Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10

Summary

Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .

Abstract

A regeneração de células fotorreceptoras utilizando células-tronco pluripotentes humanas é uma terapia promissora para o tratamento de doenças retinianas hereditárias e envelhecidas em estágios avançados. Mostramos que a matriz isoforme de laminina recombinante específica da retina humana é capaz de apoiar a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores. Além disso, a injeção sub-retiniana dessas células também mostrou restauração parcial nos modelos rd10 de roedores e coelhos. A injeção sub-retiniana é conhecida por ser um método estabelecido que tem sido usado para entregar compostos farmacêuticos às células fotorreceptoras e à camada epitelial pigmentada da retina (EPR) do olho devido à sua proximidade com o espaço alvo. Ele também tem sido usado para entregar vetores virais adenoassociados no espaço sub-retiniano para tratar doenças da retina. A entrega sub-retiniana de compostos farmacêuticos e células no modelo murino é desafiadora devido à restrição no tamanho do globo ocular murino. Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para injeção e a técnica de liberação sub-retiniana dessas células em camundongos mutantes genéticos da retinose pigmentosa, rd10. Esta abordagem permite a terapia celular para a área alvo, em particular a camada nuclear externa da retina, onde ocorrem doenças que levam à degeneração dos fotorreceptores.

Introduction

Doenças hereditárias da retina e degeneração macular relacionada à idade levam à perda de células fotorreceptoras e eventual cegueira. O fotorreceptor retiniano é a camada do segmento externo da retina composta por células especializadas responsáveis pela fototransdução (isto é, conversão de luz em sinais neuronais). As células fotorreceptoras do bastonete e do cone estão adjacentes à camada pigmentada da retina (EPR)¹. A terapia de reposição de células fotorreceptoras para compensar a perda celular tem sido uma abordagem terapêutica emergente e em desenvolvimento. Células-tronco embrionárias (CTEs)^2,3,4, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de EPRs e células progenitoras da retina (RPCs)^4,5,6,7,8 foram usadas para restaurar as células fotorreceptoras danificadas. O espaço sub-retiniano, um espaço confinado entre a retina e o EPR, é um local atraente para depositar essas células para substituir as células fotorreceptoras danificadas, o EPR e as células de Mueller devido à sua vizinhança9,10,11.

Terapias gênicas e celulares têm utilizado o espaço sub-retiniano para medicina regenerativa para várias doenças retinianas em estudos pré-clínicos. Isso inclui a entrega de cópias funcionais do gene ou ferramentas de edição gênica na forma de terapia anti-senso com oligonucleotídeos^12,13 ou CRISPR/Cas9 ou edição de base via estratégia baseada em vírus adenoassociado (AAV) 14,15,16, implantação de materiais (por exemplo, folha de EPR, próteses retinianas 17,18,19) e organoides retinianos derivados de células-tronco diferenciadas ^20,21,22 para tratar doenças retinianas e relacionadas à EPR. Ensaios clínicos utilizando hESC-RPE³¹ no espaço sub-retiniano para tratar amaurose congênita de Leber (LCA) associada ao ^EPR6523,24, acromatopsia ligada ao CNGA3²⁵, retinite pigmentosa associada a MERTK²⁶, coroideremia 27,28,29,30 provaram ser uma abordagem eficaz. A injeção direta de células nas proximidades da área danificada melhora muito a chance de assentamento celular na região apropriada, integração sináptica e eventual melhora visual.

Embora a injeção sub-retiniana em modelos humanos e de olhos grandes (i.e., porco 32,33,34,35, coelho 36,37,38,39,40 e primata não humano 41,42,43) tenha sido estabelecida, tal injeção no modelo murino ainda é desafiadora devido à restrição do tamanho do globo ocular e enorme lente ocupando o olho do rato 44,45,46. No entanto, modelos geneticamente modificados só estão prontamente disponíveis em pequenos animais e não em animais de grande porte (ou seja, coelhos e primatas não humanos), portanto, a injeção sub-retiniana em camundongos chama a atenção para investigar novas abordagens terapêuticas em doenças genéticas da retina. Três abordagens principais estão sendo usadas para entregar células ou AAVs no espaço sub-retiniano: a via transcorneana, a via transescleral e a via pars plana (ver Figura 2). As vias transcórnea e transescleral estão associadas à formação de catarata, sinéquias, sangramento de coroide e refluxo do local da injeção 11,44,45,47,48,49. Adotamos a abordagem pars plana como visualização direta do processo de injeção, e o local de injeção pode ser obtido em tempo real ao microscópio.

Recentemente, descrevemos um método que pode diferenciar células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em progenitores fotorreceptores sob condições xenofree, quimicamente definidas, usando a isoforma LN523 recombinante de laminina específica da retina humana. Uma vez que o LN523 estava presente na retina, hipotetizamos que o nicho da matriz extracelular da retina humana poderia ser recapitulado in vitro e, assim, apoiar a diferenciação dos fotorreceptores das hESCs³⁶. A análise transcriptômica de célula única mostrou que progenitores fotorreceptores co-expressando homeobox e recuperatina cone-rod foram gerados após 32 dias. Um modelo mutante de camundongo com degeneração retiniana 10 (rd10) que imita retinose pigmentar humana autossômica foi usado para avaliar a eficácia dos progenitores de fotorreceptores derivados do hESC do dia 32 in-vivo. As células progenitoras do fotorreceptor derivadas do hESC foram injetadas no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 em P20, onde a disfunção e a degeneração dos fotoceptores estão em curso³⁶. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação dos progenitores fotorreceptores derivados de hESC pós-criopreservados e liberação no espaço sub-retiniano de camundongos rd10 . Este método também pode ser usado para administrar AAVs, suspensões celulares, peptídeos ou produtos químicos no espaço sub-retiniano em camundongos.

Protocol

Os experimentos in vivo foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e pela Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement para o uso de animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Os filhotes foram imunossuprimidos de P17 (pré-transplante) a P30 (pós-transplante) alimentando-os com água potável contendo ciclosporina (260 g/L).

1. Preparação de progenitores fotorreceptores derivados de hESC do Dia 32 após criopreservação

1. Meio de diferenciação fotorreceptor pré-aquecido (PRDM) em banho-maria a 37 °C.
2. Recuperar um criovial contendo células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC do dia 32 a partir de nitrogênio líquido. Mantenha no gelo seco.
3. Descongelar o criovial a 37 °C em banho-maria por 3-5 min. Ressuspender no dia 32 células em 1 mL de PRDM e centrifugar a 130 x g por 4 min.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PRDM.
5. Remover 10 μL da mistura para contagem celular. Misture as células usando 0,2% de azul de tripano de acordo com as instruções do fabricante. Pipetar a mistura de células para a lâmina da câmara de contagem de células. Determine o número e a viabilidade de células por contador de células automatizado.
6. Prossiga para a próxima etapa quando a viabilidade celular estiver acima de 70%. Centrifugar a suspensão de células restantes a 130 x g por 4 min. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em PRDM na concentração de 3 x 10⁵ células/μL para transplante.
7. Observe se há aglomerados celulares visíveis. Ressuspenda os aglomerados celulares repetidamente usando uma ponta de pipeta de 10 μL no tubo de microfuga até que nenhum aglomerado celular visível seja observado. Coloque na seringa de injeção 33G para observar a extrusão da solução celular através da agulha.

2. Liberação sub-retiniana das hESCs em camundongos rd10

1. Preparo dos animais
   1. Anestesiar o camundongo (P20, macho/fêmea, 3-6 g) usando uma combinação de cetamina (20 mg/kg de peso corporal) e xilazina (2 mg/kg de peso corporal) em uma seringa tuberculínica de 1 mL conectada a uma agulha 27G por abordagem intraperitoneal. Administrar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) no camundongo como analgésico preventivo.
   2. Após a administração da anestesia, instilar uma gota cada de tropicamida a 1% e fenilefrina a 2,5% para dilatação pupilar. Aplique um gel oftálmico na córnea para evitar o ressecamento do olho e catarata relacionada à anestesia.
   3. Coloque o rato numa gaiola vazia até ficar totalmente anestesiado. Avalie o nível anestésico adequado apertando a pata e confirme se o animal não reage ao pinça dura.
   4. Quando o rato estiver totalmente anestesiado, coloque o animal numa almofada quente regulada a 38 °C.
2. Entrega sub-retiniana das células
   1. Para usar uma abordagem de pars plana transvítrea de 1 porta, como feito aqui, execute a injeção sub-retiniana em um ambiente estéril. Use um microscópio cirúrgico vertical com um caminho de luz direto para realizar a injeção.
   2. Prepare a seringa de vidro de 10 μL removendo o cubo da agulha. Monte a agulha romba 33G na seringa de vidro. Pegue a tampa do cubo de metal e prenda cuidadosamente a agulha na seringa.
   3. Lave com água destilada para verificar se há sinais de vazamento e patência da agulha. Esvazie a seringa e coloque-a ao lado com cuidado.
   4. Coloque o rato anestesiado em um travesseiro, com o olho de tratamento olhando diretamente para a objetiva do microscópio. Aplicar o cloridrato de proparacaína a 0,5% e aguardar 30 s. Aplique 150 μL de gel oftálmico no olho e coloque uma tampa redonda sobre ele.
   5. Realize um exame áspero do olho observando a córnea, íris, pupila, lente e conjuntiva. Através da pupila, visualize o fundo do olho do mouse ajustando o plano focal. Ajuste a cabeça até que a cabeça óptica esteja posicionada no centro da pupila e minimize o movimento da cabeça posicionando-se adequadamente no travesseiro.
   6. Bata suavemente na base do tubo com as hESCs várias vezes para obter uma suspensão de célula uniforme. Usando a seringa de microlitro de vidro de 10 μL com uma agulha romba 33G, retire 2 μL de células/meio. Retire as células imediatamente antes da injeção para evitar o assentamento/aglomeração celular na seringa.
   7. Usando uma agulha descartável 30G, faça uma ferida de esclerectomia 2 mm atrás do limbo. Mantenha o ângulo da agulha em ~45° para evitar tocar na lente. Uma vez que a ponta da agulha é visualizada no olho, retire suavemente a agulha. Descarte a agulha no compartimento afiado após o uso para evitar ferimentos por picada de agulha.
   8. Pegue a seringa de vidro e insira a agulha romba na ferida de esclerectomia. Sem tocar na lente, avance a agulha romba até atingir a retina oposta da ferida de entrada. Certifique-se de que a área de injeção está livre dos principais vasos sanguíneos da retina para evitar hemorragias.
   9. Penetre suavemente na retina até que um ramo de pressão na esclera seja visto. Mantenha a extremidade romba da agulha paralela à esclera para evitar o vazamento das células para o espaço vítreo.
   10. Injete lentamente 2 μL de suspensão celular ou meio PRDM (controle) no espaço sub-retiniano enquanto a pressão suave é mantida na seringa. Com uma injeção bem-sucedida, uma mancha visível (ou seja, retina elevada com a suspensão/mídia celular) deve ser formada no local da injeção.
       NOTA: Apenas uma pressão suave deve ser usada durante a injeção para evitar o rasgo da retina e o bloqueio das células na ponta da agulha.
   11. Depois de confirmar a bolha, aguarde 10 s para deixar as células se acomodarem. Retraia suavemente a agulha do olho.
3. Tomografia de coerência óptica (OCT) intraoperatória (OCT) da bolha (opcional)
   1. Posicione o olho do mouse para visualizar a mancha sob o microscópio, movendo lentamente a cabeça. Fixe a posição segurando suavemente a cabeça. Nenhuma dilatação pupilar adicional é necessária. Não retire a tampa e o gel no olho. Ele dá uma mídia óptica clara para visualizar o bleb.
   2. Execute a OCT intraoperatória usando a função iOCT integrada do microscópio cirúrgico.
   3. Pressione a opção Cubo na tela da OCT e posicione a área de digitalização no bleb pressionando os botões de seta . Ajuste a OCT deslizando Centralização e Foco para obter a melhor qualidade da OCT. Pressione Capturar/Digitalizar para adquirir a varredura da OCT da área de bleb. Revise as imagens para verificar a qualidade das digitalizações.
4. Recuperação
   1. Retire a tampa e limpe o gel do olho com gaze. Aplique pomada antibiótica uma vez após a injeção para prevenir a infecção.
   2. Permitir que o animal se recupere da anestesia sob uma luz quente até que recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e retornar à gaiola de origem. Monitore o animal por pelo menos 3 dias após a injeção em busca de sinais de inflamação, infecção e angústia.
      NOTA: A luz quente de 150 W deve estar a pelo menos 30 cm de distância da gaiola do animal, e deve-se tomar cuidado para evitar uma lesão por queimadura.
   3. Administrar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 de hora em hora por 1 dia ou por recomendação do veterinário. Se for observada inflamação ou infecção do olho, consulte um profissional veterinário para o tratamento adequado.
5. Limpeza e esterilização dos instrumentais
   1. Lave a seringa de microlitro de vidro de 10 μL e a agulha romba 33G com etanol 100% 10x. Lave o etanol piscando a seringa com água destilada.
   2. Dissimule a seringa de vidro e a agulha. Seque a seringa para armazenamento.

Results

A seringa de vidro de 10 μL foi montada de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1), e a agulha romba usada para entregar a suspensão/meio celular é mostrada na Figura 1B. Diferentes abordagens para injeção sub-retiniana são ilustradas na Figura 2. Descrevemos a abordagem pars plana neste protocolo (Figura 2C). A agulha romba montada em uma seringa de vidro foi inserida através de uma ferida de...

Discussion

A injeção sub-retiniana tem sido utilizada para transplante de suspensão celular para tratamento de EPR e doenças retinianas23,25,26,27,28,31,40. Esta abordagem é altamente essencial em estudos com roedores, não apenas para abordagens de transplante celular e terapia gênica, mas também para ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3% de Tobramicina	Novartis	NDC   0078-0813-01	Tobrex (3,5 g)
0,3% Tobramicina e 0,1% Dexametasona	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3,5 g)
0,5% Cloridrato de Proparacaína	Alcon	NDC 0998-0016-15	0,5% Alcaína (15 mL)
1 mL Seringa de tuberculina	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamida	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
Cloridrato de fenilefrina 2,5%	Alcon	NDC 0998-0342-05	2,5% Mydfrin (5 mL)
Placa de cultura de tecidos de 24 poços	Costar	3526
30 G Agulha descartável	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, agulhas rombas de 20 mm de comprimento	Hamilton	7803-05
Contador de células automatizado	NanoEnTek	Modelo: Eve
B27 sem Vitamina A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorfina	Ceva		Vetergesic vet (0,3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µ M36
Ciclosporina	Novartis		260 g/L em água potável
Dia 32 Células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC	DUKE-NUS Medical School		As células-tronco embrionárias humanas são diferenciadas por 32 dias. Veja o protocolo na Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co., Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Mínimo Essencial Médio	Gibco	11710– 035
linha celular hESC H1	WiCell Research Institute	WA01
Fator neurotrófico derivado do cérebro humano (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Fator neurotrófico ciliar humano (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Cloridrato de cetamina (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µ g36
mFreSR	Seringa	5854
(10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µ Suplemento M36
N-2	Life Technologies	A13707-01	1%36
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Gibco	11140– 050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Microscópio cirúrgico	Zeiss	OPMI LUMERA 700	Com função iOCT integrada
PRDM (Meio de diferenciação de fotorreceptores, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		Veja a composição do meio36. Basal Médio, 10 µ M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0,5 µ M Ácido retinóico, 2% B27 e 1% N2. Meio basal: 1x GMEM, 1 mM de piruvato de sódio, 0,1 mM de B-mercaptoetanol, 1x Aminoácidos não essenciais (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360; 070	1 camundongos mM36
Rd10	Jackson Laboratory	B6. Camundongos CXB1-Pde6brd10/J	Sexo: macho/fêmea, Idade: P20 (injeção), Peso: 3-6 g
Ácido retinóico	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µ M36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µ M36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Cloridrato de xilazina (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoetanol	Life Technologies	21985– 023	0,1 mM36