Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .
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Artigo de método
Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A regeneração de células fotorreceptoras utilizando células-tronco pluripotentes humanas é uma terapia promissora para o tratamento de doenças retinianas hereditárias e envelhecidas em estágios avançados. Mostramos que a matriz isoforme de laminina recombinante específica da retina humana é capaz de apoiar a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores. Além disso, a injeção sub-retiniana dessas células também mostrou restauração parcial nos modelos rd10 de roedores e coelhos. A injeção sub-retiniana é conhecida por ser um método estabelecido que tem sido usado para entregar compostos farmacêuticos às células fotorreceptoras e à camada epitelial pigmentada da retina (EPR) do olho devido à sua proximidade com o espaço alvo. Ele também tem sido usado para entregar vetores virais adenoassociados no espaço sub-retiniano para tratar doenças da retina. A entrega sub-retiniana de compostos farmacêuticos e células no modelo murino é desafiadora devido à restrição no tamanho do globo ocular murino. Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para injeção e a técnica de liberação sub-retiniana dessas células em camundongos mutantes genéticos da retinose pigmentosa, rd10. Esta abordagem permite a terapia celular para a área alvo, em particular a camada nuclear externa da retina, onde ocorrem doenças que levam à degeneração dos fotorreceptores.
Introdução
Doenças hereditárias da retina e degeneração macular relacionada à idade levam à perda de células fotorreceptoras e eventual cegueira. O fotorreceptor retiniano é a camada do segmento externo da retina composta por células especializadas responsáveis pela fototransdução (isto é, conversão de luz em sinais neuronais). As células fotorreceptoras do bastonete e do cone estão adjacentes à camada pigmentada da retina (EPR)1. A terapia de reposição de células fotorreceptoras para compensar a perda celular tem sido uma abordagem terapêutica emergente e em desenvolvimento. Células-tronco embrionárias (CTEs)2,3,4
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Protocolo
Os experimentos in vivo foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e pela Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement para o uso de animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Os filhotes foram imunossuprimidos de P17 (pré-transplante) a P30 (pós-transplante) alimentando-os com água potável contendo ciclosporina (260 g/L).
1. Preparação de progenitores fotorreceptores derivados de hESC do Dia 32 após criopreservação
- Meio de diferenciação fotorreceptor pré-aquecido (PRDM) em banho-mar....
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Resultados
A seringa de vidro de 10 μL foi montada de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1), e a agulha romba usada para entregar a suspensão/meio celular é mostrada na Figura 1B. Diferentes abordagens para injeção sub-retiniana são ilustradas na Figura 2. Descrevemos a abordagem pars plana neste protocolo (Figura 2C). A agulha romba montada em uma seringa de vidro foi inserida através de uma ferida de.......
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Discussão
A injeção sub-retiniana tem sido utilizada para transplante de suspensão celular para tratamento de EPR e doenças retinianas23,25,26,27,28,31,40. Esta abordagem é altamente essencial em estudos com roedores, não apenas para abordagens de transplante celular e terapia gênica, mas também para .......
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Divulgações
Hwee Goon Tay é co-fundador da Alder Therapeutics AB. Outros autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung por fornecerem assistência técnica para a preparação do dia 32 progenitores fotorreceptores derivados de hESC após criopreservação. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios do National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) para H.G.T.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,3% de Tobramicina | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3,5 g) |
| 0,3% Tobramicina e 0,1% Dexametasona | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3,5 g) |
| 0,5% Cloridrato de Proparacaína | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0,5% Alcaína (15 mL) |
| 1 mL Seringa de tuberculina | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamida | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| Cloridrato de fenilefrina 2,5% | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2,5% Mydfrin (5 mL) |
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Costar | 3526 | |
| 30 G Agulha descartável | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, agulhas rombas de 20 mm de comprimento | Hamilton | 7803-05 | |
| Contador de células automatizado | NanoEnTek | Modelo: Eve | |
| B27 sem Vitamina A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorfina | Ceva | Vetergesic vet (0,3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µ M36 |
| Ciclosporina | Novartis | 260 g/L em água potável | |
| Dia 32 Células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC | DUKE-NUS Medical School | As células-tronco embrionárias humanas são diferenciadas por 32 dias. Veja o protocolo na Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co., Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Mínimo Essencial Médio | Gibco | 11710– 035 | |
| linha celular hESC H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Fator neurotrófico derivado do cérebro humano (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Fator neurotrófico ciliar humano (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Cloridrato de cetamina (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µ g36 |
| mFreSR | Seringa | 5854 | |
| (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µ Suplemento M36 |
| N-2 | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Aminoácidos não essenciais (NEAA) | Gibco | 11140– 050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Microscópio cirúrgico | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | Com função iOCT integrada |
| PRDM (Meio de diferenciação de fotorreceptores, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | Veja a composição do meio36. Basal Médio, 10 µ M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0,5 µ M Ácido retinóico, 2% B27 e 1% N2. Meio basal: 1x GMEM, 1 mM de piruvato de sódio, 0,1 mM de B-mercaptoetanol, 1x Aminoácidos não essenciais (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360; 070 | 1 camundongos mM36 |
| Rd10 | Jackson Laboratory | B6. Camundongos CXB1-Pde6brd10/J | Sexo: macho/fêmea, Idade: P20 (injeção), Peso: 3-6 g |
| Ácido retinóico | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µ M36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µ M36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Cloridrato de xilazina (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985– 023 | 0,1 mM36 |
Referências
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15
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Reimpressões e permissões
