Determinação de 45 pesticidas em variedades de abacate pelo método QuEChERS e cromatografia gasosa - espectrometria de massas em tandem

Na análise química, o efeito de matriz (ME) pode ser definido de várias maneiras, mas uma definição geral amplamente aceita é a seguinte: refere-se à mudança no sinal, particularmente uma mudança na inclinação da curva de calibração quando a matriz da amostra ou parte dela está presente durante a análise de um analito específico. Como aspecto crítico, o EM requer uma investigação completa durante o processo de validação de qualquer método analítico, pois afeta diretamente a precisão da medição quantitativa dos analitos alvo¹. Idealmente, um procedimento de pré-tratamento de amostra deve ser seletivo o suficiente para evitar a extração de quaisquer componentes da matriz da amostra. No entanto, apesar dos esforços significativos, muitos desses componentes da matriz ainda acabam nos sistemas de determinação final na maioria dos casos. Consequentemente, esses componentes da matriz geralmente comprometem os valores de recuperação e precisão, introduzem ruído adicional e aumentam o custo geral e a mão de obra envolvida no método.

Na cromatografia gasosa (GC), a EM surge devido à presença de sítios ativos dentro do sistema GC, que interagem com os analitos alvo por meio de vários mecanismos. Por um lado, os constituintes da matriz bloqueiam ou mascaram esses locais ativos que, de outra forma, interagiriam com os analitos alvo, resultando em aumento frequente do sinal². Por outro lado, sítios ativos que permanecem desobstruídos podem causar pico de rejeito ou decomposição do analito devido a fortes interações, levando a um EM negativo. No entanto, isso pode oferecer benefícios potenciais em certos casos². É crucial enfatizar que alcançar a inércia completa em um sistema de GC é extremamente desafiador, apesar do uso de componentes altamente inertes e manutenção adequada. Com o uso contínuo, o acúmulo de componentes da matriz no sistema GC torna-se mais pronunciado, causando um aumento da EM. Hoje em dia, é amplamente reconhecido que analitos contendo oxigênio, nitrogênio, fósforo, enxofre e elementos semelhantes exibem um EM maior, pois interagem prontamente com esses sítios ativos. Por outro lado, compostos altamente estáveis, como hidrocarbonetos ou haloalcanos, não sofrem tais interações e não apresentam EM observável durante a análise ^2,3.

No geral, a EM não pode ser totalmente eliminada, levando ao desenvolvimento de várias estratégias de compensação ou correção quando a remoção completa dos componentes da matriz não é viável. Dentre essas estratégias, a utilização de padrões internos deuterados (ISs), protetores de analitos, calibração compatível com matriz, método de adição de padrão ou modificação de técnicas de injeção foram documentadas na literatura científica 1,2,4,5. As diretrizes SANTE/11312/2021 também recomendaram essas estratégias⁶.

Em relação à aplicação da calibração pareada por matriz para compensar MEs, as sequências de amostras em situações práticas abrangem diversos tipos de alimentos ou várias amostras da mesma mercadoria. Nesse caso, supõe-se que o emprego de qualquer amostra da mesma mercadoria compensará efetivamente a EM em todas as amostras. No entanto, há uma carência de estudos suficientes na literatura existente que investiguem especificamente essa questão⁷.

A determinação multirresíduo de agrotóxicos em matrizes contendo uma porcentagem apreciável de gordura e pigmentos constitui uma tarefa desafiadora. A quantidade considerável de material coextraído pode afetar significativamente a eficiência da extração e interferir na determinação cromatográfica subsequente, potencialmente danificando a coluna, a fonte e o detector, resultando em MEs significativos ^8,9,10. Consequentemente, a análise de pesticidas em níveis de traços em tais matrizes requer uma redução significativa dos componentes da matriz antes da análise, garantindo altos valores de recuperação⁷. A obtenção de altos valores de recuperação é crucial para garantir que as análises de pesticidas permaneçam confiáveis, precisas e em conformidade com os padrões regulatórios. Isso é vital para garantir a segurança alimentar, a proteção ambiental e a tomada de decisões informadas na agricultura e áreas afins.

O abacate é uma fruta de alto valor comercial cultivada em climas tropicais e mediterrâneos em todo o mundo e amplamente consumida tanto em suas regiões de origem quanto nos inúmeros mercados de exportação. Do ponto de vista analítico, o abacate é uma matriz complexa contendo um número significativo de ácidos graxos (ou seja, oleico, palmítico e linoleico), semelhante às nozes, um teor significativo de pigmentos, como nas folhas verdes, além de açúcares e ácidos orgânicos, semelhantes aos encontrados em outras frutas¹¹. Devido à sua natureza gordurosa, atenção especial deve ser dada ao empregar qualquer método analítico para análise. Embora a análise de resíduos de pesticidas tenha sido realizada em abacates usando GC-MS em alguns casos 8,12,13,14,15,16,17,18,19,20, ela tem sido relativamente menos frequente em comparação com outras matrizes. Na maioria dos casos, uma versão do método Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) foi aplicada 8,12,13,14,15,16,17,18. Nenhum desses estudos investigou a consistência dos MEs entre diferentes variedades de abacate.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a consistência de MEs e valores de recuperação para 45 pesticidas representativos em diferentes variedades de abacate (ou seja, Criollo, Hass e Lorena) usando o método QuEChERS com formiato de amônio e GC-MS/MS. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que esse tipo de estudo é realizado em amostras de matriz gordurosa.

1. Preparação do estoque e soluções de trabalho

NOTA: Por razões de segurança, é aconselhável usar luvas de nitrilo, jaleco de laboratório e óculos de segurança durante todo o protocolo.

1. Preparar soluções-mãe individuais de cada um dos 45 padrões de pesticidas comerciais (ver Tabela de Materiais) a aproximadamente 1.000 mg/L em acetonitrila em balões volumétricos de 10 mL.
2. Combinar as soluções-mãe individuais acima referidas para preparar uma solução-mãe de 400 mg/l em acetonitrilo num balão volumétrico de 25 ml.
   NOTA: Esta solução mista será utilizada para preparar as soluções de trabalho para experimentos de recuperação e calibração.
3. Preparar soluções-mãe de atrazina-d₅ e fosfato de trifenilo (TPP) nas concentrações de 750 mg/L e 1.050 mg/L, respectivamente, em acetonitrilo em balões volumétricos de 10 ml. Utilize atrazina-d₅ como padrão interno de procedimento (P-IS) e TPP como padrão interno de injeção (I-IS).
   NOTA: O cenário ideal envolveria a utilização de um padrão interno marcado isotopicamente para cada analito alvo específico.
4. Preparar soluções de recuperação de unidades populacionais em acetonitrilo contendo 0,05% (v/v) de ácido fórmico (para evitar a degradação) em frascos volumétricos de 10 ml para obter 10, 100 e 400 μg/kg de equivalentes de amostra para os pesticidas e 200 μg/kg para o P-IS separadamente. Armazene essas soluções em frascos de vidro âmbar no escuro a -20 ° C.
5. Prepare as soluções de calibração dos pesticidas e P-IS juntos em acetonitrila com 0,05% (v / v) de ácido fórmico em frascos volumétricos de 10 mL para produzir 5, 10, 25, 75, 200, 400 e 600 μg / kg e 200 ng / ng, respectivamente, e armazene-os em frascos de vidro âmbar no escuro a -20 ° C.
   NOTA: As mesmas soluções podem ser utilizadas durante todo o trabalho experimental, mas é essencial armazená-las nas condições especificadas imediatamente após cada uso.
6. Prepare uma mistura de protetores de analito contendo 100 g / L de 3-etoxi-1,2-propanodiol, 10 g / L de ácido L-gulônico γ-lactona, 10 g / L de D-sorbitol e 5 g / L de ácido chiquímico em uma proporção de 4/1 (v / v) de acetonitrila para água com 0,5% (v / v) de ácido fórmico.
   NOTA: Esta mistura de protetores de analitos deve ser adicionada imediatamente antes da injeção para mitigar a EM.

2. Coleta de amostras

1. Colete amostras de três espécies de abacate (por exemplo, Criollo, Hass e Lorena) disponíveis em supermercados. Assegurar que cada amostra pesa cerca de 1 kg, o que é suficiente para a realização de todos os estudos subsequentes e está em conformidade com a Diretiva 2002/63/CE²¹.
   NOTA: As amostras orgânicas foram selecionadas preferencialmente para minimizar a probabilidade da presença de resíduos de pesticidas.
2. Transporte as amostras de abacate coletadas para o laboratório e homogeneize-as individualmente sem o tubo usando um picador (consulte a Tabela de Materiais). Armazenar as amostras homogeneizadas em recipientes de vidro âmbar a 4 °C até à análise.
   NOTA: As mesmas amostras de abacate serão usadas durante todo o estudo. Portanto, é crucial armazená-los nas condições especificadas imediatamente após cada uso.

3. Preparação de amostras utilizando o método QuEChERS com formiato de amônio

NOTA: A Figura 1 ilustra uma representação esquemática do método QuEChERS com formato de amónio.

1. Pese 5 g de cada amostra de abacate em um tubo de centrífuga de 50 mL (consulte a Tabela de Materiais).
2. Adicionar 50 μL da solução P-IS para obter uma concentração de 200 μg/kg. Para avaliação da recuperação, adicione também as soluções de pesticidas preparadas na etapa 1.4 para produzir concentrações de 10, 100 e 400 μg/kg (n = 5 cada).
3. Vortex o tubo por 30 s para garantir a integração completa do pico na amostra.
4. Adicione 10 mL de acetonitrila ao tubo da centrífuga. Agite o tubo a 70 rpm por 5 min.
5. Adicione 2,5 g de formiato de amônio, agite o tubo novamente a 70 rpm por 5 min e, em seguida, centrifugue-o a 1.800 × g por 5 min.
6. Em um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 150 mg de MgSO₄ anidro, 50 mg de amina primária-secundária (PSA), 50 mg de octadecilsilano (C₁₈), 10 mg de negro de fumo grafitizado (GCB) e 60 mg de um sorvente à base de óxido de zircônio Z-Sep +, adicione 1 mL do extrato para purificação utilizando extração em fase sólida dispersiva (d-SPE). Vortex o tubo por 30 s e centrifugue-o a 1.800 × g por 5 min.
7. Transferir 200 μl do extracto para um frasco para injectáveis com amostrador automático, adicionar 20 μl da solução protectora da substância a analisar preparada no passo 1.6 e incluir 50 μl da solução TPP.
8. Realize a análise instrumental usando um sistema GC-MS/MS (consulte a seção 4).
9. Efectuar a calibração pareada com a matriz seguindo o mesmo procedimento acima descrito, utilizando extractos em branco, excepto, durante a etapa d-SPE (passo 3.6), limpar 5 ml do sobrenadante em tubos de 15 ml. Adicione as soluções spike e P-IS na etapa 3.7. Adicione as soluções padrão de calibração aos frascos do amostrador automático para produzir 5, 10, 25, 50, 100, 200, 400 e 600 μg/kg, juntamente com o TPP, resultando em um volume final de 270 μL.
   NOTA: No geral, certifique-se de construir curvas de calibração combinadas com a matriz para cada variedade de abacate mais as calibrações somente de acetonitrila.

4. Análise instrumental usando GC-MS/MS

1. Conduza as análises empregando um sistema GC-MS / MS com um triplo quadrupolo (TQ) equipado com uma interface de ionização de elétrons (−70 eV) e um amostrador automático (ver Tabela de Materiais).
2. Empregue uma coluna MS GC (ligação de sílica de 30 m de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm, espessura de filme de 0,25 μm) junto com hélio de pureza ultra-alta como gás de arraste a uma taxa de fluxo constante de 1,2 mL / min.
3. Verifique os seguintes parâmetros antes de prosseguir com a operação do equipamento:
   1. Certifique-se de que as pressões do gás estejam corretas: Hélio a 140 psi e Argônio a 65 psi.
   2. Verifique a condição do óleo da bomba rotativa para garantir que esteja claro e no nível apropriado.
   3. Certifique-se de que a seringa para injeção não apresenta obstruções causadas por injeções anteriores.
   4. Confirme se os frascos para injetáveis de lavagem contêm um volume suficiente de cada solvente.
   5. Verifique se o contador de consumíveis (septo, revestimento) não atingiu seu limite.
4. Ligue o interruptor GC principal localizado no painel frontal e ligue o interruptor MS localizado na parte traseira.
5. Abra o software GCMS Real Time Analysis que controla todos os parâmetros do sistema GC-MS/MS.
   NOTA: O sistema do instrumento inclui o software GCMS Real Time Analysis por padrão.
6. Clique em Controle de Vácuo | Avançado | Bomba rotativa 1 para iniciar o sistema de vácuo.
   NOTA: Nesta janela, monitore a pressão para determinar os valores ideais de vácuo, que devem ser inferiores a 9.0 Pa. Levará aproximadamente 12 h.
7. Clique em Iniciar para ligar a bomba turbo molecular 1 e a bomba turbo molecular 2.
8. Clique em Iniciar para a opção Aquecedor de fonte de íons .
   NOTA: Após um tempo recomendado de 1 h, verifique o vácuo do sistema para confirmar se o valor recomendado é inferior a 1.6e-3 Pa.
9. Defina a temperatura da interface MS para 250 °C e a temperatura da fonte de íons para 300 °C.
10. Mantenha o forno GC a uma temperatura inicial de 50 °C por 1 min e, em seguida, aumente para 180 °C a uma taxa de 25 °C/min. Em seguida, aumentar a temperatura para 230 °C a 5 °C/min e depois para 290 °C a 25 °C/min. Por fim, mantenha a temperatura constante a 290 °C por 6 min. O tempo total de análise é de 24,6 min.
11. Clique em Fechar quando todos esses sistemas estiverem ligados.
12. Clique na opção Tuning do software de análise e clique em Peak Monitor View para realizar uma verificação inicial das condições do espectrômetro de massa.
    NOTA: Se necessário, execute o ajuste automático.
13. Clique em Aquisição e, na janela exibida, clique em Baixar parâmetros iniciais. Verifique se o equipamento está pronto GC e pronto MS.

5. Aquisição de dados

1. Clique em Novo arquivo de lote do software e crie uma sequência contendo informações como nome da amostra, ID da amostra, arquivo de método, arquivo de dados, volume de injeção e arquivo de ajuste. Adicione linhas conforme necessário e clique em Salvar.
2. Clique em Batch Start e deixe o processo de injeção começar.
3. Efectuar a injecção a 250 °C no modo splitless, mantendo um volume de injecção de 1 μL. Após 1 minuto após a injeção, abra a divisão.
   NOTA: Entre as injeções, certifique-se de limpar a seringa de 10 μL com metanol, acetato de etila e acetonitrila, usando um único enxágue com cada solvente. Todas as injeções são realizadas em triplicata.
4. Analise os analitos usando o modo de monitoramento de reação múltipla (MRM), que é o modo padrão empregado em sistemas MS/MS com um TQ.
   NOTA: A Tabela 1 fornece os tempos de retenção (em min) e as transições do quantificador e do qualificador para os pesticidas multiclasse, P-IS e I-IS. A análise quantitativa baseia-se na razão entre a área de pico do íon de quantificação e o íon P-IS. O I-IS é empregado para controle de qualidade durante a injeção. O Arquivo Suplementar 1 contém cromatogramas para todos os 45 pesticidas analisados.
5. Abra o software de análise de pós-execução para análise de dados.
   NOTA: O sistema de instrumentos inclui o software GCMS Postrun Analysis por padrão.
6. Clique na injeção a ser analisada, navegue pela tabela que contém os analitos e selecione o pico de interesse.
7. Clique no pico ou na região de interesse para visualizar o cromatograma. Revise as integrações de pico e, se necessário, execute a integração manual. Verificar as áreas de todas as substâncias a analisar para efectuar os cálculos necessários e a avaliação do método.

A validação abrangente do método analítico foi conduzida de acordo com as diretrizes SANTE/11312/20216, abrangendo avaliações de linearidade, ME, recuperação e repetibilidade.

Para a avaliação da linearidade, curvas de calibração pareadas com matrizes foram construídas usando amostras em branco enriquecidas em vários níveis de concentração (variando de 5 a 600 μg/kg). Os coeficientes de determinação (R2) para a maioria dos agrotóxicos selecionados foram maiores ou iguais a 0,99, indicando uma relação altamente linear entre concentração e resposta. Optou-se pelo menor nível de calibração (LCL) de 5 μg/kg, respeitando o limite máximo de resíduos (LMR) estabelecido de 10 μg/kg para fins de monitoramento de alimentos22.

Para avaliar a EM, as inclinações das curvas de calibração dos pesticidas multiclasse foram comparadas entre as condições de calibração de solvente puro e matricial. Como exemplo ilustrativo, a Figura 2 mostra a comparação das curvas no solvente e em cada uma das três matrizes para o carbofurano A EM foi calculada usando a equação (1)7, produzindo porcentagens que significam aumento de sinal (porcentagens positivas) ou supressão de sinal (porcentagens negativas).

Efeito matriz (%) = (1)

O sistema de classificação EM apresentado, baseado em faixas percentuais, fornece informações sobre o impacto da matriz nos sinais de pesticidas, auxiliando na interpretação dos achados analíticos. Em todos os casos para carbofurano, obteve-se EM positiva superior a 20%. No entanto, os resultados da geração de curvas de calibração pareadas com a matriz revelaram uma EM relativamente consistente de menos de 20% (classificada como ME suave) para a maioria das combinações de pesticidas/variedades (ver Tabela 2 e Figura 3).

Para avaliar a precisão e repetibilidade da análise, amostras em branco foram enriquecidas com pesticidas em três níveis de concentração diferentes (10, 100 e 400 μg/kg; n = 5 para cada concentração). Os resultados da Figura 4 demonstram a contagem de pesticidas cujas porcentagens médias de recuperação estavam dentro da faixa aceitável de 70-120% para cada tipo de abacate. Além disso, a Tabela 3 apresenta dados detalhados para todos os valores específicos obtidos. Uma proporção significativa dos pesticidas testados apresentou percentuais de recuperação dentro da faixa específica, com valores de desvio padrão relativo (RSD) abaixo de 20%.

Figura 1: Representação esquemática do método QuEChERS com formiato de amônio empregado para a extração de resíduos de pesticidas de amostras de abacate. Abreviaturas: QuEChERS = Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe; IS = padrão interno; PSA = amina primária-secundária; GCB = negro de fumo grafitado; CQ = controle de qualidade; GC-MS/MS = cromatografia gasosa-espectrometria de massa em tandem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Comparação das curvas de calibração no solvente e nas matrizes para o carbofurano. Solvente: y = 0,0028x - 0,0054 e R2 = 0,9974; Crioulo: y = 0,0050x + 0,0050, R2 = 0,9994 e ME = 80%; Hass: y = 0,0037x - 0,0109, R2 = 0,9977 e ME = 30%; Lorena: y = 0,0041x + 0,0053, R2 = 0,9998 e ME = 42%. Abreviaturas: ME = efeito matricial; P-IS = padrão interno de procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Número de pesticidas selecionados categorizados por suas respectivas faixas de EM para variedades de abacate. A classificação da EM é baseada em três categorias: suave (valores entre −20% e 20%), médio (valores variando entre −20% e −50% ou entre 20% e 50%) e forte (valores superiores a 50% ou abaixo de −50%). Abreviatura: ME = efeito de matriz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: O número de pesticidas que estão fora e dentro da faixa de recuperação aceitável aumentou em 10, 100 e 400 μg / kg (n = 15) nas três variedades de abacate. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tempos de retenção, quantificadores e transições de qualificadores utilizados nas análises de GC-MS/MS dos pesticidas selecionados, juntamente com o P-IS e o I-IS. Abreviaturas: P-IS = padrão interno de procedimento; I-IS = padrão interno de injecção; GC-MS/MS = cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas em tandem; HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = fosfato de trifenilo; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Valores de efeito matricial (%) para os pesticidas selecionados em diferentes variedades de abacate durante a validação do método analítico final. Abreviaturas: HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = fosfato de trifenilo; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Valores de recuperação e seus correspondentes RSDs entre parênteses (n = 5 em cada nível de pico), ambos em %, para os pesticidas selecionados em diferentes variedades de abacate durante a validação do método analítico final. Abreviaturas: RSDs = desvios padrão relativos; HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = fosfato de trifenilo; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Espectros espectrométricos de massa de todos os pesticidas. Abreviaturas: HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.