Estudo experimental da hibernação do besouro da batata Colorado em condições naturais

O besouro da batata Colorado Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) é uma importante praga de plantas Solanaceae, predominantemente batata Solanum tuberosum L. A distribuição geográfica desta espécie é de mais de 16 milhões de km² e se expande constantemente¹. A CEC tem diapausa facultativa de inverno, e a hibernação é obrigatória na zona temperada. A diapausa é induzida por um fotoperíodo de dias curtos e modulada pela temperatura¹. Estes besouros passam o inverno na fase adulta, escavando-se no solo. Com o aumento das latitudes, a duração do período de hibernação se estende. Na zona temperada, especialmente nos territórios setentrionais de sua distribuição, o inverno dura até 9 meses: de agosto-setembro até maio-junho (Noskov et al., observações pessoais). Durante esse período, a CEC - assim como qualquer outro inseto da zona temperada - é exposta a condições desfavoráveis de inverno e deve aumentar sua tolerância ao frio. Ao mesmo tempo, o contato dos besouros com o solo aumenta o risco de infecção por vários microrganismos oportunistas e patogênicos². Portanto, esses besouros precisam manter um certo nível de atividade do sistema imunológico durante a hibernação, o que também é energeticamente caro. No entanto, mesmo que o inseto sobreviva a uma infecção, a doença pode reduzir sua rusticidade ao frio³. Deve-se notar que a baixa temperatura não é a única razão para a mortalidade de inverno da CEC. Um papel importante também é desempenhado pela falta de oxigênio e, em algumas condições, pode ser o principal fator de mortalidade no inverno ^4,5.

Sabe-se que a mortalidade natural de inverno da CEC pode ser muito alta, chegando a 100% em solos franco-argilosos⁶. Assim, o inverno excessivo é um dos períodos mais cruciais no ciclo de vida da CEC. No entanto, dados sobre fisiologia, atividade do sistema imunológico, sobrevida e outros parâmetros da hibernação da CEC em condições naturais ainda são limitados. Há estudos sobre a expressão gênica diferencial e vários parâmetros fisiológicos em adultos com CEC durante a diapausa e em resposta ao choque frio 7,8,9,10,11,12; no entanto, essas análises têm sido realizadas principalmente por indução de diapausa ou estresse ao frio em condições de laboratório, sem flutuações naturais de temperatura, umidade e carga de patógenos nativos. No entanto, pesquisas sobre a fisiologia desses besouros coletados por escavação do solo em condições naturais são importantes. Diferentes aspectos da superinvernada da CEC em condições naturais foram ativamente estudados nas décadas de 1970-1980 13,14,15,16,17,18. Por outro lado, esses estudos não envolveram escavação da CEC do solo no inverno. Além disso, uma técnica de hibernação controlada da CEC e uma descrição das gaiolas não são fornecidas em detalhes. Assim, é necessária investigação sobre a fisiologia da invernada das CECs em ambientes naturais¹⁹.

O objetivo deste estudo foi desenvolver e testar um método de hibernação controlada de adultos com CEC em condições naturais. O método proposto permite obter um número desejado de indivíduos com CEC para ensaios microbiológicos, imunológicos e outros durante a hibernação em condições de campo de clima continental. Este método pode ser adaptado e aplicado a outras espécies de insetos que passam o inverno em solo sob neve.

1. Descrição das gaiolas para hibernação

NOTA: Dependendo dos objetivos do experimento, o número de gaiolas varia. Utilizar pelo menos três gaiolas por data de amostragem. Para estimar o número de besouros que surgirão, prepare pelo menos três gaiolas adicionais, que não serão retiradas do solo até a primavera.

1. Use gaiolas feitas de uma estrutura rígida de madeira com um tamanho de 25 × 25 × 40 cm (L × W × H).
2. Para construir uma armação para a gaiola, use ripas de madeira com pelo menos 2 cm de espessura e 4 cm de largura.
3. Cobrir o interior da gaiola com uma malha de aço inoxidável com um tamanho de abertura não superior a 5 mm × 3 mm. Use um grampeador de madeira para fixar a malha.
4. Fixe a malha de aço inoxidável na parte externa do fundo com o grampeador.
5. Forre o interior da gaiola com um geotêxtil sintético preto com uma densidade de 60 g/m².
   OBS: O geotêxtil serve como uma barreira adicional para impedir a fuga dos besouros. Não usá-lo em experimentos relacionados a entomopatógenos e parasitoides em movimento ativo.
6. Fixe firmemente um tubo de tecido sintético translúcido respirável de aproximadamente 60 cm de altura ao topo da gaiola.
7. Atravesse e fixe duas cordas fortes no fundo da gaiola para retirá-la do solo quando necessário.

2. Instalação das gaiolas

1. Cavar um buraco de 40 cm de profundidade no solo e colocar a gaiola dentro.
2. Coloque grama seca ou feno no buraco.
3. Coloque a gaiola dentro de modo que o feno ou grama seca fique entre as paredes da gaiola e o solo.
4. Encha as gaiolas com terra do mesmo campo de batata onde os insetos são coletados.
5. Instale registradores de dados de temperatura e umidade à prova d'água nas gaiolas nas profundidades necessárias.
   NOTA: Os registadores de dados de qualquer fabricante podem ser utilizados e devem poder funcionar a baixas temperaturas.
6. Plante mudas de batata dentro de cada gaiola 3-4 semanas antes da introdução dos besouros e regue-as moderadamente.
7. Fixe um tubo de tecido sintético verticalmente a um bastão de qualquer material instalado na parte externa da gaiola.

3. Criação de insetos antes do inverno

1. Coletar manualmente besouros adultos em campos de batata livres de pesticidas no final da vegetação de batata.
   NOTA: Os besouros adultos diferem substancialmente das larvas e são caracterizados por élitras listradas, enquanto as larvas são vermelhas.
2. Mantenha os besouros coletados em baldes plásticos de 15-20 L (máximo de 200 indivíduos por balde) contendo tampas de batata para alimentar os insetos antes de colocá-los nas gaiolas.
3. Cubra os baldes com tecido respirável.
   OBS: Não mantenha insetos em baldes por mais de 12 h. Use tampos de batata grandes o suficiente para evitar o acúmulo de besouros no fundo dos baldes.
4. Coloque no máximo 200 indivíduos com CEC sobre as plantas de batata cobertas com a malha de tecido sintético.
5. Quando as tampas de batata forem consumidas, adicione as frescas colocadas em um pote plástico contendo água e troque as tampas de batata diariamente depois.
   OBS: Para fixar hastes em um frasco, use algodão e parafilme. Verifique cuidadosamente os caules velhos para os besouros ao removê-los.
6. Depois que todos os besouros forem escavados no solo para passar o inverno, desamarre o tubo de tecido sintético do bastão e coloque o tecido para baixo.

4. Coleta de insetos durante o inverno

1. Remova a neve acima da superfície da gaiola.
2. Solte a gaiola de cada lado com uma pá forte.
3. Puxe a gaiola para fora do solo usando as cordas.
4. Traga a gaiola para o laboratório.
   NOTA: Dependendo dos objetivos do experimento, os besouros hibernantes podem ter que estar inativos antes da análise. Neste caso, a temperatura em laboratório durante o isolamento dos besouros do solo deve ser de ~2-5 °C.
5. Retire a terra da caixa em pequenas porções, quebre cuidadosamente grandes pedaços de terra e isole os besouros usando uma pinça.
6. Separe os besouros vivos dos cadáveres. Os besouros vivos e saudáveis criam solo compacto ao seu redor, formando uma cavidade de ar (o chamado berço), sendo, portanto, facilmente separados do solo. Os besouros mortos por fungos são mumificados ou têm micélio visível na superfície. Os insetos em decomposição bacteriana são escuros.
7. Peneire o solo através de uma peneira para garantir que todos os besouros estejam isolados e não danificados.
8. Coloque cadáveres com sintomas de infecção fúngica ou decomposição bacteriana em um tubo centrífugo estéril individual de 15 mL para identificação futura.
9. Armazenar besouros vivos em um refrigerador a uma temperatura de 0-2 °C até a análise em um recipiente ventilado fechado contendo uma bola de algodão úmida.

5. Preparação de amostras de órgãos e tecidos

1. Para coletar hemolinfa, faça uma punção na parte lateral do abdome sob elytra usando uma agulha de insulina.
   OBS: Durante o inverno, a quantidade de hemolinfa é significativamente reduzida, o que dificulta a coleta desse líquido.
2. Para isolar o intestino, corte a cápsula da cabeça, esprema todo o conteúdo em uma placa de Petri com tampão fosfato, separe o intestino e limpe-o de gordura e vasos malpighianos.
3. Separe uma seção desejada do intestino, como o intestino anterior, o intestino médio ou o intestino posterior.
4. Para isolar o corpo gordo, separe-o de outros tecidos após o isolamento do intestino.
   NOTA: Os tecidos isolados podem ser usados para medir a atividade de enzimas antioxidantes e desintoxicantes (um exemplo: Figura Suplementar 1), análise da regulação de genes de vias de sinalização imune (um exemplo: Figura Suplementar 2), ou metabarcoding do conteúdo intestinal de insetos, etc.

6. Isolamento de microrganismos dos cadáveres

1. Para isolar fungos entomopatogênicos dos cadáveres, coloque os insetos mumificados em uma câmara de umidade estéril.
2. Use conídios aéreos (se disponíveis) ou escleródios do conteúdo interno dos besouros para plaquear em ágar Sabouraud dextrose com ácido lático a 0,4%.
   NOTA: Use besouros com micélio e conídios para plaqueamento imediato (sem colocá-los em câmaras de umidade).
3. Isolar bactérias dos cadáveres com sintomas de decomposição bacteriana.
4. Corte a cabeça de um besouro, esprema o conteúdo interno e colete-os em tubos para posterior revestimento em meios para bactérias (ágar Luria-Bertani, ágar endo e ágar esculina biliar).
   NOTA: Utilizar microscopia e métodos moleculares para identificar gêneros e espécies dos patógenos. Se necessário, uma análise para a presença de outros parasitas pode ser realizada.

Os resultados abaixo sobre CECs durante o inverno mostram temperatura, sobrevivência e infecções do solo.

Dinâmica da temperatura do solo.
Temperaturas abaixo de zero nas gaiolas a 30 cm de profundidade foram registradas do final de novembro ao início de abril (Figura 1). A temperatura média nesse período foi de menos 3,3 ± 0,1 °C (média ± erro padrão). A menor temperatura registrada foi de -7,9 °C em meados de fevereiro.

Sobrevida de CECs invernadas.
A mortalidade dos insetos foi observada durante a hibernação e atingiu um máximo na primavera antes da emergência. O número inicial de besouros era de 2000, dos quais 1470 indivíduos sobreviveram até o final de maio. A taxa de sobrevivência dos besouros durante a hibernação foi de 61% (Figura 2).

Infecções em CECs de inverno excessivo.
Uma análise de 530 besouros mortos mostrou que, durante o período de hibernação, 53% deles apresentaram sintomas de decomposição bacteriana e 25% apresentaram sintomas de infecções fúngicas (Figura 3). Beauveria dominou (45 isolados) entre as culturas isoladas de fungos entomopatogênicos. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) e Lecanicillium foram muito menos comuns (dois isolados cada). Entre as bactérias isoladas dos cadáveres com sintomas de decomposição bacteriana (n = 30), foram identificadas espécies pertencentes aos gêneros Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella e Glutamicibacter (Tabela Suplementar 1).

Figura 1: Dinâmica da temperatura do solo. Dinâmica da temperatura do solo medida por um registrador de dados de temperatura à prova d'água instalado a uma profundidade de 30 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Sobrevivência de besouros de batata Colorado durante o inverno em diferentes períodos de hibernação. As gaiolas foram escavadas, e os besouros sobreviventes e mortos foram contados em novembro, janeiro, abril e maio. As barras representam o número de besouros sobreviventes. Bigodes indicam erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Infecções em cadáveres de besouros de batata Colorado durante o inverno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materiais Suplementares: Clique aqui para baixar os Arquivos Suplementares abaixo. 

Figura suplementar 1. Atividade de esterases inespecíficas no intestino médio da CEC durante a hibernação. Bigodes denotam erro padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os momentos (teste de Dunn, P < 0,05).

Figura 2 Suplementar: Alterações da expressão do fator de transcrição NFkB (via IMD) no intestino e corpo adiposo da CEC durante a hibernação. Os dados são apresentados como alterações de dobra em relação a um ponto de tempo de agosto. Rp4, Rp18 e Arf19 foram utilizados como genes de referência. Bigodes mostram erro padrão.

Tabela suplementar 1: Identificação putativa de sequências gênicas do gene 16S rRNA (~800 pb) de bactérias isoladas de uma CEC morta durante a hibernação.

Os autores declaram que não há interesses concorrentes.