Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

As interações proteína-proteína sublinham a maioria das funções celulares, desde a regulação imunológica até a replicação e tradução do DNA. Como resultado, há uma necessidade fundamental em todas as ciências da vida de investigar uma vasta gama de interações em diversos complexos heterogêneos que são comumente formados. No entanto, sua detecção, caracterização e quantificação são muitas vezes desafiadoras, principalmente para interações de baixa afinidade¹.

Os ensaios de imunoprecipitação são frequentemente usados para detectar interações de alta afinidade, mas para interações transitórias e de baixa afinidade, a detecção é amplamente inviável². Técnicas de fluorescência também podem ser usadas, mas requerem a adição potencialmente disruptiva de marcadores fluorescentes². O Cryo-EM pode fornecer um instantâneo estrutural e uma leitura de conjunto dos complexos de proteínas formados com alta resolução espacial, mas também normalmente requer trabalhar em concentrações muito baixas para imagens de interações de baixa afinidade. O Cryo-EM também traz desafios relacionados ao custo, acessibilidade, preparação da amostra e tempo de análise³.

Além disso, a ressonância plasmônica de superfície (SPR) tornou-se uma forma popular de quantificar as interações proteína-proteína, embora exija imobilização proteica, o que pode afetar o equilíbrio de ligação e resultar em taxas de ativação variáveis, reduzindo assim a precisão da medição ^4,5. Também envolve várias etapas do ensaio antes da coleta e análise dos dados⁶.

A fotometria de massa é uma técnica de molécula única que tem sido usada para analisar as interações proteína-proteína ^5,6,7. Ele funciona medindo a massa de moléculas individuais ou complexos com base na luz que eles espalham quando pousam na superfície de uma lamínula de vidro⁸. Medições de fotometria de massa têm sido usadas para quantificar as afinidades de ligação da abundância relativa de parceiros de ligação e os complexos que eles formam⁵. No entanto, como outras técnicas de molécula única, a concentração da amostra a ser medida deve ser normalmente inferior a 100 nM. Se a concentração for maior, as moléculas que pousam na superfície do vidro se sobrepõem espacialmente, resultando em dados de baixa qualidade⁷. Consequentemente, interações mais fracas (K_D ~ micromolares), que se dissociam nessas concentrações mais baixas, não podem ser medidas de forma confiável, uma vez que não é possível observar a mistura necessária de espécies não ligadas e ligadas⁵.

Aqui, descrevemos uma abordagem que supera essa limitação com base em um novo dispositivo de fotometria de massa microfluídica acoplada. Especificamente, um sistema microfluídico é usado em combinação com o fotômetro de massa para expandir efetivamente a gama de interações que podem ser quantificadas por fotometria de massa. A microfluídica demonstrou oferecer uma gama de possibilidades para investigar interações proteína-proteína, incluindo diluição rápida para detectar interações fracas ^1,9. O sistema aqui descrito opera diluindo rapidamente a amostra em até 10.000 vezes em um chip microfluídico e fluindo-a imediatamente pela área de observação do chip, permitindo que a medição da fotometria de massa comece dentro de 50 ms a partir do momento em que as moléculas iniciaram o processo de diluição¹⁰. A diluição ocorre quando a amostra e o tampão são combinados em um misturador de válvula Tesla reverso no chip, com as taxas de fluxo relativas das duas soluções determinando a quantidade de diluição que ocorre (consulte a etapa 8 do protocolo). A vazão é controlável com o software de controle microfluídico. Alterar a vazão pode alterar a população relativa da espécie, pois pode afetar o número de eventos de pouso na superfície do vidro, que é o que é medido pelo fotômetro de massa.

A velocidade do processo é rápida o suficiente para que a medição seja concluída antes que a integridade da interação seja interrompida (para mais detalhes, consulte também a Discussão). Isso pode ser entendido através de uma breve olhada na teoria das reações de primeira ordem, onde . A constante de taxa direta (associação) é k_f, a constante de taxa inversa (dissociação) é k_b e a constante de dissociação de equilíbrio (K_D) é definida como

K_D= k_b/ k_f

Para a ligação às proteínas, k_fé geralmente limitado pela difusão dos reagentes¹¹ e, portanto, é restrito à faixa de 10^{6-10 7 M-1} · ^s-1. Como o intervalo de é limitado, uma reação de baixa afinidade (K_D ~ micromolares) terá k_b≈ 1 ^s-1. Ou seja, k_b = k_f  · K_D= (10^{6 M-1}·^s-1) (10-6 M) = 1 ^s-1, com meia-vida do complexo em torno de 0,7 s^11,12.

Nosso sistema de exemplo é a ligação do anticorpo monoclonal IgG trastuzumabe ao domínio solúvel do receptor Fc neonatal IgG (FcRn), que são conhecidos parceiros de interação¹³. Dados publicados anteriormente obtidos usando apenas fotometria de massa convencional (ou seja, com diluição manual de amostras) mostraram que as proteínas formam várias espécies. Monômeros de FcRn, dímeros de FcRn e IgG não ligados foram claramente visíveis, enquanto complexos IgG-FcRn (nas proporções de 1:1 e 1:2) também foram detectados (em pH 5,0), mas apenas com abundância muito baixa⁵. Essa observação levanta a questão de saber se a formação do complexo IgG-FcRn poderia ser detectada com mais clareza se medida em uma concentração mais alta. De fato, a combinação de fotometria de massa com uma abordagem de diluição rápida acoplada descrita aqui forneceu evidências mais robustas de formação complexa por um aumento em suas partículas medidas.

O protocolo de fotometria de massa e microfluídica aqui descrito permite caracterizar a formação de complexos com K_D até a faixa micromolar. Uma determinação empírica do K_D exigirá melhorias adicionais na precisão do sensor de fluxo, estabilidade da bomba, variações de chip a chip e localização de medição dentro da janela de observação, pois todos esses fatores influenciariam o tempo desde o momento em que a amostra é diluída até a medição.

A mesma abordagem pode ser aplicada para investigar a ligação entre quaisquer proteínas solúveis, desde que tenham pesos moleculares distintos (separados por pelo menos 25 kDa) que se enquadrem na faixa adequada para análise com um fotômetro de massa (30 kDa a 6 MDa). Os insights obtidos podem ser úteis para estudos em uma variedade de contextos - desde a obtenção de uma compreensão mecanicista das funções celulares até o design de novos medicamentos bioterapêuticos.

1. Preparação dos instrumentos e lançamento do software

1. Ligue o fotômetro de massa e deixe-o ligado por pelo menos 1 h antes de iniciar qualquer medição.
   NOTA: Isso ocorre porque o instrumento precisa atingir uma temperatura constante. Não deixar o fotômetro de massa ligado por 1 h pode levar a um deslocamento de massa e, portanto, a resultados imprecisos.
2. Ligue a mesa antivibração ligando a energia e pressionando o botão de isolamento (sob o fotômetro de massa). As vibrações limitam o desempenho do instrumento de fotometria de massa, portanto, a tabela antivibração é importante para garantir a máxima sensibilidade do instrumento. Ligue a caixa de microfluídica.
3. Inicie o software de aquisição de dados e o software de controle de microfluídica. Ligue o compressor de ar.

2. Preparação de amostras de proteínas, tampão e soluções de limpeza

1. Adicione 200 mL de tampão PBS (pH 7,4) a um frasco limpo de 200 mL e 200 mL de tampão PBS (pH 5,0) a um segundo frasco de 200 mL.
   NOTA: Os frascos de 200 mL precisarão ser conectados ao sensor da unidade de fluxo "L" nas próximas etapas. Use tampão PBS de pH 7,4 para a medição de calibração e tampão PBS de pH 5,0 para a medição da amostra.
2. Em um tubo de centrífuga de 0,5 mL, misture IgG (2 μM) e FcRn (20 μM) na proporção de 1:10 para um volume total de 60 μL.
   1. As soluções estoque para FcRn e IgG são 91,9 μM e 13,5 μM, respectivamente. Prepare a reação misturando 9 μL de IgG estoque + 13 μL de FcRn estoque + 38 μL de PBS (pH 5,0, temperatura ambiente [RT]) em um tubo de centrífuga para um volume total de 60 μL. As concentrações finais para os dois reagentes foram de 2 μM para IgG e 20 μM para FcRn. Mantenha todos os estoques de proteínas no gelo durante todo esse processo.
3. Em outro tubo de centrífuga de 0,5 mL, dispense 20 μL do calibrante β-amilase na concentração de 20 μM.
   1. A título de exemplo, para preparar o calibrante de β-amilase aqui utilizado, seguir o procedimento descrito nos pontos 2.3.1.1-2.3.1.2.
      1. Ressuspenda 20 mg de pó de β-amilase no frasco para injetáveis em 3,57 mL de PBS (glicerol a 5%), correspondendo a 5,6 mg / mL e uma concentração molar de 100 μM (já que o peso molecular é de 56 kDa).
      2. Para diluir a 20 μM, combine 200 μL do estoque de 100 μM com 800 μL de PBS (pH 7,4, RT) em um tubo de centrífuga de 1 mL.
4. Incubar as amostras em RT durante pelo menos 30 min.
   NOTA: Comece a preparar a amostra e as diluições do calibrante depois de ligar o fotômetro de massa. Para este experimento, as amostras foram incubadas por 120 min.
5. Em três tubos de centrífuga de 50 mL, alíquotas: 50 mL de PBS (pH 7,4) - solução de limpeza 1 (CS1), 50 mL de NaOH 0,5 M - solução de limpeza 2 (CS2) e 50 mL de IPA 100% - solução de limpeza 3 (CS3).

3. Configuração experimental

1. Para carregar a amostra e o calibrante, coloque o tubo centrífugo calibrante na posição 4 e o tubo centrífugo de amostra na posição 5 da caixa microfluídica (Figura 1).
2. Para carregar as soluções de limpeza, coloque CS1, CS2 e CS3 nas posições 1, 2 e 3 da caixa de microfluídica (Figura 1).
   NOTA: A amostra, o calibrante e as soluções de limpeza são conectados ao multi-switch (m-switch). O interruptor m é conectado ao sensor da unidade de fluxo "S".
3. Enrosque a tampa que se conecta à linha tampão no frasco tampão de 200 mL (pH 7,4).
   NOTA: A linha tampão é conectada a uma válvula de corte, que é conectada ao sensor da unidade de fluxo "L". A válvula de corte evita quaisquer efeitos de sifão que possam ocorrer quando o fluxo do buffer é interrompido. O sifonamento pode levar à contaminação do tampão pelo fluido residual diluído que retorna ao reservatório do tampão.
4. Coloque o chip microfluídico em uma placa de preparação.
   Empurre a outra extremidade do tubo do sensor da unidade de fluxo "S" na "Entrada de amostras" do primeiro canal no chip microfluídico (Figura 1). A linha de amostra está completa.
5. Empurre a outra extremidade do tubo do sensor da unidade de fluxo "L" na "entrada do buffer" do primeiro canal no chip microfluídico (Figura 1). A linha de buffer está completa.
6. Para coletar a saída, empurre um tubo para a "Saída" do primeiro canal no chip microfluídico; Posicionar a outra extremidade de modo a que seja drenada para um balão ou copo receptável de resíduos (figura 1).

4. Preparando as linhas de amostra e tampão com tampão

1. Abra a válvula de corte manual na linha tampão.
2. No software de controle microfluídico, defina a vazão da linha tampão para 1000 μL/min e certifique-se de que a pressão da linha tampão não exceda 110 mbar (Figura 2). O fluxo começará automaticamente na linha de buffer (Figura 1).
   NOTA: Se a pressão da linha de buffer exceder 110 mbar, pode ser devido à passagem de ar pelo sensor de fluxo. Se a pressão não voltar ao normal em alguns segundos, há potencialmente um bloqueio (geralmente devido a tubos comprimidos nas conexões). Nesse caso, pare o fluxo e verifique as conexões na linha tampão, começando pela válvula de corte.
3. No software de controle microfluídico, selecione a posição 1 do interruptor m (correspondente ao tampão PBS), defina a vazão da linha de amostra para 8 μL/min e certifique-se de que a pressão da linha de amostra não exceda 350 mbar. O fluxo começará automaticamente na linha de amostra (Figura 1).
4. Use uma ponta de pipeta (ou outro componente de plástico macio) para aplicar uma leve pressão de cima perto da(s) bolha(s) presa(s) no chip para desalojar as bolhas de ar e garantir que sejam removidas pela saída.
   NOTA: Certifique-se de remover todas as bolhas nas seções 'mixer' e 'área de observação' (Figura 1) do canal em uso. Tome cuidado para não empurrar com muita força, pois isso pode danificar o chip.

5. Colocando o chip microfluídico no fotômetro de massa e encontrando o foco

1. Aplique uma gota de óleo de imersão no microscópio na objetiva do fotômetro de massa.
2. Coloque o chip microfluídico no suporte do fotômetro de massa com a "Entrada de amostra" voltada para cima e segure-o preso ao stage clamps (Figura 1). Certifique-se de que todas as conexões da tubulação permaneçam conectadas.
3. Usando o software de aquisição de dados, mova o palco para garantir que a "Área de observação" do canal 1 esteja alinhada com o objetivo (Figura 1).
4. Feche a tampa do fotômetro de massa e pressione a opção Gotícula-Diluição Encontrar Foco no software de aquisição de dados.
5. Verifique o anel de foco branco no canto inferior esquerdo do software de aquisição de dados (Figura 3). Lacunas no anel indicam a presença de uma bolha de ar no óleo de imersão; Remova isso aumentando a velocidade do palco ao máximo e movendo suavemente o palco lateralmente.
6. Após a conclusão da focagem, aguarde 2-3 minutos antes de fazer a primeira gravação. Em seguida, pressione Gravar para registrar uma medição de 1 minuto e certifique-se (observando a medição) de que nenhuma impureza apareça.
   NOTA: As impurezas podem estar na superfície do vidro ou no tampão. O valor de nitidez no software de aquisição de dados deve estar acima de 4,5%.

6. Calibração de fotometria de massa

1. No software de controle microfluídico, coloque o interruptor m na posição 4 (correspondente ao calibrante) e certifique-se de que a vazão da linha de amostra esteja ajustada em 8 μL/min e que a pressão da linha de amostra não exceda 350 mbar (Figura 2).
   1. O calibrante iniciará o fluxo através do chip. Aguarde aproximadamente 1.5-2.5 min (ou até que o calibrante seja visto de forma consistente no software de aquisição de dados). O tempo pode variar de acordo com o comprimento da tubulação da linha de amostra.
2. Uma vez que o calibrante seja visto de forma consistente (ou seja, o número de eventos é suficiente para uma medição precisa de fotometria de massa), no software de controle microfluídico, reduza a taxa de fluxo para 0,5 μL / min - o nível de diluição alvo para este experimento.
   NOTA: Começar com uma taxa de fluxo mais alta simplesmente reduz o tempo necessário para o calibrante chegar ao chip.
3. Certifique-se de que não haja "poucas" ou "muitas" moléculas pousando na superfície de medição (Figura 4).
   1. Se a densidade do evento de pouso não for "ideal" (Figura 4), altere a taxa de fluxo no software de controle microfluídico. Se a densidade do evento for muito baixa, aumente a taxa de fluxo de amostra até que eventos de pouso bem separados sejam observados (mas não exceda 8 μL / min). Se estiver muito alto, reduza a taxa de fluxo de amostra (mas não fique abaixo de 0,1 μL / min).
   2. Se o volume do calibrante estiver baixo no sample tubo, mude a posição do interruptor m para a linha PBS pH 7.4 (posição 1) para evitar a injeção de ar.
4. Pressione Gravar e faça uma medição de 60 s. Salve o arquivo em uma pasta escolhida.
   NOTA: O software de aquisição de dados produz arquivos com .mp como extensão.

7. Limpando a linha de amostra e interrompendo o fluxo

1. No software de controle microfluídico, mude para a posição 2 do m-switch e altere a pressão da amostra para 800 mbar (Figura 2). Lave o sistema com CS2 (NaOH) por 4 min.
2. Mude para a posição 3 do m-switch e lave o sistema com CS3 (IPA) por 4 min.
3. Mude para a posição 1 do m-switch e lave o sistema com CS1 (PBS) por 4 min.
4. No software de controle microfluídico, pare todo o fluxo definindo as pressões da linha de amostragem e da linha tampão para 0 e desligue a válvula tampão.
5. Desconecte o chip do stage e coloque-o de volta na placa de preparação. Desconecte todos os tubos e coloque o sample extremidade do tubo em um frasco de resíduos. Limpe a objetiva com isopropanol e lenços umedecidos.

8. Medição da amostra de fotometria de massa

1. Desaperte a tampa conectada ao frasco tampão de 200 mL (pH 7.4) e aparafuse-a ao frasco tampão de 200 mL (pH 5.0).
2. Repita as etapas 3.4-5.6, mas use o segundo canal do chip em vez do primeiro.
3. No software de controle microfluídico, coloque o interruptor m na posição 5 (correspondente à amostra), ajuste a vazão da linha de amostragem para 8 μL/min e certifique-se de que a pressão da linha de amostra não exceda 350 mbar (Figura 2).
4. Repita as etapas 6.2 a 6.4 para medir a amostra.
   1. Para calcular as taxas de fluxo a serem usadas, certifique-se de que a diferença de dobra na taxa de fluxo corresponda ao fator de diluição da amostra desejado. Por exemplo, para atingir a diluição de 2000x aqui, as taxas de fluxo diferem por um fator de 2000; a taxa de fluxo do tampão é de 1000 μL/min e a taxa de fluxo da amostra é de 0,5 μL/min. No final de um experimento, sempre deixe as linhas limpas seguindo o protocolo de limpeza.

9. Análise dos dados

1. Quando a aquisição de dados estiver concluída, inicie o software de análise de dados (Figura 5).
2. Clique no ícone de mais (+) no canto superior esquerdo e selecione o arquivo calibrante .mp. O software começará a analisar o arquivo carregado. Dependendo do tamanho e do número de medições, isso pode levar alguns minutos
   1. Não analise arquivos .mp no software de análise de dados ao adquirir dados com software de aquisição de dados, pois isso pode reduzir a qualidade dos dados que estão sendo adquiridos.
3. Pressione o botão Criar calibração de massa (canto inferior direito). Uma caixa de diálogo será aberta mostrando uma tabela preenchida com os valores de contraste dos picos ajustados.
4. Altere os valores para os valores de massa conhecidos para os picos ajustados (para β-amilase, esses valores são 56 kDa, 112 kDa e 224 kDa) e pressione Salvar. O arquivo de calibração recém-criado (extensão .mc) aparecerá no painel Calibração de Massa (canto inferior esquerdo do software de análise de dados) (Figura 6).
5. Clique no ícone de adição (+) no canto superior esquerdo e selecione o arquivo de amostra .mp.
6. Para criar um histograma de massa, como mostrado na Figura 5, vá para a guia Analysis , selecione o modo Histogram e a opção Mass plot. Ajuste a largura do compartimento, os limites de massa e outros parâmetros conforme necessário.
7. Personalize ainda mais a plotagem na guia Imagens , se desejar, antes de exportar imagens e/ou salvar toda a área de trabalho como um arquivo .dmp.

A fotometria de massa foi usada para medir a interação entre o anticorpo monoclonal IgG trastuzumabe e o domínio solúvel do receptor Fc neonatal IgG (FcRn). Uma mistura de 1:10 das duas proteínas (a 2 μM para IgG e 20 μM para FcRn) foi diluída manualmente para 10 nM e 20 nM em PBS, respectivamente.

A etapa de diluição é necessária porque a fotometria de massa, uma técnica de medição de massa de molécula única, só pode analisar amostras na faixa de 100 pM-100 nM. A tentativa de medir amostras com concentrações fora dessa faixa pode comprometer a precisão dos resultados (Figura 4). Este experimento não está incluído neste Protocolo, pois foi descrito anteriormente 5,6.

Nos histogramas de massa produzidos em um experimento de fotometria de massa, a força do sinal de espalhamento (ou 'contraste') para cada evento de pouso é plotada no eixo x e é convertida em massa molecular por meio da etapa de calibração de contraste de massa. Enquanto isso, o eixo y indica o número de moléculas contadas com uma determinada massa (ou contraste). Portanto, um pico indica a presença de uma população de moléculas dentro da faixa de pesos moleculares mostrada no eixo x. O número de eventos (contagens) que compõem o pico reflete o tamanho dessa população.

A medição da fotometria de massa com diluição manual resultou em um histograma de massa onde os dois maiores picos, com base nos pesos moleculares esperados das proteínas, correspondiam a monômeros FcRn não ligados (~ 50 kDa) e monômeros de anticorpos IgG (~ 150 kDa) (Figura 7). Semelhante aos dados de fotometria de massa publicados anteriormente5, as espécies não ligadas eram proeminentes, enquanto os picos nas faixas de massa que corresponderiam aos complexos eram muito menos aparentes.

O experimento foi repetido usando um sistema microfluídico de diluição rápida para diluir a mistura até a concentração necessária imediatamente antes da medição da fotometria de massa. Essa abordagem permitiu a detecção de complexos adicionais de baixa afinidade, que podem ter se dissociado durante a etapa de diluição manual. Para atingir o mesmo fator de diluição de 2000x usado durante o experimento de diluição manual, a mistura de amostra 1:10 (na concentração de 2 μM para IgG e 20 μM para FcRn) foi fluída para o chip microfluídico a uma taxa de 0,5 μL / min, juntamente com o tampão PBS (pH 5,0) a uma taxa de fluxo de 1 mL / min. Para garantir que as proteínas não fossem degradadas no momento da medição, IgG (2 μM) e FcRn (20 μM) foram medidos sob fluxo com o sistema microfluídico após 120 min de incubação das amostras. As medições de controle individuais não mostraram degradação de proteínas (Figura Suplementar 1)

Para a amostra que sofreu diluição rápida, os picos correspondentes aos monômeros FcRn (53 kDa), dímeros FcRn (97 kDa) e monômeros IgG (148 kDa) puderam ser observados novamente. Além disso, dois picos adicionais foram claramente observados em 196 kDa e 251 kDa, correspondendo a complexos IgG-FcRn com estequiometrias 1:1 e 1:2 (Figura 7). As massas esperadas para esses dois complexos eram de 200 kDa e 250 kDa, respectivamente. A variabilidade na medida da massa está dentro do erro de medição para o fotômetro de massa utilizado neste estudo é de ±5%14 (2% para o complexo 1:1 e 0,4% para o complexo 1:2).

A presença desses complexos apenas na amostra rapidamente diluída é consistente com a ideia de que eles tendem a se dissociar em concentrações mais baixas, a uma taxa rápida em relação a um processo de diluição manual, mas lenta em relação ao processo de diluição rápida alcançado com o sistema microfluídico15.

Figura 1: Combinando microfluídica com fotometria de massa. (A,B) A caixa de microfluídica usada neste protocolo, vista da frente (A) e (B) superior. As soluções de limpeza são colocadas nas posições 1-3 e as amostras e calibrantes nas posições 4-6. Todas as soluções são conectadas ao m-switch, que é conectado ao sensor da unidade de fluxo "Pequeno". (C) Visão geral de todo o sistema. O computador (canto superior esquerdo) é conectado à caixa de microfluídica (mostrada ao lado do tampão e dos tubos de amostra) e ao fotômetro de massa (canto inferior direito), onde o chip microfluídico está localizado. O monitor de vazão pequena (FRMS) monitora o fluxo através da linha de amostra, enquanto o monitor de vazão grande (FRML) monitora o fluxo do buffer. A amostra e a tubulação da linha tampão se conectam a um canal no chip microfluídico, colocado dentro do fotômetro de massa. (D) Cada chip tem três canais. O FRMS é conectado à entrada de amostra e o FRML à entrada do buffer. A área do misturador é onde ocorre a diluição rápida da amostra, enquanto a área de observação é onde as medições de fotometria de massa são feitas. A saída é monitorada por um sensor de fluxo adicional para garantir que não haja vazamentos no chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O software de controle de microfluídica. Com este software, defina e monitore as taxas de fluxo, as linhas de pressão do sistema microfluídico e a posição do multi-switch (m-switch). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Identificando a presença de bolhas no óleo. Os exemplos do software de aquisição de dados mostram um anel de foco claro e ininterrupto (esquerda) e um anel 'quebrado', indicando a presença de bolhas de ar no óleo de imersão (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplos representativos de concentrações de amostras em que o número de eventos de pouso de moléculas é muito pequeno, ideal ou muito. As moléculas que pousam na superfície da área de observação no chip microfluídico aparecerão como manchas escuras na visão raciométrica da imagem de fotometria de massa. Idealmente, a concentração desejada deve permitir que uma densidade ideal de eventos de pouso ocorra durante a aquisição de dados (meio). Se a densidade do evento de pouso for muito baixa (superior, 'Muito poucos'), a análise estatística precisa dos dados de fotometria de massa não poderá ser concluída. Se for muito alto (inferior, 'Muitos'), as moléculas de pouso se sobreporão espacialmente, o que resultará em dados de baixa qualidade. Essas imagens foram capturadas com o software de aquisição de dados usando um fotômetro de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Uma captura de tela do software de análise de dados para fotometria de massa. Aqui, os arquivos .mp exportados do software de aquisição de dados podem ser carregados para analisar os dados. Os números podem ser gerados a partir dos dados processados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Uma captura de tela da calibração de contraste de massa para este experimento. O calibrante utilizado foi a β-amilase, que é conhecida por formar três espécies: monômero (56 kDa), dímero (112 kDa) e tetrâmero (224 kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Os histogramas de massa revelam a formação complexa somente após a rápida diluição da amostra. Histogramas de massa e distribuições gaussianas de melhor ajuste correspondentes são mostrados para medições de amostras contendo IgG e FcRn após diluição manual (laranja) ou diluição rápida via sistema microfluídico HC (azul). Os rótulos de massa indicam que os valores médios das curvas gaussianas se ajustam aos histogramas de massa medidos após diluição rápida. Após a diluição manual, foram observados picos correspondentes aos monômeros FcRn (52 kDa, medidos com diluição manual) e monômeros IgG (152 kDa). Após rápida diluição, além dos monômeros FcRn e IgG, também foram observados picos correspondentes aos dímeros FcRn e complexos IgG-FcRn com estequiometria 1:1 e 1:2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dados suplementares Figura 1: As medições de fotometria de massa de amostras de controle após diluição rápida não mostram degradação de proteínas. (A) Histograma de massa e distribuição gaussiana de melhor ajuste para a amostra somente FcRn. A concentração inicial da amostra antes da diluição rápida foi de 20 μM e a taxa de fluxo foi ajustada para 0,5 μL / min. Picos de massa correspondentes aos monômeros FcRn (53 kDa) e dímeros FcRn (97 kDa) puderam ser observados. (B) Histograma de massa e distribuição gaussiana mais adequada para a amostra apenas de IgG (Herceptin). A concentração inicial da amostra antes da diluição rápida foi de 2 μM e a taxa de fluxo foi ajustada para 1 μL / min. Um único pico de massa correspondente ao monômero IgG (155 kDa) pode ser observado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Myndert Claasen e Zornitsa Kofinova são funcionários da Refeyn Ltd, que produz o fotômetro de massa e o sistema microfluídico usado neste artigo. Weston Struwe é acionista e consultor da Refeyn Ltd.