquelas que formam uma mistura de espécies ligadas e não ligadas dentro dessa faixa.

Aqui, detalhamos um protocolo passo a passo para usar um sistema microfluídico de diluição rápida para expandir efetivamente a faixa de concentrações de amostras que são passíveis de fotometria em massa. Ao diluir a amostra no chip microfluídico e, em seguida, fluí-la pela janela de observação do detector em 50 ms, o sistema captura os complexos presentes na amostra não diluída antes que o equilíbrio de interação mude. A amostra é continuamente entregue ao detector durante medições individuais. Nessas condições, 95% do complexo permanecerá intacto quando a amostra for medida, mesmo para interações de baixa afinidade - com um K_D da ordem de micromolares e taxas de dissociação tão rápidas quanto 1 ^s-1.

Isso pode ser calculado da seguinte forma: Para uma reação com uma taxa direta k_fe uma taxa regressiva k_b,

Em equilíbrio, as concentrações de todas as três espécies (A, B e o complexo AB) permanecem constantes, assim e . Sob a suposição conservadora de que a perturbação (diluição, neste caso) pode fazer com que o complexo se dissocie, mas a reação direta (associação) não prossegue, o termo k_f [A] [B] pode ser tratado como insignificante, e a seguinte simplificação pode ser feita:

A integração dá a seguinte expressão para a concentração do complexo no tempo após a perturbação do equilíbrio:

A fração do complexo que permanece ligada no tempo t após a perturbação do equilíbrio é assim:

Em = 50 ms, para uma reação com k_b≈ 1 ^s-1, o limite da fração é 0,95, ou 95%^11,12.

A fotometria de massa foi usada aqui e anteriormente⁵ para investigar a ligação do anticorpo monoclonal IgG trastuzumabe ao domínio solúvel do FcRn. Foi relatado que os dois parceiros de ligação se ligam com afinidade nanomolar em pH ácido¹⁷. A fotometria de massa foi usada para avaliar qualitativamente a abundância dos complexos formados enquanto os parceiros de ligação estavam em pH 5,0, e as amostras foram rapidamente diluídas por meio de um sistema microfluídico adicional. O procedimento foi otimizado para a interação proteína-proteína específica com base em resultados relatados anteriormente⁵. O mesmo procedimento pode ser usado para estudar outras interações, desde que os usuários tenham conhecimento prévio ou otimizem as condições experimentais para o sistema em questão, como quais tampões usar, a concentração inicial de proteínas, a estequiometria esperada e a quantidade de incubação necessária para permitir que a interação atinja um equilíbrio.

Quando a mistura IgG-FcRn foi diluída manualmente, foi difícil detectar a presença de complexos IgG-FcRn, embora essas proteínas sejam conhecidas por interagir⁵. Este artigo mostra que a abordagem de diluição rápida resulta em um aumento notável da quantidade desses complexos. Para a mesma amostra, quando a diluição rápida foi usada, os complexos FcRn-IgG 1:1 e os complexos FcRn-IgG 2:1 foram claramente observados. Essas diferenças na formação de complexos demonstram a importância de estudar sistemas de interação biomolecular em uma ampla gama de concentrações.

Além disso, esses resultados também demonstram que é simples usar microfluídica com análise de molécula única para capturar interações fracas - preenchendo uma lacuna significativa no método. A combinação de microfluídica de diluição rápida com fotometria de massa oferece vantagens atraentes devido às vantagens da fotometria de massa como técnica analítica. Ou seja, a fotometria de massa não requer rótulos, envolve uma preparação mínima da amostra e as medições são feitas em solução. Para este protocolo, outra vantagem importante da fotometria de massa é sua capacidade de distinguir e quantificar todas as espécies formadas (desde que tenham uma massa distinta de >30 kDa). Isso contrasta com o SPR, por exemplo, que pode medir as taxas de ligação e desvinculação, mas não pode fornecer prontamente informações estequiométricas⁸.

Para este protocolo, bem como experimentos de fotometria de massa em geral, várias considerações são úteis. Primeiro, a concentração final da proteína deve estar dentro do limite do que a fotometria de massa pode medir (100 pM-100 nM). A concentração inicial de incubação também deve estar dentro da faixa do sistema microfluídico (até 90 μM) e teorizada como acima do K_D real da interação¹⁰. O ponto de partida recomendado é uma proporção de mistura de concentração de 1:1 entre as espécies que interagem na concentração de μM. A proporção pode então ser variada para 1:2, 1:5 ou, como no caso dessa interação, 1:10. Se não houver informações prévias sobre as interações proteicas, o usuário teria que otimizar o experimento, começando com uma alta concentração (recomendado 20 μM) para cada parceiro para determinar se a afinidade dos componentes está dentro da faixa de concentração sustentada pelo método apresentado (ou seja, complexos são formados). A otimização também pode envolver a escolha de outras condições de buffer para promover as interações ou titulação de um dos componentes de interação para determinar a proporção de mistura correta. Uma vez determinados, é possível otimizar as concentrações e fluxos para permitir condições ideais para o estudo e o método, por exemplo, diminuindo as concentrações para permitir uma melhor resolução de pico.

Em segundo lugar, para replicar com sucesso este experimento, as impurezas devem ser minimizadas. Fontes comuns de impurezas que afetam adversamente as medições de fotometria de massa incluem outras proteínas ou detritos celulares que permanecem após a purificação, tampões não filtrados, detergentes formadores de micela (se presentes em uma concentração muito alta) e tampões contendo altas concentrações de sal, glicerol ou outros componentes. Conforme discutido no Protocolo acima, as bolhas no sistema microfluídico devem ser removidas. Bolhas podem se formar no sistema de tubulação ou se as amostras tiverem alta tensão superficial e forem propensas à formação de espuma. Bolhas também podem se formar no óleo de imersão, que podem ser detectadas a partir do anel de foco (Figura 3). Se as bolhas não puderem ser removidas usando as etapas descritas no protocolo, outra solução é desgaseificar a amostra usando um dessecador e uma bomba de vácuo, deixando a amostra sob pressão reduzida por alguns minutos. Não é recomendado o vórtice ou agitação de soluções proteicas altamente concentradas, pois essas ações podem promover a formação de bolhas.

Embora a medição de uma interação proteína-proteína específica seja demonstrada aqui, o mesmo protocolo pode ser aplicado a outros sistemas de interação proteína-proteína sem modificação significativa. Uma outra direção futura deste protocolo seria usar as medições para calcular os valores de K_D para os complexos identificados, como foi descrito em outro lugar no contexto da fotometria de massa ^5,7. Embora os estudos anteriores tenham usado dados de experimentos envolvendo diluição manual e interações mais fortes, o princípio de análise pode ser prontamente aplicado neste contexto - desde que outras melhorias no dispositivo microfluídico sejam implementadas (como maior precisão do sensor de fluxo e estabilidade da bomba).

Além das interações proteína-proteína, é provável que haja aplicações mais amplas para a abordagem combinada de fotometria de massa e microfluídica de diluição rápida. A fotometria de massa pode ser usada para avaliar a pureza, agregação e homogeneidade da amostra^18,19; estudar oligomerização de proteínas²⁰, montagem macromolecular²¹ ou polimerização²²; e em outras áreas. A análise de fotometria de massa também se estende além das proteínas; Tem sido usado para investigar interações entre ácidos nucléicos e proteínas²³, partículas virais²⁴ e nanopartículas²⁵. Este protocolo descreve, portanto, uma importante aplicação de um sistema microfluídico de fotometria de massa combinado - ele permite a medição direta de interações proteína-proteína fracas no nível de moléculas e complexos individuais. O valor da presente aplicação é alto, pois abre a possibilidade de caracterizar diretamente interações que geralmente têm sido difíceis de estudar - com relevância em áreas terapêuticas críticas. Essa abordagem combinada também pode servir de base para uma gama mais ampla de investigações para amostras com concentrações de até dezenas de micromolares.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Software de aquisição de dados	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Software de análise de dados	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Fotômetro de massa	Refeyn	TwoMP
Caixa microfluídica	Refeyn	MassFluidix HC Chip
microfluídico	Chip Refeyn	MassFluidix HC
Software de controle microfluídico	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Hidróxido de Sódio (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amilase, de batata-doce	Sigma	A8781