Lesão por congelamento no músculo masseter de camundongo para estabelecer um modelo de fibrose muscular orofacial

Os músculos orofaciais são críticos nas atividades fisiológicas diárias, como mastigação, fala, respiração e expressão facial¹. Nas deformidades orofaciais congênitas, no entanto, esses músculos apresentam alterações atróficas e fibróticas, levando a comprometimento da saúde corporal e da cognição social². A cirurgia reconstrutiva facial continua sendo o tratamento de primeira linha, mas até 30-70% dos pacientes pós-operatórios ainda sofrem de perda muscular e disfunção muscular ^3,4 A falha na regeneração da musculatura orofacial tem sido atribuída a fatores intrínsecos, que não podem ser corrigidos apenas pela cirurgia.

O surgimento da musculatura orofacial é uma novidade evolutiva, acompanhando a complexa cabeça dos vertebrados e o coração compartimentado ^5,6. Ao contrário de seus homólogos derivados de somitos dos membros, os músculos orofaciais se originam do arco branquial⁷. Esses caracteres filogenéticos e ontogenéticos podem predispô-los a comportamentos regenerativos distintos⁸. Foi relatado que o músculo masseter (MAS) desenvolveu fibrose grave no momento em que o músculo tibial anterior (TA) se regenerou totalmente após exposição à mesma extensão da lesão ^1,9. No entanto, o mecanismo subjacente da regeneração permanece pouco compreendido.

Neste estudo, um modelo de lesão por congelamento do músculo masseter de camundongos foi estabelecido para facilitar a investigação da regeneração do músculo orofacial. Escolhemos 14 dias após a lesão como o momento para avaliar o fenótipo da fibrose, pois foi o primeiro momento em que a divergência discernível foi detectável entre dois músculos. A regeneração completa da SAM após a lesão requer pelo menos 40 semanas¹. Consistentemente, este estudo revelou uma deposição notável de colágeno após lesão por congelamento de MAS em comparação com a regeneração regular do TA 14 dias após a lesão. Com a ajuda deste modelo, mais estudos mecanísticos de atrofia e fibrose muscular podem ser realizados, o que, por sua vez, ajudará no desenvolvimento de potenciais vias terapêuticas para promover a regeneração do músculo orofacial após a cirurgia.

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2020-114). Camundongos C57BL / 6 machos (5 semanas de idade) foram criados em uma instalação com umidade controlada (53 ± 2%) e temperatura controlada (23 ± 2 ° C) e estavam em um ciclo claro/escuro de 12 horas. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Lesão por congelamento

1. Anestesia: Sedar os camundongos com bolas de algodão embebidas em isoflurano e injetar tiletamina-zolazepam por via intraperitoneal na dose de 50 mg / kg. A analgesia pré e pós-operatória foi fornecida por injeção intraperitoneal de meloxicam na dose de 1 mg/kg. Proteja os olhos com pomada veterinária. Uma almofada de aquecimento mantida a 38 °C foi colocada sob o campo cirúrgico durante todo o procedimento para fornecer suporte térmico ao animal. Fixe os mouses com fita adesiva depois de colocá-los de lado em uma mesa cirúrgica (Figura 1). Avalie a suficiência da anestesia pela perda do reflexo palpebral, reflexo de endireitamento e reflexo de retirada do pedal.
   NOTA: Ao aplicar anestesia com isofluorano, segure o mouse em uma mão e a bola de algodão embebida em isofluorano na outra. Certifique-se de manter a bola de algodão afastada do animal para evitar desconforto e irritação na pele.
2. Depilação pré-operatória: Use um barbeador elétrico para raspar os pelos da panturrilha e do rosto do camundongo e aplique a pasta depilatória com um cotonete na pele, cobrindo o músculo masseter e o músculo tibial anterior. Após 1-2 min, lave a pasta com um lenço cirúrgico à base de etanol (Figura 2A e Figura 2G). Os sítios cirúrgicos foram desinfetados por três rodadas de esfoliação à base de iodo e etanol a 75%.
   NOTA: O barbeador elétrico sozinho não foi suficiente para a depilação, especialmente na área do masseter. Ao aplicar a pasta depilatória, é importante não usar pasta excessiva. Limpe a pele suavemente ao lavar a pasta para evitar queimaduras na pele.
3. Exposição do campo cirúrgico: Cubra com campos cirúrgicos antes do procedimento cirúrgico. Para o músculo SAM, palpe primeiro ao longo da borda inferior da mandíbula. A 5 mm da borda, faça uma incisão de 7 mm ao longo da linha que conecta a comissura oral ao tragus (a linha tracejada indica a localização da incisão na Figura 2B).
4. Para o músculo TA, palpe primeiro ao longo da panturrilha para localizar a borda anterior do osso da tíbia. Corte 2 mm posterior à borda através da pele com bisturi, começando no joelho e terminando no tornozelo (a linha tracejada indica a localização da incisão na Figura 2H). Para cada camundongo, se o MAS e o músculo TA do lado esquerdo estiverem lesionados, use o outro músculo do lado contralateral como controle.
   NOTA: Este corte é muito superficial para garantir que os músculos não sejam lesionados durante a incisão. A incisão na face não deve estar muito próxima do tragus. Caso contrário, a glândula parótida ficará exposta, levando a sangramento excessivo durante o processo de congelamento seguinte.
5. Congelamento com gelo seco: Segure um pedaço de gelo seco com pinça pré-resfriada ao longo dos eixos longos dos músculos MAS e TA (Figura 2C e Figura 2I, respectivamente). Coloque o gelo seco diretamente na superfície do músculo por 5 s. Confirme se o músculo parece rígido e branco pálido imediatamente após a remoção do gelo seco (Figura 2D e Figura 2J), mas que retorna à sua cor e textura normais dentro de 22-25 s, semelhante ao músculo adjacente não lesionado (Figura 2E e Figura 2K).
   NOTA: A pinça que segura o gelo seco deve ser pré-resfriada para evitar a sublimação rápida do gelo seco. Um cronômetro é obrigatório para conduzir a lesão por congelamento de 5 s e contar o tempo de recuperação de 22-25 s do músculo. Qualquer músculo com tempo de recuperação inferior a 22 s ou superior a 25 s deve ser abandonado. Esta etapa requer prática.
6. Fechamento da ferida: Após a recuperação total do músculo, feche a ferida cutânea com pelo menos três suturas 7-0 (Figura 2F e Figura 2L).
7. Ressuscitação: Quando a sutura estiver completa, coloque os camundongos na gaiola com suporte térmico e monitore-os continuamente até que todos os reflexos de endireitamento tenham sido recuperados.

2. Coleção muscular

1. Eutanasiar os camundongos com uma overdose de isoflurano, seguida de luxação cervical. Colha os músculos MAS e TA em ambos os lados para análise histológica.
2. Dissecção do músculo SAM: Corte a pele do rosto do camundongo e remova a glândula parótida para expor a parte posterior do músculo SAM. Disseque a SAM desde sua inserção anterior até sua inserção posterior na mandíbula. A área pontilhada branca indica a parte exposta da SAM (Figura 3A).
   NOTA: O músculo MAS é composto por compartimentos profundos e superficiais, ambos intimamente ligados à superfície da mandíbula. Certifique-se de pressionar a tesoura na mandíbula durante a dissecção para garantir o isolamento completo do SAM. Tenha o cuidado de distinguir o zigomático-mandibular da SAM por seus limites entre o zigomático e a mandíbula.
3. Dissecção do músculo TA: Corte a pele do tornozelo ao joelho e remova a fáscia para expor o músculo TA. Use a ponta da pinça de microdissecção para isolar o tendão do TA e deslize-o até o joelho para quebrar as fibras que se prendem à tíbia. Em seguida, corte o tendão do tornozelo (Figura 3B).
   NOTA: Para o músculo TA, existem alguns tendões musculares ao redor do tornozelo do mouse; seria preciso prática para discernir o tendão de TA, que é o maior e mais próximo da tíbia.
4. Pré-resfriamento de isopentano: Prepare dois barris de isolamento; Encha o barril pequeno com isopentano e o barril grande com nitrogênio líquido. Coloque o cano pequeno dentro do cano grande 10 minutos antes da dissecção muscular (Figura 3D).
5. Preparação do molde de incorporação: Faça um molde cilíndrico de folha de estanho para cada amostra e preencha-os com o composto de temperatura de corte ideal (OCT).
6. Fresco congelado: Mergulhe o músculo na OCT, mantendo-o perpendicular ao composto OCT (Figura 3C). Use um porta-agulha para transferir o molde para o isopentano pré-resfriado. Aguarde 40 s para que a OCT se torne branca e sólida (Figura 3D).
   NOTA: Certifique-se de que a posição do molde não seja muito baixa. Caso contrário, o isopentano se misturará com a OCT e prejudicará o processo de congelamento muscular. O nível de OCT no molde deve ser comparável à altura da amostra de músculo. Evite uma quantidade excessiva de OCT para garantir um congelamento rápido e eficiente.
7. Armazenamento de amostras: Armazene amostras de músculos frescos congelados em placas de 24 poços claramente rotuladas. Separe as amostras imediatamente ou armazene-as a -80 °C para uso a longo prazo.

3. Análise histológica

1. Use um criostato para cortar seções de 10 μm de espessura da amostra de músculo em lâminas tratadas com superfície.
2. Colocar as lâminas em acetona gelada durante 20 min e secar-as ao ar na hotte durante 20 min.
3. Lave as lâminas por 3 x 5 min com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   NOTA: A partir desta etapa, as lâminas foram mantidas em uma câmara de umidade para evitar a secagem.
4. Coloração Sirius Red
   1. Prepare a solução de trabalho Sirius Red dissolvendo 0,5 g de pó Sirius Red em 500 mL de ácido pícrico saturado.
   2. Manchar as lâminas com a solução de trabalho Sirius Red por 1 h em temperatura ambiente.
   3. Lave as lâminas por 2 x 5 min com ácido acético a 0,5%.
   4. Após o processo de coloração, as amostras devem ser desidratadas primeiro em etanol a 95% por 15 s, seguidas de desidratação em etanol anidro por 1 min. A etapa final envolve a montagem da lâmina com bálsamo neutro.
5. Coloração imuno-histológica
   1. Permeabilize as seções com 0,3% de Triton em PBS por 20 min em temperatura ambiente, seguido de uma lavagem com PBS.
   2. Para coloração Pax7, bloqueie as seções com o reagente fornecido com o kit referenciado; para coloração de laminina e Pdgfrα, bloquear com 5% de albumina de soro bovino (BSA) e 5% de soro de burro em PBS por 1 h em temperatura ambiente.
   3. Incubar as seções com anticorpos primários contra Pax7, laminina e Pdgfrα durante a noite a 4 ° C, seguido de lavagem com PBS por 3 x 5 min.
   4. Incubar as seções com anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente por 1 h à temperatura ambiente, seguido de lavagem com PBS por 3 x 5 min.
   5. Incubar com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 3 min em temperatura ambiente, seguido de lavagem com PBS por 3 x 5 min.
   6. Coloque o meio de montagem na seção, coloque a lamínula por cima e use esmalte para selar a lamínula.

A coloração HE e Sirius Red (Figura 4 e Figura Suplementar S1) revelou regeneração muscular completa da AT neste modelo de lesão por congelamento. Em contraste, a SAM exibiu regeneração de miofibras prejudicada e deposição excessiva de matriz extracelular. A histologia do músculo MAS e TA íntegros é mostrada na Figura 4A,B, onde as miofibras estão alinhadas e a área fibrótica apareceu apenas no espaço intersticial e entre diferentes feixes. Enquanto o músculo TA permaneceu em grande parte a mesma estrutura muscular que seu controle intacto 14 dias após a lesão ( Figura 4G-J ), a estrutura do músculo MAS foi severamente perturbada ( Figura 4C-F ). Áreas fibróticas apareceram no lugar de quase todas as fibras musculares nas seções transversais anterior, média e posterior do músculo MAS (Figura 4C-F).

A coloração imuno-histológica de Pax7 (Figura Suplementar S2) e Pdgfrα facilitou uma investigação mais aprofundada das células satélites musculares (MuSCs) e progenitores fibroadipogênicos (FAPs), respectivamente. No músculo SAM, a 14 dpi, surgiram núcleos densamente povoados, mas sem MuSCs proporcionalmente aumentados (Figura 5A,B). Um grande número de miofibras nucleadas centralmente (mostradas pela ponta da seta azul) foi detectado em TA a 14 dpi (Figura 5H), enquanto o contorno das miofibras era quase imperceptível em MAS na área lesada (Figura 5E, F). Em vez disso, foi observada a infiltração de FAPs Pdgfrα-positivas e miofibras de pequeno diâmetro recém-formadas (apontadas por setas brancas) (Figura 5F).

Figura 1: Uma visão geral da configuração cirúrgica. (A) O camundongo foi anestesiado e fixado na mesa de operação. O cabelo foi removido do rosto e da perna do lado esquerdo. Um cronômetro foi usado para monitorar o congelamento muscular e o tempo de recuperação. (B) O gelo seco, com diâmetro de 3,5 mm e altura de 6-12 mm, foi preparado em um copo de vidro para congelamento. As pinças foram pré-resfriadas em gelo seco para uso posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Registro intraoperatório da lesão por congelamento de MAS e TA. (A) Depilação para congelamento de SAM. (B) Abra a pele para expor o músculo MAS. (C) Congelamento com gelo seco ao longo do eixo longo do MAS. (D) O aparecimento de MAS imediatamente após 5 s de congelamento. (E) O aparecimento de MAS após 22-25 s de recuperação. (F) Fechamento da ferida facial. (G) Depilação para congelamento de TA. (H) Abra a pele para expor o músculo TA. (I) Congelamento com gelo seco ao longo do longo eixo de TA. (J) O aparecimento de TA logo após 5 s de congelamento. (K) O aparecimento de AT após 22-25 s de recuperação. (L) Fechamento da ferida na perna. Abreviaturas: MAS = masseter; TA = tibial anterior. As linhas tracejadas nas Figuras 2B e 2H indicam a localização das incisões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Colheita dos músculos MAS e TA. (A) O aparecimento do músculo MAS aos 14 dias após a lesão por congelamento. O oval tracejado vermelho indica MAS; o triângulo tracejado branco mostra a exposição do músculo SAM. (B) O aparecimento do músculo TA 14 dias após a lesão por congelamento. O oval tracejado vermelho indica TA. (C) Mergulhe a amostra de músculo no composto OCT de maneira perpendicular. (D) Transfira a amostra de músculo para isopentano resfriado com nitrogênio. Abreviaturas: MAS = masseter; TA = tibial anterior; OCT = temperatura de corte ótima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise histológica dos músculos MAS e TA. Coloração vermelha de Sirius de seção muscular intacta (A-E) da SAM e seções anterior, média e posterior da SAM a 14 dpi. (F-J) Corte muscular intacto de TA e corte anterior, médio e posterior de TA a 14 dpi. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: MAS = masseter; TA = tibial anterior; DPI = dias após a lesão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise imunofluorescente dos músculos MAS e TA. Imunomarcação de Pax7 e DAPI (azul) em (A) MAS intacto, (B) MAS de 14 dpi, (C) TA intacto e (D) TA de 14 dpi. Imunocoloração de laminina, Pax7 e DAPI (azul) em (E) MAS intacto, (F) MAS de 14 dpi, (G) TA intacto e (H) TA de 14 dpi. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: MAS = masseter; TA = tibial anterior; dpi = dias após a lesão; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. As setas brancas indicam a fibra representativa de pequeno diâmetro do MAS. A área pontilhada azul e as setas indicam as miofibras regeneradoras representativas e os núcleos centrais da AT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1 suplementar: Fibrose persistente durante a regeneração muscular. (A) Ilustração esquemática da regeneração muscular TA e MAS induzida por lesão por congelamento. (BG) Imagens representativas da coloração de hematoxilina e eosina em cortes transversais dos músculos TA e MAS em diferentes momentos após a lesão. Barras de escala = 100 μm. Essa figura é reproduzida de Cheng et al.8. Abreviaturas: MAS = masseter; TA = tibial anterior; DPI = dias após a lesão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Comprometimento do processo de miogênese. (A) Imagens de imunofluorescência de Pax7 (verde) e DAPI (azul) nos músculos TA e MAS. (B) Quantificação da porcentagem de núcleos Pax7 positivos/DAPI. Barra de escala = 100 μm * Indica significativamente diferente do controle muscular intacto. # Indica significativamente diferente do outro músculo no mesmo momento. **p < 0,01, ##p < 0,01. Essa figura é reproduzida de Cheng et al.8. Abreviaturas: MAS = masseter; TA = tibial anterior; dpi = dias após a lesão; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.